Mitofagia, el proceso de claro dañaado las mitocondrias, es necesario para el mantenimiento de la homeostasis y salud mitocondrial. Este artículo presenta algunas de la mitofagia últimos métodos de detección en células humanas, Caenorhabditis elegansy los ratones.
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Artículo de método
In Vitro e In Vivo la detección de la mitofagia en células humanas, C. Elegansy los ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
Las mitocondrias son las centrales de las células y producen energía celular en forma de ATP. La disfunción mitocondrial contribuye al envejecimiento biológico y una amplia variedad de enfermedades incluyendo enfermedades metabólicas, síndromes de envejecimiento prematuro y las enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA) y enfermedad de Parkinson (EP). Mantenimiento de la salud mitocondrial depende de la Biogénesis mitocondrial y la liquidación eficiente de las mitocondrias disfuncionales a través de mitofagia. Métodos experimentales para detectar con precisión la autofagia/mitofagia, especialmente en modelos animales, han sido un desafío para desarrollar. Recientes avances hacia la comprensión de los mecanismos moleculares de la mitofagia ha permitido el desarrollo de técnicas de detección de mitofagia novela. Aquí, presentamos varias técnicas versátiles para monitorear la mitofagia en células humanas, Caenorhabditis elegans (p. ej., Rosella y DCT-1 / IgG-1) y ratones (mt-Keima). Una combinación de estas técnicas de detección de mitofagia, incluyendo la evaluación de la especie, mejorará la precisión de las mediciones de la mitofagia y conducir a una mejor comprensión del papel de la mitofagia en salud y enfermedad.
Introducción
Mitofagia es esencial para el mantenimiento mitocondrial. Las mitocondrias entrecruzan múltiples vías de señalización de la célula y son organelos subcelular universales responsables de la producción de energía celular, metabolismo celular y calcio homeostasis1,2,3, 4. las mitocondrias constantemente enfrentan desafíos de fuentes endógenas y exógenas, como las especies reactivas del oxígeno (ROS) y tóxicos mitocondriales, respectivamente, que conducen a la generación de las mitocondrias disfuncionales y "envejecidas". Acumulación de mitocond....
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Protocolo
Animales (ratones machos y hembras) fueron nacidos y criados en un Animalario acreditado, en conformidad y aprobación del Comité de uso y cuidado de animales de NIH. Métodos de eutanasia deben ser coherentes con las regulaciones nacionales e institucionales.
1. detección de la mitofagia en células humanas
- Detección de mitofagia usando mt-Keima plásmido
Nota: La proteína de Keima, fusionada a una señal de destino de las mitocondrias, simplificada como mt-Keima, ha demostrado ser útil para la detección de mitofagia en vivo . MT-Keima es una proteína fluorescente sensible al pH radiométrica que exhibe flu....
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Resultados
Detección de la mitofagia en células humanas:
Utilizando el procedimiento presentado aquí, las células humanas HeLa fueron transfectadas con mt-Keima plásmido. Las células sanas demostraron una bien organizada red mitocondrial (GFP, 488 nm) con pocas incidencias de mitofagia (RFP, 561 nm). Sin embargo, las células pretratados con un uncoupler mitocondrial FCCP (30 μm por 3 h) exhibió un profundo aumento en incidencia de mitofagia (.......
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Discusión
Medición precisa de mitofagia técnicamente es exigente. Aquí, hemos presentado varias técnicas robustas que permiten ambos detección cualitativa de mitofagia y cuantificación de los niveles de la mitofagia en los modelos experimentales de laboratorio más comunes.
Para obtener datos reproducibles, es necesario un diseño experimental con al menos tres repeticiones biológicas. Todos los investigadores involucrados en la experimentación y análisis deben ser cegados a identidades de grupo experimen.......
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Divulgaciones
El laboratorio de Bohr tiene acuerdos CRADA con ChromaDex y GlaxoSmithKline.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Atsushi Miyawaki y Dr. Richard J. Youle para compartir el plásmido de Keima mt y mt-Keima integrado las células Hela. Agradecemos Raghavendra A. Shamanna y Dr. Deborah L. Croteau para la lectura crítica del manuscrito. Esta investigación fue apoyada por el programa de investigación intramuros de la NIH (VAB), Instituto Nacional sobre el envejecimiento, así como un 2014-2015 y 2016-2017 NIA intra-laboratorio conceden (EFF, VAB). EFF fue apoyado por HELSE SOR-OST RHF (proyecto n: 2017056) y el Consejo de investigación de Noruega (proyecto Nº: 262175).
CONTRIBUCIONES DEL AUTOR:
EFF diseñado el manusc....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| mt-Keima ratón | Jackson Laboratory | ||
| Lipofectamina 2000 reactivo de transfección de ADN | Thermofisher | #11668027 | |
| Medio Opti-MEM (Gibco) | Thermofisher | #31985062 | medio sin suero |
| plásmido mtKemia: pCHAC-mt-mKeima | addgene | #72342 | |
| COXII anticuerpo (ratón) | abcam | #ab110258 | |
| Anticuerpo LAMP2 (conejo | )NOVUS | ||
| cabra-anti-conejo con longitud de onda 568 nm de proteína fluorescente roja (RFP) | Thermofisher | #Z25306 | Alexa Fluor 568 colorante |
| cabra-anti-ratón con longitud de onda 488 nm de proteína verde fluorescente (GFP) | Thermofisher | #Z25002 | Alexa Fluor 488 colorante |
| prolonga el oro antidecoloración con DAPI | Invitrogen | #P36931 | |
| Placa de 6 pocillos | SIGMA Corning Costar | #CLS3516 | |
| portaobjetos de 4 pocillos | THermofisher, Nunc Lab-Tek | #171080 | |
| Nunc F placa de 96 pocillos | Thermofisher | #152038 | |
| Anticuerpo LC3B conejo | NOVUS | #NB100-2220 | |
| Anticuerpo de ADN | Progen Biotechnik | #anti de ratón de ADN monoclonal, AC-30-10 | |
| DAPI | Thermofisher | #D1306 | medio de montaje antidecoloración con DAPI |
| IN Analizador celular (lector fluorescente) | GE Healthcare Life Sciences | #IN Analizador celular 2200 | |
| Eclipse TE-2000e Microscopio confocal | Nikon | #TE-2000e | |
| Software de colocalización | Volocity | #Volocity 6.3 | software alternativo Zeiss ZEN 2012 |
| IN Cell Investigator Software | GE Healthcare Life Sciences | #28408974 | |
| medio de cultivo celular | Thermofisher | #DMEM– Dulbecco's Modified Eagle Medio | |
| (10,000 U/mL) | Thermofisher | #15140122 | |
| Suero Fetal Bovino | Sigma-Aldrich | #12003C-1000ML | |
| Incubadora de cultivo celular | Thermofisher | #Thermo Forma 3110 CO2 Incubadora | |
| Microscopio de epifluorescencia | Zeiss | Zeiss Axio Imager Z2 | |
| cámara | Olympus | Olympus DP71 | |
| microscopio confocal | Zeiss | Zeiss Axio Observer Z1 | |
| software confocal | Zeiss | ZEN 2012 | |
| software de análisis de imágenes | Image J | análisis de colocalización, etc | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| software de análisis estadístico | GraphPad Software Inc., San Diego, EE. UU. | Material del paquete de software GraphPad Prism | |
| para hacer una selección de gusano | Surepure Chemetals | #4655 | La púa está hecha de alambre de calibre 30 90% platino 10% iridio |
| IR: N2; Ex[pmyo-3 TOMM-20::Rosella] | Investigación material a Tavernarakis Nektarios | Mantener animales transgénicos a 20 ° C | |
| IR: N2; Ex[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1] | material a Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 TOMM-20::Rosella | Investigación material a Tavernarakis Nektarios | ||
| pdct-1 DCT-1::GFP | Investigación material a Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3 DsRed:: LGG-1 Consulta de | material a Tavernarakis Nektarios | ||
| Solución de paraquat | ver datos complementarios para la preparación | ||
| Tampón M9 | ver datos suplementarios para la preparación | ||
| Tampón M9-levamisol | ver datos suplementarios para la preparación | ||
| Portaobjetos y cubreobjetos de microscopio de vidrio | Fisher Scientific | #B9992000 | |
| Pinza quirúrgica | STERIS Animal Health | 19 Piezas Paquete de Esterilización Canina Economy | |
| Tijeras quirúrgicas | STERIS Animal Health | 19 Piezas Paquete de Esterilización Canina Economy | |
| 1x PBS | Thermofisher | #AM9625 | 10x PBS necesita diluirse a 1x PBS usando el agitador ddH2O |
| Fisher Scientific | #11-676-178 | Paquete de agitador de plataforma al aire libre pequeño orbital de sobremesa Thermo Scientific MaxQ HP Una | |
| almohadilla de agarosa al 2% | Ver datos complementarios para la preparación | ||
| Cuchillas Vibroslice | World precision instruments | #BLADES-2 | placa metálica de cuchilla de un solo filo |
| MSC | #78803988 | 0,012 pulgadas de espesor x 6 pulgadas de ancho x 12 pulgadas de largo, 430 Chapa de acero inoxidable | |
| Triton X-100 | detergente | ||
| Hidrato de dicloruro de viológeno de metilo | Sigma-Aldrich | #856177 | paraquat |
| Incubadora para nematodos | AQUALYTIC | Incubadora para mantener 20 ° C | |
| Microscopio estereoscópico de disección | Olympus | SMZ645 | |
| Microscopio confocal | Zeiss | AxioObserver Z1 | Para nematodos (paso 2) |
| microscopio de epifluorescencia | Zeiss | AxioImager Z2 | Para nematodos (paso 2) |
| Reticulante UV | Vilber Lourmat | BIO-LINK – BLX-E365 Fuente de | luz UV; 356 nm |
Referencias
- Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
- Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M. 3rd, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3)....
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Reimpresiones y permisos
