Méthodes pour le pH intracellulaire d’imagerie de la lignée de cellules souches de follicule en Live drosophile de tissu ovarien

Summary

Nous fournissons un protocole d’imagerie pH intracellulaire d’une lignée de cellules souches épithéliales en direct tissus ovariens de drosophile . Nous décrivons des méthodes pour générer des mouches transgéniques exprimant un biocapteur de pH, le mCherry::pHluorin, l’image le biocapteur utilisant l’imagerie par fluorescence quantitatives, générer des courbes standard et convertir les valeurs d’intensité de fluorescence aux valeurs de pH.

Abstract

Variations de pH intracellulaire (pHi) jouent un rôle important dans la régulation de nombreuses fonctions cellulaires, y compris le métabolisme, la prolifération et la différenciation. En général, pHi dynamique est déterminée dans des cellules cultivées, qui sont prêtent bien à mesurer et manipuler expérimentalement pHi. Cependant, le développement récent de nouveaux outils et de méthodologies a permis d’étudier pHi dynamique au sein de tissus intacts, vivre. Pour la recherche de la drosophile , une évolution importante a été la génération d’une lignée transgénique portant un biocapteur pHi, mCherry::pHluorin. Nous décrivons ici un protocole que nous utilisons régulièrement pour imagerie live Drosophila ovarioles pour mesurer pHi dans la lignée de cellules souches (FSC) épithéliales folliculaires dans mCherry::pHluorin transgénique de type sauvage lignes ; Cependant, les méthodes décrites ici peuvent être facilement adaptés pour les autres tissus, y compris les disques alaires et l’épithélium de le œil. Nous décrivons les techniques pour exprimer des mCherry::pHluorin dans la lignée de la FSC, maintien des tissus ovariens pendant direct imaging, acquisition et analyse d’images pour obtenir les valeurs de pHi.

Introduction

Études récentes ont révélé un rôle pour les modifications du pHi pendant cellulaire différenciation et dysplasie en vivo^1,2. Ces études ont montré que pHi est remarquablement constant dans les cellules du même type au même stade de différenciation, mais qu’il change à mesure que les cellules de transition d’un stade à l’autre. Dans certains cas, bloquant les changements pHi partiellement perturbe la différenciation, ce qui suggère que le changement du pHi n’est pas simplement une conséquence des changements dans le sort de la cellule mais contribue plutôt à promouvoir le changement dans le destin cellulaire, peut-être par le biais des effets sur la régulation pH sensibles les protéines ou les réactions chimiques nécessaires à la différenciation. Les études à venir sont susceptibles de révéler plus de perspicacité dans les nombreux différents rôles de pHi dynamics in vivo. Toutefois, l’un des défis d’étudier le pHi au cours de la différenciation in vivo est d’obtenir des mesures précises de pHi. Contrairement à d’autres caractéristiques de différenciation, comme les changements dans la morphologie cellulaire et l’expression des gènes, pHi est une propriété chimique labile de la cellule qui n’est pas conservée dans les cellules qui ont été fixés et perméabilisées avec des méthodes standard. En outre, pHi peut-être pas stable dans les cellules qui sont stressés ou de mourir à la suite de la manipulation expérimentale. Ainsi, il est important de garder les cellules vivant et en bonne santé que possible lors de la mesure de pHi. Plusieurs colorants vitaux sont disponibles que fonctionnent bien pour mesurer le pHi de cellules en culture³, mais dans de nombreux cas, ils ne sont pas appropriées pour in vivo études parce qu’ils ne pénètrent pas le tissu profondément ou uniformément assez pour fournir des mesures précises .

Pour contourner le problème de la pénétration du colorant pauvres, nous et autres avons utilisé une sonde génétiquement encodée, mCherry::pHluorin^4,5,6,7, qui peut être exprimé plus précisément dans la cellule types d’intérêt et imagés dans des tissus vivants. pHluorin est une variante de GFP avec un pKa plus élevé (~ 7.0 vs ~ 4.0) qui se plie plus facilement à des pH plus élevés ; Si l’intensité de fluorescence totale émise par une population de pHluorin molécules dans la cellule augmente avec le pHi⁸. Ce qui est important, la fluorescence est linéaire dans la plage normale cytosolique des valeurs de pHi. En revanche, la fluorescence de la mCherry (pKa ~ 4,5) est insensible aux variations de pH comprise entre cytosolique. Ces deux journalistes sont liées de façon covalente ensemble comme une seule protéine chimérique, codée par un cadre de lecture unique, donc ils sont toujours présents en quantités égales. Par conséquent, le ratio de pHluorin à l’intensité de la fluorescence mCherry fournit une mesure de pHi qui est normalisée à la concentration de sonde dans chaque cellule. Les ratios peuvent ensuite être convertis aux estimations des valeurs de pHi à l’aide d’une courbe d’étalonnage qui est générée en obtenant la pHluorin mCherry ratios de tissus qui ont été équilibrés à des valeurs de pH connus.

Nous décrivons ici les méthodes pour l’utilisation de mCherry::pHluorin pour mesurer le pHi de la lignée épithéliale de FSC dans l’ovaire de la drosophile . Ce tissu bien caractérisé a été utilisé pour modéliser les nombreux aspects de la biologie épithéliale, tels que les cellules souches autorenouvellement et différenciation^9,10,11, migration des cellules collectives¹² , le développement et la maintenance de la cellule polarité^13,14. L’épithélium folliculaire est produit par deux sociétés qui résident au bord antérieur du tissu dans une structure appelée le germarium^15,16. Ces cellules se divisent régulièrement au cours de l’âge adulte pour se renouveler et de produire des descendants, appelées cellules prefollicle (PFC), qui peuvent rentrer dans la niche et devenir une FSC ou se différencient en un des trois types de cellules différents follicule : cellules polaires, des cellules de tige, ou cellules de l’organisme principal de follicule. Nous avons démontré précédemment que dans les tissus de type sauvage, le pHi augmente progressivement durant les premiers stades de différenciation, d’un pHi environ 6.8 en FSC à 7,0 dans HPF, 7.3 en follicule cellules². Bloquer cette augmentation par ARNi précipitation d’un échangeur de sodium/proton ubiquitaire expresse, DNhe2, altère la différenciation pFC gravement, mais bien que pHi a augmenté la surexpression des DNhe2 entraîne une différenciation excès douce phénotype. Ces résultats démontrent que le pHi est solidement maintenu dans la lignée FSC au début et qu’il peut être expérimentalement augmente ou diminue en vivo. Les méthodes décrites ici peuvent servir à mesurer les pHi en tissu de type sauvage ou diverses formes de tissus mutants, y compris les Arni knockdown ou surexpression utilisant un Gal4 d’intérêt et des clones mitotiques.

Protocol

Remarque : pour mesurer pHi dans la lignée de la FSC, nous calculer le rapport des intensités de fluorescence de pHluorin à mCherry en FSC, les PFC et les cellules folliculaires dans les conditions physiologiques et convertir les rapports en valeurs de pHi à la norme courbes d’étalonnage pour chaque cellule de type ⁷. Tout d’abord, vivre des expériences d’imagerie sont réalisées pour mesurer les intensités de fluorescence des pHluorin et des mCherry en germaria disséqué dans une mémoire tampon contenant NaHCO ₃, qui imite les conditions physiologiques ^{1 , 7}. courbes suivant, standards sont générés par la mesure des intensités de fluorescence pHluorin et mCherry dans un ⁺ de Na-K ⁺ tampon contenant l’ionophore nigéricine libre, ajusté à deux valeurs de pH différents, 6,5 et 7,5. En présence de nigéricine, pHi s’équilibre avec le pH de la mémoire tampon à travers la membrane de plasma, causant pHi faire correspondre le pH extracellulaire. Enfin, les courbes d’étalonnage sont utilisés pour convertir les pHluorin mCherry ratios aux valeurs estimées pHi.

1. préliminaire : pHi de préparation avant la mesure In Vivo

Remarque : pour mesurer la pHi in vivo, le transgène mCherry::pHluorin doit être exprimé dans le type de cellules d’intérêt. Voici quelques moyens courants de générer pHluorin transgénique vole dans la lignée de la FSC. Générer des clones de mCherry::pHluorin est particulièrement utile pour l’identification des FSC, qui est situés sur le bord antérieur d’un clone FSC. Tissu mCherry::pHluorin spécifique expression est utile pour mesurer les pHi à travers le tissu entier et est également plus pratique pour combiner avec l’expression d’un Arni ou transgène.

1. Vole de la génération de transgénique pHluorin
   1. mCherry::pHluorin marqués FSC clones
      1. à faire des clones de mCherry::pHluorin FSC, cross SAMU-mCherry::pHluorin ¹ à une loi-Gal4 flipout stock ou autre stock avec un Gal4 inductible Flp/FRT.
      2. Pour faire des clones inductibles, b b F1s adultes pour 2 jours post eclosion en flacons vides pendant 1 h dans un bain d’eau de 37 ° C, quatre fois environ chaque 12 h.
      3. Pour assurer une croissance normale et un taux maximum de l’ovogenèse pendant cette période, maintenir les mouches en fournissant humides de levure fraîche (approximativement égales à sec baker ' eau et levure s) par jour pendant au moins 6 jours après l’induction de clone.
   2. Expression de tissus spécifiques mCherry::pHluorin
   3. Cross mCherry::pHluorin SAMU ¹ à un follicule cellule pilote spécifique, y ¹ w * ; P {GawB} 10930/CyO (Bloomington ID : 7023).
   4. 3 jours après le démarrage de mouches issues, collecter et placez-les dans des fioles contenant de la levure humide, pendant au moins 24 h avant la dissection.
2. Rendant les solutions
   Remarque : il est important de préparer les tampons suivants le jour de l’expérience, parce que les concentrations de pH et de soluté dans la mémoire tampon peuvent changer au fil du temps.
   1. Prepare des tampons bicarbonate, nigéricine et dissection. Ajoutez les composants dans l’ordre figurant pour éviter la formation de précipités (voir tableau 1, tableau 2 et tableau 3).

2. Trial : Mesure pHi dans la lignée de FCS

Remarque : la dissection, de montage et direct d’imagerie étapes pour le tampon bicarbonate et les deux conditions de tampon de nigéricine peuvent doivent être effectuées deux fois : une fois pour déterminer le microscope paramètres et une seconde fois pour recueillir des données expérimentales. Reportez-vous à la section 2.2 ci-dessous pour plus d’informations.

1. Montage et dissection
   Remarque : pour les matériaux nécessaires pour réaliser cette étape, veuillez vous reporter à la Figure 1 et Table des matières. Pour chambres de montage imprimé 3D, fichiers d’imprimante 3D sont fournies comme supplémentaire fichier 1 et 2 de fichier supplémentaire.
   1. Dissection :
      1. chambres montage Prepare en appliquant une fine couche de graisse sous vide sur le côté plat de la 3D imprimés salle de montage. Placez ce côté sur une lamelle de 22 x 40 mM pour sceller la lamelle à la chambre de montage.
   2. Disséquer les ovaires des femelles adultes mouches dans 500 µL de tampon de dissection (tampon bicarbonate ou nigéricine, tableau 3)
      1. anesthésier les mouches de 3-4 à l’aide de CO ₂ gaz et transfert vole sur un bloc de mouche perfusé avec CO ₂ gaz.
      2. Ramasser une mouche anesthésiée avec pince et placez dans le milieu de dissection.
      3. Pincer le thorax de la mouche avec un instrument, tout en tirant sur l’extrémité de son abdomen jusqu'à ce que ses ovaires affleurent.
      4. Après avoir détaché les ovaires des autres organes, distinguer les ovarioles aide 22 ^1/2 aiguilles de seringue. Soigneusement séparé du muscle gaine des ovaires et des ovarioles individuels séparés du cluster d’ovarioles. Une technique efficace pour isoler la gaine musculaire consiste à utiliser une aiguille de seringue pour tenir la grappe d’ovarioles en place à son extrémité antérieure et la course vers le bas le long du seul ovarioles.
      5. Incuber les ovaires disséqués dans les médias de dissection pendant exactement 10 minutes avant de procéder à l’étape de montage afin qu’il y a assez de temps pour le pHi de cellules de pleinement s’équilibrer avec le pH du milieu dissection nigéricine.
         Remarque : Assurez-vous que la gaine du muscle est prélevée les ovarioles. La gaine du muscle peut atténuer le signal de fluorescence, ce qui rend difficile l’identification des cellules individuelles à l’aide de concanaviline-A et peut causer des ovarioles se déplacer spontanément pendant direct imaging.
   3. Montage
      1. placer une petite goutte de géloses de dissection sur la lamelle de verre à l’intérieur de la salle de montage.
      2. Transfert séparés ovarioles avec une pincette.
      3. Séparer plus tard chambers d’oeufs de stade de germaria associé avec des chambres d’oeuf étape antérieures et faire en sorte que le germaria disséqué sont placés au centre de la goutte de médias de dissection.
      4. Ajouter deux petites gouttes de vernis à ongles aux côtés opposés d’une lamelle de 12 mm ronde et laissez-le sécher pendant environ 10 à l’air s.
      Lamelle de
      5. lieu le tour sur la chute des médias de dissection contenant séparé germaria telle que ce côté avec vernis à ongles pointe vers le bas et entre en contact avec les médias de la dissection. Appuyez sur les pièces du bord avec vernis à ongles à s’aplatir et de garantir la germaria en position. Nous recommandons l’utilisation de vernis à ongles plus âgés car il bave moins, sur la surface de la lamelle couvre-objet, tel qu’il est actuellement maintenu en place.
      6. Remplir la chambre de montage avec les médias de dissection supplémentaires. État tampon spécifique qui ne contient-elle pas de colorant de concanavaline-A peut être utilisé pour remplir la chambre de.
         NOTE : Le temps total passé à disséquer et montage ne doit pas dépasser 15 minutes. Ceci est important afin de minimiser les effets des lésions tissulaires et la mort des cellules.
2. Imagerie live :
   Remarque : dans cette étape, d’abord rassembler des images de la condition de bicarbonate et les deux conditions de nigéricine pour déterminer les paramètres appropriés de microscope, microscope ajustez-les si nécessaire, et puis recueillir les images pour les données expérimentales. Utiliser un microscope confocal capable d’imagerie dans 3 canaux : GFP (excitation/475 509 d’émission), mCherry (575 excitation/610 d’émission) et rouge sombre (633 excitation/647 emission).
   NOTE : Paramètres de Microscope : les intensités de pixels des images recueillies seront quantifiées pour déterminer les estimations de pHi, il est donc important que les valeurs d’intensité du signal dans chaque ensemble d’images n’est ni trop faible ni trop saturées. La gamme d’intensités qui peuvent être capturés dans une image est définie par le nombre de bits d’image. Dans de nombreux cas, images 8 bits sont générés par défaut, mais il est recommandé d’acquérir les données sous forme d’images 16 bits, qui ont une gamme dynamique plus large. Il est important de s’assurer que la diaphonie entre canaux fluorescent est réduite au minimum, donc les paramètres doivent être ajustées afin que le spectre d’émission prélevés chaque fluorophore ne se chevauche pas. Pour tester ces paramètres, prendre une image de l’échantillon en utilisant le spectre d’excitation de GFP et s’accumuler dans le spectre d’émission pour mCherry et vice versa. Si les paramètres ont été ajustés correctement, il ne faut aucun signal dans les deux cas. Définissez les paramètres de microscope (p. ex., réglages de tension sur un laser à balayage confocal, laser puissance et trou d’épingle taille) afin que les intensités de pixel du signal dans tous les ensembles de trois images sont dans la gamme dynamique du fichier image. Pour toutes nos expériences, nous avons utilisé une blanche lumière laser scanning microscope confocal avec un objectif 40 x pour acquérir des images 16 bits en format de 1 024 × 1 024, alors que nous avons optimisé le gain en tension pour chaque expérience selon les besoins. Par exemple, dans une expérience, nous avons mis le gain en tension de GFP, mCherry et rouge sombre que 37,8 %, 72,9 % et de 260 %, respectivement.
   1. Image ovarioles dans un tampon dissection nigéricine à pH 6,5 et ajuster les paramètres tels que les intensités de pixels des images pHluorin et mCherry sont faibles, mais pas en dessous de la limite de détection de la caméra.
   2. Image d’une autre série d’ovarioles dans un tampon dissection nigéricine à pH 7,5 et régler les paramètres de sorte que les intensités de pixels des images pHluorin et mCherry sont élevés, mais pas saturé.
   3. Image ovaires dans la dissection de bicarbonate tampon et faire en sorte que les intensités de pixels des images pHluorin et mCherry ne sont pas saturées avec les paramètres choisis. Si les pixels sont saturés, ajustez les paramètres si nécessaire.
      Remarque : Microscope de paramètres peuvent différer basé sur la configuration de microscope exact utilisée et doit être optimisé pour chaque expérience. Après ont défini les paramètres de microscope, ne changent pas leur jusqu'à la fin de l’expérience. Les paramètres doivent être conformes à travers le contrôle et les conditions expérimentales. Dans nos expériences de pHi initiale, nous avons généré des courbes d’étalonnage nigéricine point 2 et 3 et observé aucune différence significative entre le pHi calculée en utilisant les deux méthodes. Toutefois, en règle générale, l’ajout de plusieurs points de la courbe d’étalonnage devrait améliorer la précision. Nous recommandons donc de générer des courbes avec différents nombres de points afin de déterminer combien est nécessaires pour un ensemble donné de conditions expérimentales.
3. Collecte des données :
   1. effectuer la dissection, de montage et d’imagerie des échantillons dans les conditions de tampon bicarbonate et nigéricine. Après dissection et le montage, le temps maximal passé une série d’échantillons d’imagerie ne doit pas dépasser 45 min pour vérifier que les mesures d’intensité de fluorescence sont apportées dans les tissus vivants, en bonne santé.
   2. Pour chaque condition, acquisition d’images au moins 5 germaria.

3. Après le procès : Analyse d’Image

1. 1. fond des intensités de fluorescence mesure FSC, PFC, et cellules folliculaires soustraction :
      1. Open images à Fidji avec chaque canal dans une fenêtre séparée (en l’État la figure 4).
      2. Utiliser l’outil rectangle pour dessiner une zone d’intérêt (ROI) dans la fenêtre de canal de pHluorin dans une partie de l’image sans signal.
      3. Facultatif étape : définir la limite inférieure du seuil pour que les pixels dont les valeurs d’intensité inférieure à fond sont exclues et réglez la limite supérieure du seuil maximum. Lorsque le seuil est défini de cette manière, les zones de l’image sans signal sont pour la plupart en bleus et le signal est bien visible ( Figure 4 a).
      4. Mesure la moyenne intensité de fluorescence dans le retour sur investissement. Si le seuil a été défini à l’étape 3, assurez-vous de vérifier la " limite de seuil " boîte dans la boîte de dialogue définir les mesures.
      5. Soustraire l’intensité mesurée d’arrière-plan de chaque canal et la tranche de l’image en utilisant la fonction Subtract, dans le processus → menu Math.
      6. Répéter étapes 3.1.1.2-6 pour la fenêtre de canal mCherry sauf que, à l’étape 3.1.1.2, au lieu de dessiner un nouveau rectangle avec l’outil rectangle, utilisez la fonction de sélection de restauration, trouvé dans l’édition → menu de sélection, d’ajouter un rectangle avec les mêmes Dimensions et la position sur l’image.
   2. Identifier FSC, les PFC et les cellules folliculaires :
      1. identifier le FSC, les PFC et les cellules folliculaires de la morphologie et l’emplacement à l’aide de la coloration de la concanavaline A à trouver les limites de la cellule ( Figure 2).
      2. FSC est minces cellules triangulaires situés sur le bord de la germarium à la frontière de 2 a/2 b région. Si mCherry::pHluorin est exprimé en un clone FSC, FSC peut également être identifié comme la cellule plus antérieure du clone.
      3. PFC est des cellules de forme irrégulières en région 2 b, en aval du FSC et immédiatement adjacent à.
      4. Cellules folliculaires sont des cellules carrées ou en colonnes qui entourent le kyste de cellules germinales dans la région 3.
   3. Obtenir des rapport d’intensité de fluorescence
      1. choisir une ou plusieurs tranches dont la cellule d’intérêt a plus forte intensité de fluorescence dans le canal de mCherry et de s’assurer que la coloration de la concanavaline A, vu dans le canal rouge sombre, est dans le foc nous au sein de la tranche sélectionnée.
      2. ROI attirer autour de chaque FSC et mesure l’intensité de fluorescence moyenne de pHluorin et mCherry dans toutes les tranches choisie pour les mesures.
      3. Diviser l’intensité de fluorescence moyenne du canal pHluorin par l’intensité de fluorescence moyenne du canal mCherry à calculer un ratio de pHluorin à fluorescence mCherry.
2. PHi de dériver des valeurs et générer des images pseudocolored
   1. valeurs pHi Derive
      1. dans tous les cas, la courbe de régression linéaire doit être générée à l’aide d’ovaires de mouches du même génotype à la fois expérimentale et des conditions de contrôle. Générer une courbe de régression linéaire pour chaque type de cellule en utilisant les données de deux conditions de tampon de nigéricine ( Figure 3). Dans Excel, cela peut être fait en traçant les données sur un graphique et en ajoutant une courbe de tendance linéaire. Alternativement, voir :
      2. utiliser la pente et l’ordonnée à l’origine de la courbe de régression linéaire calculées à partir des conditions de nigéricine et l’équation d’une ligne (y = mx + b) pour convertir le pHluorin mCherry ratio valeurs calculée à partir des échantillons dans le bicarbonate condition aux valeurs de pH. Dans cette équation, substituer la forme de pente (l’ordonnée) pour b, mettre la valeur du ratio en x et résoudre pour y.
   2. Générer une image pseudocolored reflétant les valeurs de ratio à Fidji.
      1. Suivre la procédure ci-dessus pour la soustraction de l’arrière-plan (étape 3.1.1 et Figure 4).
      2. Diviser le canal pHluorin du canal mCherry à l’aide de la fonction calculatrice de l’Image, dans le menu de processus. N’oubliez pas le " nouvelle fenêtre créer " et " résultat 32 bits (float) " cases à cocher sont les deux joueurs checkent. Modifier la table de correspondance (LUT), trouvé dans le menu Image, thermique ou LUT de choix. Voir la Figure 4 pour les autres possibilités de passage.
      3. Dans la boîte de dialogue ajuster luminosité et contraste (Image → Adjust → luminosité/contraste), cliquez sur le " mis " bouton. Jeu Minimum affiche la valeur 0 et la valeur maximale affichée valeur un ratio qui capture le mieux les données, généralement de 1,0 à 2,0 ( Figure 5).

Representative Results

Ici, nous avons décrit le processus de mesure pHi dans l’épithélium folliculaire, qui implique plusieurs étapes. Tout d’abord, les ovaires sont disséqués de mouches du génotype approprié à l’aide des outils de dissection et de fixation (Figure 1). Les ovarioles sont imagés puis à l’aide de la microscopie en fluorescence quantitatives et les images sont analysés pour obtenir des mesures de pHi. Pour chaque image, les types de cellules d’intérêt sont identifiés comme décrit à la Section 3.1 (Figure 2). Le rapport entre les intensités de fluorescence dans les voies GFP et mCherry est converti en valeurs de pHi à l’aide d’une courbe d’étalonnage (Figure 3 a) tel que décrit à la Section 3.2. En utilisant cette méthode, nous avons constaté que pHi augmente avec la différenciation dans la lignée FSC précoce, de 6,8 à FSC, à 7,0 dans les cellules prefollicle, 7.3 dans les cellules folliculaires (Figure 3 b). Les valeurs de pHi de chaque type de cellule peuvent être représentées graphiquement, comme dans la Figure 3 b, ou comme une micrographie pseudocolored qui montre les différences de pHluorin mCherry ratios (Figure 4 et Figure 5). Dans ces images, différences dans le pHluorin mCherry ratios sont affichés comme différences de couleur, telle que définie par une LUT. Il est important de sélectionner une LUT et les valeurs maximales et minimales pour la gamme de couleurs pour produire une image qui est la plus représentative des données. Bien que, en règle générale, le choix des paramètres de LUT et gamme ne donnera pas l’apparence des différences qui ne sont pas présents dans l’image, un choix moins adapté de LUTs peut obscurcir les différences pHi présents dans la micrographie (Figure 5).

Figure 1 : Matériaux pour la dissection et montage Drosophila ovarioles. (A), une image montrant : vernis à ongles (1) ; (2) aspiration graisse et bécher et pipette le bout utilisé pour graisser ; (3) 23-jauge seringues aiguilles ; (4) pince Inox Dumont, 5 de taille ; (5) chambre 3D montage imprimées ; (6) 22 x 40 mM lamelles de verre ; (7) tour de lamelles de verre, diamètre 12 mm, 0,13 à 0,16 mm d’épaisseur ; et (8) 9 puits verre plat de dissection. (B), un gros plan image de la chambre de montage imprimé 3D. (C) une image montrant une paire disséquée des ovaires de type sauvage. (D), une image montrant les ovarioles bien séparées. (E), une photo de la chambre 3D avec ovaires disséqués monté sous une lamelle de verre ronde. Les points noirs sont des gouttes de vernis à ongles utilisés pour maintenir la lamelle ronde en place. Lamelle de verre (F) une image d’ovarioles disséqués sous un tour après le montage. La boîte noire indique une région d’une image avec un seul ovariole disséqué. Barres d’échelle représentent environ 500 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : identification des FSC, les PFC et les cellules folliculaires,. Deux exemples de germaria avec SAMU-mCherry::pHluorin et 10930-Gal4 colorées avec concanaviline-A. Un retour sur investissement décrivant une FSC, pFC et une cellule de follicule est montré dans chaque image. Les intensités de fluorescence moyenne dans les voies pHluorin et mCherry sont utilisées pour calculer le pHluorin rapports de mCherry. Barres d’échelle représentent environ 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : pHi augmente au cours de la différenciation dans la lignée FSC. Résultats représentatifs prélevés Ulmschneider et al. ² affichage : (A), une régression linéaire typique courbe permettant de calculer des valeurs de pH de pHluorin rapports de mCherry ; et (B) le pHi calculé valeurs avec intervalles de confiance de 95 % pour le FSC, les PFC et les cellules folliculaires. Ce chiffre a été adapté après autorisation, de Ulmschneider et al. ². s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : à l’aide de Fidji pour générer une image ratiométrique pseudocolored. (A) des Images montrant les résultats de chaque étape dans le processus de soustraction du fond. Commençant par une image non transformée (panneaux de gauche), la première étape consiste à définir les limites de seuil afin que soient exclus les pixels dont les valeurs d’intensité inférieure à fond. La limite supérieure du seuil est définie au maximum. Fidji colorera les exclus pixels bleu, ayant pour résultat une image avec un fond bleu et un germarium bien visible (panneaux de moyenne). Noter que cette étape est facultative. La deuxième étape consiste à dessiner un ROI dans une partie de l’image sans mesure de signal (carrés rouges en panneaux de moyenne), l’intensité de la fluorescence moyenne du ROI et soustraire ce montant de l’image entière, ce qui entraîne un fond soustraite image (panneaux de droite). La troisième étape consiste à utiliser la fonction de calcul d’Image pour diviser l’image dans le canal de pHluorin par l’image dans le canal de mCherry. Le résultat sera une image affichée avec la table de choix de gris et les valeurs d’affichage image la valeur couvrent toute la gamme dynamique fournie par le nombre de bits de l’image. La dernière étape consiste à ajuster les paramètres d’affichage image à une gamme plus appropriée, puis sélectionnez une table de choix. (B) exemples d’images montrant le résultat d’un calcul de l’image avec le minimum d’affichage la valeur 0 et la valeur d’affichage maximale définie à 2,5 à l’aide de quatre tables de recherche différents. Le rectangle à côté de chaque image montre les couleurs utilisées dans l’ensemble de la gamme dynamique pour chaque table de choix. Notez que pour HiLo, 16 couleurs et thermiques, des couleurs distinctes sont utilisées pour pixel avec une valeur d’intensité de 0 ou maximum (par exemple, bleu et rouge, respectivement, à HiLo). Ceci fournit une référence visuelle facile des limites de la plage dynamique, ce qui permet au spectateur de voir que le signal est au sein de la gamme dynamique. (C) capture d’écran montrant les options sélectionnées lorsque vous importez un fichier dans ImageJ utilisant le plug-in de l’importation Bio-Formats. barres d’échelle représentent 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : définition de l’image des valeurs d’affichage des images ratiométrique pseudocolored. Les valeurs minimales et maximales des images d’affichage doivent être définies afin que le signal en images de la condition de bicarbonate ainsi que de ces deux conditions de nigéricine sont dans la gamme dynamique. Pour illustrer ce point, les deux images de chacune des trois conditions sont indiqués avec quatre paramètres d’affichage des images différentes (0 à 0,5, 0-1, 0-2,5 et 0-5) à l’aide de la table de choix thermique. Notez que, lorsque les images sont affichées avec la maximum de valeur affichée la valeur 0,5, une grande partie du signal est au maximum sur l’échelle colorimétrique à proximité pour toutes les trois conditions expérimentales, et lorsqu’elle est définie à 5.0, une grande partie du signal est au minimum sur la couleur à proximité IMETRIC échelle. Dans les deux cas, les différences dans le pHluorin mCherry rapport à travers le tissu ne peut pas facilement appréciés si ces paramètres ne sont pas idéales. En revanche, les valeurs d’affichage maximale de 1,0 ou 2.5 sont beaucoup plus appropriés. Avec ces paramètres, les différences dans les ratios à travers le tissu peuvent être facilement appréciés, et les signaux dans les images de toutes les trois conditions expérimentales sont affichés en couleurs qui se situent dans la plage dynamique de l’échelle colorimétrique. Barres d’échelle représentent environ 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Nous décrivons ici une méthode de mesure du pHi des cellules de la lignée FSC dans le tissu de type sauvage. Ce protocole a été développé et affiné au cours des cinq dernières années, puisque nous avons commencé à étudier pHi dans drosophile tissu ovarien. Pendant ce temps, le protocole a été utilisé avec succès par plusieurs chercheurs dans notre laboratoire et au moins quatre disques de rotation différents et les microscopes à balayage laser. La reproductibilité de notre observation originale, que pHi augmentations comme les cellules de la lignée FSC différencient de la cellule souche à la pFC à l’état de cellules folliculaires, dans ces essais multiples démontre tant que ce phénomène biologique est solide et que la méthodologie est fiable. Toutefois, selon notre expérience, c’est une procédure difficile à maîtriser. Elle nécessite une attention particulière aux détails à chaque étape et une exécution rapide et très compétente de la dissection, de montage et d’imagerie des étapes. Comme indiqué dans le protocole, la procédure de dissection et de montage comprend une période d’incubation de 10 min mais ne doit pas dépasser 15 min total et l’imagerie doit être réalisée en 45 min. Dans des conditions idéales, Drosophila ovarioles peuvent être maintenues en culture pour jusqu'à 14 h¹⁷, mais nous avons constaté que le tissu commence à mourir beaucoup plus rapidement dans les tampons de nigéricine utilisés pour générer les courbes standards. Nos lignes directrices s’assurer que toutes les données sont collectées tandis que le tissu est toujours bien dans la fenêtre de temps qu’il semble en bonne santé et morphologiquement normaux. Cela ne laisse pas beaucoup de temps pour chaque étape, cependant, il est donc important de planifier à l’avance pour s’assurer que tout est prêt pour passer d’une étape à l’autre. En fait, il est beaucoup plus efficace si deux personnes travaillent ensemble sur la dissection, de montage, et de procédures, d’imagerie avec une personne qui exécute une étape tandis que l’autre personne se prépare pour la prochaine étape.

Depuis pHi peut-être être sensible aux manipulations expérimentales nécessaires à l’image du tissu ex vivo, comme la composition de la température et de la mémoire tampon, cette méthode est préférable d’identifier les variations relatives du pHi. Étant donné que la sonde se compose de deux protéines fluorescentes distinctes, leurs propriétés de fluorescence comme rendement quantique, durée de vie et le pliage des propriétés peuvent être affectées différemment dans différents types de cellules. Par conséquent, il est essentiel d’inclure les échantillons traités avec les conditions de tampon de nigéricine et de les utiliser pour générer une nouvelle courbe d’étalonnage pour chaque type de cellule dans toutes les épreuves. Afin de réduire la variabilité des sources supplémentaires, garder toutes les conditions cohérente au cours de l’imagerie est mis en valeur. Échantillons dans des conditions de tampon nigéricine élaborerait et photographiés le même jour que ceux de la condition de tampon bicarbonate et l’acquisition de préparation et de l’image de tous les échantillons doivent être conservés aussi cohérents que possible. Ceci est important parce que les mesures de pHi sont basées sur une comparaison entre les ensembles d’images, donc expérimentales différences qui affectent la détection de le mCherry et pHluorin dans un ou plusieurs des ensembles d’images peut diminuer la précision des estimations pHi. Facteurs comme les changements dans les paramètres de tension des tubes photomultiplicateurs (si vous utilisez un laser confocale à balayage) ou temps d’exposition (si vous utilisez un disque de rotation confocal) ou une lentille sale qui réduit la quantité de lumière atteignant la caméra, affecte clairement les résultats . Mais il existe une multitude d’autres facteurs plus subtiles qui peut varier au quotidien et peuvent aussi influer sur les résultats, par exemple, si les mouches sont bien nourris, l’âge des mouches, et combien de temps les lasers ont siégé avant l’imagerie. Préparation et imagerie aux trois conditions le même jour minimise ces différences et vont donc produire des résultats les plus cohérents. Notamment, chaque fois que nous sommes passés à un nouveau microscope ou mis à niveau les composants du microscope, il a fallu majorent les paramètres sur le nouvel équipement. Cela a souvent entraîné un changement dans les valeurs moyennes des mesures individuelles, mais, aussi longtemps que les nouvelles courbes de calibrage ont été générés à chaque essai, les changements dans l’équipement avaient un impact minime sur les estimations de pHi. En outre, la comparaison pertinente est souvent entre les différents types de cellules qui sont dans le même tissu (par exemple, le FSC, les PFC et le follicule cellules) et sont donc en interne contrôlée les variations expérimentales.

Bien que ce protocole a mis l’accent sur la mesure de pHi de tissu de type sauvage, la méthodologie est compatible avec les méthodes standard de drosophile pour manipuler l’expression des gènes, comme expression d’Arni ou un transgène utilisant SAMU/Gal4 et l’analyse de la mosaïque. Étant donné que mCherry::pHluorin est propulsé par un promoteur du SAMU, il sera toujours exprimé conjointement avec l’ARNi ou le transgène et MARCM¹⁸ peut être utilisé pour générer des clones mutantes homozygotes avec mCherry::pHluorin comme marqueur clonal. Pour les motifs exposés ci-dessus, les tissus de type sauvage doivent être analysées comme un contrôle aux côtés de toutes les épreuves avec un génotype mutant. Enfin, les principes généraux décrits ici peuvent être appliqués à l’utilisation de mCherry::pHluorin pour mesurer les pHi dans d’autres tissus aussi bien. En effet, ce protocole a été adapté d’un protocole d’utilisation de mCherry::pHluorin pour mesurer les pHi dans l' œil de drosophile ⁷, et nous avons utilisé une méthodologie similaire à l’image de mCherry::pHluorin dans le cerveau larvaire. Dans l’ensemble, les outils et les méthodes décrites ici offrent de nouvelles possibilités d’enquêter sur les nombreuses fonctions diverses de pHi in vivo dans le tissu vivant et intact.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fly Stocks
UAS-mCherry::pHluorin[1]
y1 w*;P{GawB}10930/CyO	Bloomington Stock Center	7023
Act-Gal4 flipout stock	Bloomington Stock Center	4409
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals for Buffer preparation
NaCl	Sigma Aldrich	S5886
KCl	Sigma Aldrich	P-3911
glucose	Mallinckrodt	4912
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310
MgSO4	Thermo Fisher Scientific	M63
CaCl2	Sigma Aldrich	C-5080
HCO3	Sigma Aldrich	S-5761
MgCl2	Sigma Aldrich	M-9272
NMDG+	Sigma Aldrich	M-2004
K2HPO4	Mallinckrodt	7088	Use to Make KHPO4 pH 7.4
KH2PO4	Thermo Fisher Scientific	BP362	Use to Make KHPO4 pH 7.4
Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate	Thermo Fisher Scientific	C21421	0.25 mg/ml dilution
Nigericin	Thermo Fisher Scientific	N1495
Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection and mounting tools
2 Dumont Inox forceps (Size 5)	Thermo Fisher Scientific	NC9473431
2 23-gauge syringe needles	Sigma Aldrich	Z192457
9-well glass dissecting dish	Thermo Fisher Scientific	13-748B
Vacuum Grease	Dow Corning	1018817
22 X 40 mM glass coverslips	Thermo Fisher Scientific	12545C
Round Glass Coverslips, 12mm diameter, 0.13-0.16mm thickness	Ted Pella, Inc.	26023
3-D mounting chamber	custom manufactured		.stl and .ipt files for 3-D printer included as supplemental files
Name	Company	Catalog Number	Comments
Other equipment
pH meter	Thermo Fisher Scientific	13-620-183A	Model: Accumet AB15
Dissection microscope	Olympus Corporation	0H11436	Model: SZ2-ST
Confocal Microscope	Leica Biosystems		SP5 or SP8 laser-scanning confocal microscope with a 40× objective with a numerical aperture of 1.3