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Artículo de método

Asignación de genoma cromatina accesible en linfocitos T humanos primarios por ATAC-Seq

17.7K vistas

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DOI:

10.3791/56313

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13 de noviembre de 2017

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1The Mina and Everard Goodman Faculty of Life Sciences, Bar-Ilan University

En este artículo

Resumen

Ensayo para cromatina transposasa accesible junto con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq) es un método de genoma cromatina accesible de descubrir. Se trata de un protocolo de ATAC-seq paso a paso, desde el molecular al final análisis computacional, optimizado para los linfocitos humanos (Th1/Th2). Este protocolo puede ser adoptada por los investigadores sin experiencia previa en métodos de secuenciación de próxima generación.

Resumen

Ensayo de cromatina transposasa accesible con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq) es un método utilizado para la identificación de regiones (accesibles) abiertas de la cromatina. Estas regiones representan ADN elementos reguladores (por ejemplo, promotores, potenciadores, locus control regiones, aisladores) a que transcripción factores unen. Cartografía del paisaje de la cromatina accesible es un enfoque poderoso para descubrir elementos reguladores activos en todo el genoma. Esta información sirve como un enfoque imparcial para descubrir la red de factores de transcripción relevantes y mecanismos de la estructura de la cromatina que regulan programas de expresión génica. ATAC-seq es una alternativa robusta y sensible a la ADNasa I Análisis de hipersensibilidad junto con la secuenciación de próxima generación (DNasa-seq) y asistido por el formaldehído aislamiento de elementos reguladores (FAIRE-seq) para el análisis del genoma de la cromatina accesibilidad y a la secuenciación de sitios sensibles a la nucleasa micrococcal (MNase-seq) para determinar el posicionamiento del nucleosoma. Presentamos un protocolo detallado de ATAC-seq optimizado para humano inmune primario de las células por ejemplo CD4 + linfocitos (helper T 1 (Th1) y las células Th2). Este protocolo integral comienza con la cosecha de la célula, luego describe el procedimiento molecular de la cromatina tagmentation, preparación de muestras para secuenciación de próxima generación y también incluye métodos y consideraciones para el análisis computacional utilizado para interpretar los resultados. Además, para ahorrar tiempo y dinero, introducido medidas de control de calidad para evaluar la biblioteca ATAC-seq antes de la secuencia. Lo importante, los principios presentados en este protocolo permiten su adaptación a otros las células humanas inmunes y no inmunes primarios y líneas celulares. Estas pautas también será útiles para laboratorios que no son expertos en métodos de secuenciación de próxima generación.

Introducción

ATAC-seq1,2 es un método robusto que permite la identificación del regulador3 regiones de cromatina abierta y posicionamiento de nucleosoma. Esta información se aplica para inferir la ubicación, identidad y actividad de factores de transcripción. Sensibilidad del método para la medición de las variaciones cuantitativas en la estructura de la cromatina permite el estudio de la actividad de factores de la cromatina, remodeladores de cromatina y modificadores, así como la actividad transcripcional del RNA polimerasa II1. Así ATAC-seq proporciona un enfoque imparcial y poderoso para descifrar los mecanismos que rigen la regulación transcripcional en cualquier tipo de célula de interés. Se describe la adaptación de ATAC-seq a células Th1 y Th2 humanas primarias.

En ATAC-seq, hiperactiva Tn5 transposasa cargado con adaptadores para secuenciación de próxima generación (NGS) parejas fragmentación del ADN con el marcaje de ADN con adaptadores (es decir, el proceso de "tagmentation")1. Tras amplificación por PCR, las bibliotecas de ADN resultantes están listas para secuenciación de próxima generación (figura 1). El tagmentation preferencial de la cromatina accesible es detectado por el análisis del enriquecimiento local de Lee de la secuencia seq ATAC.

El procedimiento experimental corto y el requisito de menos material de partida, en comparación con otros métodos para medir la accesibilidad de la cromatina y posicionamiento nucleosomal como DNasa-seq4, FAIRE-seq5y MNase-seq6, ha promovió el uso de ATAC-seq en varios sistemas biológicos como células primarias humanas1,7 y8de las muestras clínicas, así como organismos unicelulares9, plantas10, moscas de la fruta11 y varios mamíferos12.

La identidad de la transcripción de factores que están limitados a lugares accesibles pueden ser descubiertos por analizar el enriquecimiento de sus motivos de secuencia de unión o combinación de ATAC-seq con inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) seguida de alto rendimiento (de secuenciación de ADN ChIP-seq). Este enfoque permitió la identificación de factores de transcripción específicos del linaje importantes de hematopoyesis en ratón13. El carácter imparcial y global de ATAC-seq permite estudiar la regulación de los genes en organismos que no están disponibles reactivos, tales como anticuerpos para el análisis de la viruta. Por ejemplo, variaciones evolutivas en cis-se han identificado regiones reguladoras mediante el estudio de las células de cresta neural craneal de los seres humanos y los chimpancés14, desarrollo variaciones en elementos reguladores durante temprano ratón embriogénesis de15, cambios en el panorama regulatorio durante un ciclo de vida de unicelulares owzarzaki C.9y la evolución de los promotores y potenciadores en mamíferos 20 especies12.

ATAC-seq también ha sido instrumental para la medición de accesibilidad de la cromatina en las células, así revela la variabilidad dentro de poblaciones celulares, que generalmente evade genoma estudios7,16. Además, ATAC-seq puede utilizarse para estudiar los cambios que se producen en regiones reguladoras de DNA en condiciones de enfermedad, en la cual las muestras son raras. Por ejemplo, ATAC-seq puede utilizarse para estudiar los cambios en el panorama regulatorio durante el inicio de la leucemia mieloide aguda (AML)17 o Ras-conducido de la oncogénesis11.

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Protocolo

todos los procedimientos fueron aprobados por la Junta de revisión institucional de la Universidad de Bar Ilan y el protocolo sigue pautas proporcionadas por el Comité de aprobación de los experimentos de.

1. purificación de ingenuo CD4 + las células humanas y polarización T Helper 1 (Th1) y las células Th2

Nota: aquí se describe el procedimiento a partir de las células mononucleares de sangre periférica humana congelada (PBMCs). El primer paso consiste en aislar las células CD4 + con microesferas y columnas que generalmente dan nosotros más del 95% de células CD4 +. Sin embargo, este paso puede variar según el protocolo recomendado: en cada laboratorio. El protocolo de activación de la célula T y la polarización fue modificado de Jenner et al. (2009) 18. aislamiento de CD4 + células de 10 millones de PBMCs de da lugar a 4 millones de células CD4 +. Se divide en dos matraces y cultivadas en Th1 y polarización Th2 condiciones rendimiento 3 millones células Th1 y Th2 en sólo una semana.

Nota: enfriar el centrifugar a 4 ° C antes de empezar.

  1. ML 1 descongelar de PBMCs humanos (10 7 células) en un tubo de 50 mL que contiene 10 mL de Medio RPMI suplementado con 1% de penicilina-estreptomicina, 2 mM L-glutamina y 10% suero bovino fetal inactivado por calor. Centrifugar a 500 x g por 5 min, retirar el sobrenadante y resuspender las células con una pipeta estéril 25 mL en 15 mL de Medio RPMI suplementado. Transferencia de las células (con una pipeta de 25 mL estéril) a un matraz de cultivo T75.
  2. Deja las células durante la noche en una incubadora humidificada (37 ° C, 5% CO 2).
  3. Transferir las células flotantes con una pipeta 25 mL estéril para tubo de 50 mL. Determinar el numero de celular y viabilidad por exclusión del azul tripán.
  4. Aislar CD4 + células de 10 millones vive no adherente PBMCs por selección positiva con CD4 + microesferas y columnas según el fabricante ' recomendaciones de s (véase Tabla de materiales y equipos) con las siguientes modificaciones: 10 7 PBMCs están marcados con 30 μl de microesferas de CD4 en 120 μl de 0.5% de BSA en PBS.
  5. Activan las células T CD4 + 72 h de rhIL-2 (10 ng/mL), enlazado a la placa anti-CD3 (5 μg/mL) y anti-CD28 soluble (2 μg/mL). Para la polarización Th1, añadir rhIL-12 (20 ng/mL) y anti-IL-4 (10 μg/mL). Para la polarización Th2, añadir rhIL-4 (40 ng/mL) y anti-IFN-γ (10 μg/mL).
  6. Las células de la cultura para otros 7 días en presencia de rhIL-2 (10 ng/mL) y las mismas citoquinas polarizantes (rhIL-12 de Th1 y Th2 rhIL-4).

2. Aislamiento de núcleos

Nota: ATAC-seq se realiza con núcleos intactos. Lysis buffer que contiene 0,05% nonylphenyl polietilenglicol (véase Tabla de materiales y equipos) se calibró para aislar los núcleos de las células humanas primarias de la Th1 y Th2. Recomendamos este paso con las células y reactivos de laboratorio de calibración. Un exceso de células intactas de detergente insuficiente disminuye la eficiencia de la reacción de transposición. Eficacia de lisis de la célula es determinada por el número de núcleos (las células positivas trypan azul) con respecto al número total de células.
Nota: Preparar el tampón de lisis (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM de NaCl, 3 mM MgCl 2). Enfriar una centrífuga con un rotor de columpio-cubo a 4 ° C. las células en una centrifugadora de swing-cubo en lugar de una centrífuga de ángulo fijo de granulación reduce la pérdida de núcleos de célula. Para evitar los núcleos o pérdida de la célula, pipetee cuidadosamente cuando descartando el sobrenadante.

  1. Agregar nonylphenyl fresco polietilenglicol (a una concentración final de 0.05%) y 100 x inhibidores de la proteasa (para una concentración final de 1 x) en el búfer de lisis fría inmediatamente antes del uso. Mantener el buffer en hielo.
  2. Las células de T de conteo para determinar su cantidad y viabilidad utilizando el método de azul tripán. Viabilidad que es menor que 90% de resultados en mayor digestión inespecífica.
  3. Transferencia de 0.5 x 10 6 T células (Th1 o Th2) en microtubos de 1.5 mL. Desactivación a 500 x g durante 5 min a 4 ° C.
  4. Resuspender el precipitado de células en 1 mL de frío con tampón fosfato (PBS) una solución salina. Desactivación a 500 x g durante 5 min a 4 ° C.
  5. Resuspender el precipitado de células en 1 mL de tampón de lisis frío (contiene polietilenglicol nonylphenyl e inhibidores de la proteasa). Mantenga el tubo en hielo. Pipeta suavemente para evitar distorsionar los núcleos.
  6. Tomar 10 μl y contar las células con un contador de células automatizado mientras el microtubo con las células sometidas a lisis en hielo rápidamente. Este paso no debe exceder de cinco minutos para evitar daños en los núcleos. Por lo menos el 80% de las células debe ser lisis.
  7. Continuar inmediatamente con la reacción de transposición. Mantener los núcleos dispuestos en el hielo.

3. Reacción de transposición

Nota: en este paso, núcleos aislados se incuban con procariótico Tn5 transposasa (TDE1) cargado con adaptadores para la secuencia de NGS. Hiperactiva Tn5 simultáneamente fragmentos de ADN y ligates adaptadores en regiones accesibles del genoma (proceso tagmentation). La relación entre núcleos y Tn5 transposasa es crítica para escote preferencial en cromatina accesible. Este protocolo está calibrado para 100.000 núcleos en un volumen de reacción de 100 μL. Sin embargo, la reacción puede ser reducida.

  1. Temperatura en una coctelera termal a 37 ° C.
  2. 100.000 transferencia de núcleos en un microtubo de 1.5 mL.
  3. Centrifugar a 500 x g por 10 min a 4 ° C y con cuidado quite el sobrenadante.
  4. Añadir los componentes de la reacción de transposición a los núcleos como especificado en la tabla 1.
  5. Resuspender mediante pipeteo suave.
  6. Incubar la reacción de transposición en una coctelera termal a 37 ° C por 30 min con suave agitación (500 rpm).
    Nota: Limpieza de ADN se realiza por inmovilización reversible fase sólida granos 19 (véase Tabla de materiales y equipos) o PCR purificación columnas. Al final de la limpieza, eluir los fragmentos de ADN en 20 μl de 10 mM Tris-HCl, pH 8. Evitar el EDTA en el tampón de elución.

4. Enriquecimiento de la polimerización en cadena de ATAC-seq bibliotecas

Nota: este paso se pretende amplificar los ATAC-seq biblioteca es decir, fragmentos de ADN con los adaptadores de insertado. Para permitir la mezcla de varias bibliotecas de ATAC-seq en el mismo carril de secuenciación de última generación (" multiplexación ") uso cartilla 1 (Ad1_noMx) 1 para todas las muestras y otra indexadas (con código de barras) cartilla 2 (Ad 2.1-2.24) 1 para cada muestra. Las secuencias de la cartilla se proporcionan en el suplido de Tabla de materiales y equipos.

  1. Amplificación PCR inicial
    Nota: la concentración de trabajo de la cartilla 1 (Ad1_noMx) y Primer 2 es 25 μm. Los cebadores se diluyen de la acción original de 100 μm a 25 μm. En todas las reacciones de polimerización en cadena, utilice la cartilla 1 (Ad1_noMx) y sólo uno de los 2 Primer indexadas.
    1. Agregar los componentes de la reacción de PCR como especificado en la tabla 2 a un tubo estéril de la PCR.
    2. PCR lugar tubo en un termociclador y realizar la amplificación por PCR utilizando el ciclismo condiciones detalladas en la tabla 3.
  2. Evaluación del número de ciclos de amplificación adicional
    Nota: el número de ciclos PCR adicionales debe producir una cantidad suficiente de biblioteca fragmentos fo una secuencia de generación exitosa ejecutar, mientras que reduce al mínimo para evitar GC y tamaño diagonal 20. La determinación del número de ciclos PCR (N) necesaria para la amplificación del fragmento de biblioteca óptima se realiza por PCR cuantitativa (qPCR).
    1. Diluir cartillas 1 (Ad1_noMx) y 2 (utilizado para la amplificación inicial de la biblioteca) de 25 μm a 6,25 μm.
    2. Añadir los componentes ópticos tubos PCR o una placa como se indica en el cuadro 4.
    3. En un instrumento de qPCR y ciclo especificado en tabla 5.
    4. Para estimar el número de ciclos de amplificación adicional (N), parcela número del ciclo en el eje x y la fluorescencia relativa (RFU) en el eje y.
      5. Ciclos de
    5. la cantidad de amplificación adicional (N) es 1/3 del número de ciclos en que la reacción de qPCR alcanzó la meseta. figura 2 proporciona ejemplos para tres bibliotecas de ATAC-seq que alcanzaron la meseta ~ 2.350 unidades de fluorescencia relativa, RFU (línea verde gruesa). El número de ciclos PCR en el cual se amplifica un tercio de la cantidad máxima (RFU 783, marcado en el eje y) corresponde a 8 ciclos de dos de las bibliotecas (curvas de amplificación de rojo y azul) y 9 ciclos PCR para la tercer biblioteca (rosa).
  3. Amplificación PCR final
    1. amplificar las restantes 45 μl de la reacción de PCR. Coloque un tubo PCR que contiene la reacción de amplificación del paso 4.1.2 en un termociclador. Ejecute el programa PCR descrito en la tabla 6. Utilice el número previamente determinado (paso 4.2.5) de ciclos de amplificación (N).

5. Tamaño de selección de bibliotecas de ATAC-Seq

Nota: en nuestra experiencia, selección del tamaño de bibliotecas de ATAC-seq amplificadas mejora resultados de secuenciación de próxima generación ya que elimina fragmentos de biblioteca de alto peso molecular de la Biblioteca de ATAC-seq final.
Nota: Deje que las bolas magnéticas a temperatura ambiente 30 minutos antes de su uso.
Preparar fresca 70% de etanol en agua libre de nucleasa.

  1. Suspender las bolas magnéticas mediante la mezcla de.
  2. Añadir agua libre de nucleasa a las bibliotecas de ATAC-seq (obtenidas en paso 4.3.1.) y llevar hasta 100 μl.
  3. Añadir 50 μl (0,5 x) de granos magnéticos resuspendidos de ADN a 100 μl del amplificado bibliotecas. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo por lo menos 10 veces. Incubar las muestras durante 5 minutos a temperatura ambiente. Si es necesario, girar rápidamente por los microtubos.
  4. Coloque el tubo sobre un soporte magnético apropiado durante 2 min separar las bolas magnéticas en el sobrenadante. Después de 2 min, transferir el sobrenadante a un microtubo nuevo.
  5. Medir el volumen del sobrenadante mediante pipeteo y añadir 0,7 x de bolas magnéticas. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo por lo menos 10 veces.
  6. Incubar 5 min a temperatura ambiente. Lugar en un soporte magnético para 2 minutos
  7. Incubación de después de los 2 minutos, descartar el sobrenadante. Añadir etanol al 70% 200 μL recién hechos para lavar los granos mientras que los tubos están en el soporte magnético.
  8. Mantener el microtubo en el imán durante 30 s y descartar entonces el etanol. Repita el paso 5.7.for dos lavados de etanol final.
  9. Eliminar completamente el resto de etanol y dejar que los granos deje secar al aire durante 5 minutos mientras que el tubo está en el imán. Si es necesario, girar brevemente el microtubo. Eliminar los restos de etanol con una pipeta p10.
  10. Quitar el microtubo del imán y agregar 22 μL de 10 mM Tris-HCl, pH 8. No eluir las bibliotecas ATAC-seq en tampón que contiene EDTA.
  11. Incubar los tubos durante 2 min a temperatura ambiente y luego coloque en el soporte magnético.
  12. Cuando la solución esté clara, transferir μl 20 bibliotecas eluídas a un nuevo microtubo estéril.
  13. Tienda el tamaño seleccionado bibliotecas ATAC-seq-20 ° C.

6. Análisis de la calidad de las bibliotecas de ATAC-Seq

  1. validación de la calidad de las bibliotecas ATAC-seq por PCR en tiempo real
    Nota: es importante evaluar la relación señal a ruido de las bibliotecas de ATAC-seq antes de próxima generación secuencia. Esto se hace mediante la determinación de la cantidad relativa de fragmentos de ADN de loci accesibles e inaccesibles mediante PCR cuantitativa (qPCR). Los lugares inaccesibles (control negativo, chr1:48, 137, 860-48,137,934 y chr1:193, 093, 748-193,093,827) son amplificadas por pares de la cartilla 1 y 2. Los loci accesibles (control positivo, chr19:30, 336, 166-30,336,253 y chr19:11546154-11546237) son amplificadas por pares cartilla 3 y 4. Loci positivos y negativos se definieron perfiles de accesibilidad (DHS-seq) de la cromatina de células CD4 + humanas (ENCODE accesiones ENCSR000EQE y ENCSR000EQG). Primer negativo 1 está situado en una región intergénica heterochromatic grande (230 kb de TRADB2 y 88 kb de FOXD2). Control negativo región 2 está en el primer intrón del gen CDC73. Positivo primer par 3 es dentro de una región de cromatina abierta corriente abajo del gen ciclina E (CCNE1) mientras par primer positivo 4 se centra en el promotor de la proteína quinasa C sustrato 80K-H (PRKCSH). Lo importante, estos loci de control muestran un patrón similar de la accesibilidad en otros tipos de células humanas del proyecto ENCODE 3, sugiriendo que pueden ser aplicados para monitorear ATAC-seq bibliotecas de un amplio espectro de tipos de células humanas. Primer eficiencia y especificidad de todos los pares de la cartilla fue verificado por qPCR en una dilución seriada de la DNA genomic (a partir de células humanas de la Th) y un análisis de curva de fusión de productos amplificados obtenidos.
    1. Aislar ADN genómico utilizando comercialmente disponible kit (véase Tabla de materiales y equipos).
    2. Diluir la ATAC-seq amplificado biblioteca 1:10 (1 μl librería + 9 μl de agua libre de nucleasas) y el ADN genómico a ~ 5 ng/μl.
    3. Preparar la mezcla de reacción (Tabla 7) para cada par de la cartilla de control positivo y negativo, teniendo en cuenta que las reacciones se llevan a cabo por triplicado.
    4. Incubar en qPCR termociclador según el protocolo recomendado por qPCR master mix proveedor.
    5. Analizar los resultados en qPCR instrumento ' software de s (véase Tabla de materiales y equipos). Elegir el ADN genómico como una muestra de control. Los valores obtenidos representan un enriquecimiento de las regiones accesibles (amplificados por cartillas de control positivo). Un ejemplo se muestra en la Tabla 8.
      Nota: Estimación del tamaño de la biblioteca media y concentración: la distribución de tamaño de fragmentos de ADN de ATAC-seq bibliotecas está determinada por sistemas de electroforesis automatizada de alta sensibilidad según el fabricante ' instrucciones. Es aconsejable medir la concentración de la muestra en un fluorómetro usando dsDNA kit de alta sensibilidad y por lo menos 2 μl de cada muestra de ADN.
      Nota: Secuenciación de próxima generación - antes de las bibliotecas de la multiplexación, calcular la molaridad de cada biblioteca de ATAC-seq utilizando la fórmula: (ng/μl x 10 6) / (660 x media biblioteca fragmento de longitud). Busca > Lee 30 millones de cada biblioteca de ATAC-seq para evaluar la cromatina abierta regiones de muestras humanas. Si desea determinar si la biblioteca es suficiente para la secuencia de NGS, inicialmente como objetivo Lee 10 millones (5% de la línea de la secuencia en instrumento de secuenciación de DNA en modo carrera rápido). Tenga en cuenta que para deducir nucleosoma posicionamiento, secuencia final emparejado es necesario 1.

7. Análisis de los resultados de secuenciación de próxima generación obtenidos

  1. deducir la calidad de las lecturas de secuenciación mediante la inspección de los archivos FastQC, por separado para cada biblioteca.
  2. Alinee la lee al genoma humano de referencia (hg19 Asamblea) utilizando Bowtie 21 software en el entorno Unix/Linux. El comando es ' pajarita -m 1 - q -S genoma directorio reads.fastq output_aligned.sam '. Directorio de genoma representa la carpeta donde se almacenan los índices de genoma de corbatín. El parámetro -m 1 es para no permitir que la alineación de Lee a más de un lugar geométrico en genoma, - q es para el archivo de entrada que debe estar en formato fastq -S es para la salida que está en formato SAM.
  3. Quitar duplicado Lee con SAMtools 22 rmdup opción en el entorno Unix/Linux. Los comandos son ' samtools ve output_aligned.sam -b -S | samtools tipo -o-output_aligned > output_aligned.bam ',
    samtools rmdup -s output_aligned.bam output_aligned _rmdup.bam '. El primer comando, vista, cambia el formato de SAM en formato de BAM que entonces se ordena. La opción de rmdup se aplica sobre el archivo clasificado de BAM. Opcionalmente se puede ajustar la Lee para el sitio de inserción del transposón, como se describe en el papel original de ATAC-seq 1. Esto se hace usando BEDtools comandos 23 en el entorno Unix/Linux. Los comandos son ' bamToBed -i output_aligned _rmdup.bam > output_aligned _rmdup.bed ', ' shiftBed -i genoma de output_aligned _rmdup.bed -p 4 - m-5 - g > output_aligned _rmdup_adjusted.bed '. El primer comando, bamTobed, cambia el formato de la BAM en formato de cama que puede utilizarse para el comando shiftBed. El genoma es un archivo delimitado de ficha que contiene la longitud de cada cromosoma en el genoma. El archivo se agrega generalmente en el directorio BEDtools.
  4. Realizar llamadas de pico mediante el análisis basado en el modelo de ChIP-seq (MACS2) 24 software en el entorno Unix/Linux el archivo cambiado de puesto de la cama con los siguientes parámetros:--nomodel--extsize 75--cambio -30. Estos parámetros se utilizan para ajustar las lecturas para que el sitio de inserción del transposón está en el centro de cada secuencia de la lectura.

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Resultados

El resultado final de este protocolo es una biblioteca de ATAC-seq de típicamente 3-20 ng/μl. Cuando se ejecuta en un sistema de análisis de integridad de ADN (véase Tabla de materiales y equipos), muestran apariencia de escalera2 (Figura 3A). El tamaño promedio de fragmentos de ADN es típicamente ~ 450-530 bp.

Adecuado control de calidad de las bibliotecas d...

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Discusión

El protocolo de ATAC-seq descrito aquí se ha empleado con éxito para el análisis de la cromatina accesible en células primarias (humano Th1, Th2 células y células B) así como las líneas de cultivo de células (células de cáncer de mama humanas MCF10A y células de glioblastoma U261). Aplicación de ATAC-seq a otros tipos celulares puede requerir algunos optimización de protocolo, especialmente en el paso de lisis. Si la concentración de detergente no iónico es demasiado alta, puede haber un porcentaje mayor de contaminación...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo es apoyado por la Israel Science Foundation (grant 748/14), Marie Curie de integración otorga (CIG) - FP7-gente-20013-CIG-618763 y I-CORE programa de planificación y Comisión de presupuesto y el Israel Science Foundation beca nº 41/11.

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Materiales


Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de 50 mLLumitronLUM-CFT011500-PPuede ser de otros proveedores.
MicrotubosAxygen IncMCT-175-CPuede ser de otros proveedores.
Pipetas serológicas de 25 mLCorning Costar4489Puede ser de otros proveedores.
Matraz para cultivo de tejidosLumitronLUM-TCF-012-250-PPuede ser de otros proveedores.
Contador de células automatizado CountesInvitrogenC10227
NucleoSpin TissueMACHEREY-NAGEL740952.5
Células mononucleares de sangre periférica ( PBMC)ATCC  PCS&tímido; 800 y tímido; 011Puede ser de otros proveedores.
RPMI 1640 MediumBiological Industries01-103-1APuede ser de otros proveedores.
Solución de L-glutamina (200 mM)Industrias Biológicas03-020-1BPuede ser de otros proveedores.
Penicilina-estreptomicinaIndustrias Biológicas03-031-1BPuede ser de otros proveedores.
Suero fetal bovino (FBS),  Industriasbiológicas04-127-1Puede ser de otros proveedores.
MACS CD4 microperlas, humanoMiltenyi Biotec130-045-101
MACS Columnas MSMiltenyi Biotec130-042-201
Anti-humano CD4 FITCBiogems06121-50
Ratón IgG1 Control de isotipo FITCBiogems44212-50
Anti-humano CD3 (OKT3)Tonbo biosciences40-0037
Anti-humano CD28 SAFIREBiogemas10311-25
IL2 Humano RecombinantePeprotech200-02
IL4 Humano RecombinantePeprotech200-04
IL12 Humano Recombinante p70Peprotech200-12
In Vivo Ready Anti-Human IL-4 (MP4-25D2)Tonbo40-7048
LEAF  IFN-& gamma anti-humano purificado;BioLegend506513
NaCl, grado analíticoCarlo Erba479687Puede ser de otros proveedores.
Cloruro de magnesio, hexahidrato, grado de biología molecularCalbiochem442611Puede ser de otros proveedores.
EDTAMP Biomedicals800682Puede ser de otros proveedores.
Tris, ultra puro, 99.9% puroMP Biomedicals819620Puede ser de otros proveedores.
Alternativa a NP-40 (nonilfenil polietilenglicol)Calbiochem492016Puede ser de otros proveedores.
Inhibidores de la proteasaSigmaP2714este inhibidor de la proteasa es un polvo. Para hacer una solución 100 x diluida en 1 mL de agua de grado de biología molecular.
Perlas magnéticas de inmovilización inversa en fase sólida: Perlas AMPure XPBeckman63881
Kit de purificación PCRHyLabsEX-GP200Puede ser de otros proveedores.
Kit de preparación de la biblioteca de ADN Nextera (transposasa TDE1 y tampón TD)IlluminaFC-121-1030
NEBNext High-Fidelity 2 x PCR Master MixNew England BioLabsM0541
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master MixNew England BioLabsM0543
SYBR Green I InvitrogenS7585
  PCR en tiempo real CFX Connect  Detección  SystemBio-rad185-5200Puede ser de otros proveedores.
CFX Manager SoftwareBio-rad1845000
mezcla maestra para qPCR: iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-rad172-5124Puede ser de otros proveedores.
Fluorómetro Qubit 2.0InvitrogenQ32866
Qubit dsDNA HS Kit de ensayoInvitrogenQ32854
Imán para tubos eppendorfInvitrogen12321DPuede ser de otros proveedores.
Centrífuga de enfriamiento de cubo oscilante con los cubos para tubos falcon de 15 ml y tubos eppendorfThermo Scientific75004527Podría ser de otros proveedores. Es importante que tenga cubos para tubos eppendorf.
Termo-agitadorMRCPuede ser de otros proveedores.
Alta sensibilidad D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5584
Alta sensibilidad Reactivos D1000Agilent Technologies5067-5585
4200 Sistema TapeStationAgilent TechnologiesG2991AAPlataforma basada en cinta para electroforesis
Kit de ADN de alta sensibilidadAgilent Technologies5067-4626Reactivo para análisis TapeStation de alta sensibilidad
Nombre y secuencia
Ad1_noMX: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA
TCTACACTCGTCGGCAGCGTC
AGATGTG-3'IDT		Ad1-noMx: 5'-P5 secuencia-transposasa secuencia-3'Ad2.1_TAAGGCGA

TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.1_expected secuencia de índice leída: 5'-P7 secuencia-[secuencia índice]-secuencia de transposasa-3'Ad2.2_CGTACTAG
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
AT[CTAGTACG]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.2_expected secuencia de índice leída: 5'-P7 secuencia-[secuencia índice]-secuencia de transposasa-3'
Ad2.3_AGGCAGAA: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[TTCTGCCT]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.3_expected secuencia de lectura: 5'-P7 secuencia-[secuencia índice]-secuencia de transposasa-3'Ad2.4_TCCTGAGC
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
AT[GCTCAGGA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.4_expected secuencia de índice leída: 5'-P7 secuencia-[secuencia índice]-secuencia de transposasa-3'Ad2.5_GGACTCCT
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGGAGTCC]GTCTCGTGGG
CTCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.5_expected secuencia de índice leída: 5'-P7 secuencia-[secuencia índice]-secuencia transposasa-3'Ad2.6_TAGGCATG
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CATGCCTA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.6_expected secuencia de índice leída: 5'-P7 secuencia-[secuencia índice]-secuencia de transposasa-3'Ad2.7_CTCTCTAC
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[GTAGAGAG]GTCTCGTGGG
CTCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.7_expected secuencia de índice leída: 5'-P7 secuencia-[secuencia índice]-secuencia de transposasa-3'
Ad2.8_CAGAGAGG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CCTCTCTG]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.8_expected secuencia de lectura: 5'-P7 secuencia-[secuencia índice]-secuencia de transposasa-3'Ad2.9_GCTACGCT
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGCGTAGC]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.9_expected secuencia de índice leída: 5'-P7 secuencia-[secuencia índice]-secuencia de transposasa-3'Ad2.10_CGAGGCTG
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT[CAGCCTCG]GTCTCGTGG
GCTCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.10_expected secuencia de índice leída: 5'-P7 secuencia-[secuencia índice]-secuencia de transposasa-3'Ad2.11_AAGAGGCA
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT[TGCCTCTT]GTCTCGTGGG
CTCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.11_expected secuencia de índice leída: 5'-P7 secuencia-[secuencia índice]-secuencia de transposasa-3'Ad2.12_GTAGAGGA
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT[TCCTCTAC]GTCTCGTGGG
CTCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.12_expected secuencia de índice leída: 5'-P7 secuencia-[secuencia índice]-secuencia de transposasa-3'
Ad2.13_GTCGTGAT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[ATCACGAC]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.13_expected secuencia de lectura: 5'-P7 secuencia-[secuencia índice]-secuencia de transposasa-3'Ad2.14_ACCACTGT
: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[ACAGTGGT]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.14_expected secuencia de índice leída: 5'-P7 secuencia-[secuencia índice]-secuencia de transposasa-3'Ad2.15_TGGATCTG
: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CAGATCCA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.15_expected secuencia de índice leída: 5'-P7 secuencia-[secuencia índice]-secuencia transposasa-3'Ad2.16_CCGTTTGT
: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[ACAAACGG]GTCTCGTGGGC< br/> TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.16_expected secuencia de índice leída: 5'-P7 secuencia-[secuencia índice]-secuencia de transposasa-3'
  Ad2.17_TGCTGGGT: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[ACCCAGCA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.17_expected secuencia de lectura: 5'-P7 secuencia-[secuencia índice]-secuencia de transposasa-3'
  Ad2.18_GAGGGGTT: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AACCCCTC]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.18_expected secuencia de índice leída: 5'-P7 secuencia-[secuencia índice]-secuencia de transposasa-3'Ad2.19_AGGTTGGG
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CCCAACCT]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.19_expected secuencia de índice leída: 5'-P7 secuencia-[secuencia índice]-secuencia de transposasa-3'
  Ad2.20_GTGTGGTG: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[CACCACAC]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.20_expected secuencia de lectura: 5'-P7 secuencia-[secuencia índice]-secuencia de transposasa-3'
  Ad2.21_TGGGTTTC: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[GAAACCCA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.21_expected secuencia de índice leída: 5'-P7 secuencia-[secuencia índice]-secuencia de transposasa-3'Ad2.22_TGGTCACA
: 5'- CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[TGTGACCA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.22_expected secuencia de índice leída: 5'-P7 secuencia-[secuencia índice]-secuencia de transposasa-3'Ad2.23_TTGACCCT
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGGGTCAA]GTCTCGTGGGC
TCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.23_expected secuencia de índice leída: 5'-P7 secuencia-[secuencia índice]-secuencia transposasa-3'Ad2.24_CCACTCCT
: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
GAT[AGGAGTGG]GTCTCGTGGG
CTCGGAGATGT-3'IDT		Ad2.24_expected secuencia de índice leída: 5'-P7 secuencia-[secuencia índice]-secuencia de transposasa-3'F1
: 5'-CCTTTTTATTTGCCCATACACTC-3'IDT
R1: 5'-CCCAGATAGAAAGTTGGAGAGG-3'IDT
F2: 5'-TTGAGGGATGCCATAACAGTC-3'IDT
R2: 5'-CTGCTGAACAACATCCTTCAC-3'IDT
F3: 5'-GGTTTGCAGGTTGCGTTG-3'IDT
R3: 5'-AGAGGAATCTGGGAGTGACG-3'IDT
F4: 5'-TGCTCATTCCGTTTCCCTAC-3'IDT
R4: 5'-AGCCGGAAAGAAAGTTCCTG-3'IDT
de grado europeo purificadas del cebador: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG AT[TCGCCTTA]GTCTCGTGGGC

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