Este protocolo describe un método para inyectar ADN plásmido en el riñón de ratón a través de la pelvis renal para producir la expresión del transgen específicamente en el riñón.
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Artículo de método
Inyección hidrodinámica la Pelvis Renal para la no expresión de proteínas en el riñón
En este artículo
Resumen
Resumen
Inyección hidrodinámica crea un ambiente local, alta presión para transfectar varios tejidos con ADN plasmídico y otras sustancias. Inyección en la vena hidrodinámica cola, por ejemplo, es un método bien establecido de que el hígado puede ser transfectado. Este manuscrito describe una aplicación de los principios hidrodinámicos por inyección del riñón de ratón directamente con ADN de plásmido de expresión génica específicos de riñón. Ratones son anestesiados y se expone el riñón por una incisión flanco seguida de una inyección rápida de un plásmido que contiene el ADN de la solución directamente en la pelvis renal. La aguja se mantiene en el lugar durante diez segundos y el sitio de la incisión es suturado. Al día siguiente, en vivo la proyección de imagen animal, Western blot o inmunohistoquímica puede utilizarse para análisis de expresión génica, u otros ensayos para el transgén de la opción se utilizan para la detección de la proteína de interés. Métodos publicados para prolongar la expresión de genes incluyen el transgén mediada por transposones integración y ciclofosfamida tratamiento para inhibir la respuesta inmune a la transgénica.
Introducción
La técnica de inyección hidrodinámica cola vena se ha convertido en una forma comúnmente usada para alcanzar altos niveles de expresión génica en mouse de hígado1,2. Los riñones también son transfectados por esta técnica en un nivel mucho más bajo, aproximadamente 100-fold menos3. La inyección hidrodinámica renal pelvis descrita aquí proporciona una manera simple para controlar la especificidad de la expresión del órgano a través de medios físicos, utilizando los mismos principios hidrodinámicos que se han establecido previamente en el hígado4,
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Protocolo
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional de Animal y comités de uso (IACUCs) de la Baylor College of Medicine y Vanderbilt University Medical Center.
1. prepare la solución de ADN para la inyección
- Seleccione plasmid(s) para expresar el transgene(s) cuidadosamente para maximizar las características deseables para mejorar la eficiencia de transfección y expresión del transgén.
Nota: Pelvis renal hidrodinámico inyección de plásmidos que expresan el marcador fluorescente TdTomato, la hormona eritropoyetina (Epo) y luciferasa de luciérnaga han sido previamente descritos11
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Resultados
La técnica de la cirugía y la inyección son sencillas para llevar a cabo una vez dominado, que no requiere equipos o materiales costosos. Si a la cirugía de incisión flanco renal, se debe un día de entrenamiento en varios ratones programados para eutanasia en que los ratones no son recuperados después de la cirugía porque el primer intento de esta cirugía puede tomar mucho más tiempo de lo normal. Alternativamente, los investigadores familiarizados con las técnicas similares pueden encont.......
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Discusión
En este protocolo se describe un método robusto para alcanzar expresión génica reproducible específicamente en el riñón. En manos de un cirujano experimentado moderado encontramos el porcentaje de ratones transfectadas por esta técnica en el rango de 50-100%, dependiendo de la edad del ratón y la sensibilidad de la lectura del transgén. El nivel de expresión del gen de luciferasa fue sobre el fondo durante varios meses en ratones recibiendo transposones piggyBac y totalmente mantenida durante varias semanas en r.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar y no declarar ningún conflicto de interés.
Agradecimientos
Un premio de desarrollo de carrera del Departamento de Asuntos Veteranos [BX002797] apoyó L.E.W. y los institutos nacionales de salud [R01-DK095867] y Asociación Americana del corazón [15GRNT25700209] apoyado J.C. Los institutos nacionales de salud [DK093660], Departamento de asuntos de veteranos [BX002190] y el centro de Vanderbilt para enfermedad renal compatible M.H.W. Este material es el resultado del trabajo apoyado con recursos y uso de instalaciones en el sistema de Healthcare del Valle de Tennessee de VA.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| AnaSed Xylazine | Patterson Veterinary | 07-808-1947 | Anestésico - Sustancia no controlada |
| BD Insulina Jeringa 0.5 mL 29G 1/2 Pulgada | Cardinal Health | 309306 | Jeringas requeridas |
| Buprenex | Farmacéutico/Veterinario | Analgesia - Sustancia Controlada | |
| Dynarex Cortina de toalla desechable | Thermo Fisher Scientific | 19-310-671 | Colóquelo sobre la almohadilla |
| térmica EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | Use solo ADN plasmídico libre de endotoxinas |
| Endosafe Gel-Clot LAL Control Positivo Rápido | Charles River | PC200 | Control positivo para prueba de endotoxinas |
| Endosafe Gel-Clot LAL Vial de prueba única rápida | Charles River | R13500 | Prueba de endotoxinas |
| Tijeras de microdisección extrafinas | Roboz Surgical Instrumento | RS-5882 | Herramienta quirúrgica |
| Fisherbrand Bolsa de esterilización de sellado instantáneo - 9" | Thermo Fisher Scientific | 01-812-51 | Para herramientas quirúrgicas de autoclave |
| Bomba de calor Gaymar | Paragon Medical | TP-700 | Bomba de calor de circulación de agua |
| Germinator 500 | Roboz Instrumento quirúrgico | DS-401 | Para reutilizar herramientas quirúrgicas durante la cirugía |
| Graefe Pinzas | Roboz Instrumento quirúrgico | RS-5136 | Herramienta quirúrgica |
| Graefe Pinza de tejido | Roboz Instrumento quirúrgico | RS-5153 | Herramienta quirúrgica |
| Halsey Portaagujas, 5" de longitud | Instrumento quirúrgico Roboz | RS-7841 | Herramienta quirúrgica |
| Almohadillas térmicas - 15" x 21" - necesitan al menos 3 | Paragon Medical | TP22G | Para usar con la bomba de |
| calor GaymarIsoFlo (Isoflurano, USP) | Abbott Animal Health | 5260-04-05 | Para la obtención de imágenes y la eutanasia |
| Sistema de administración de isoflurano Isotec Vaporizador | Smiths Medical | VCT3K2 | Para la obtención de imágenes y la eutanasia |
| Ketamina | Farmacéutico/Veterinario | Anestésico - Sustancia controlada | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Pañuelos de laboratorio |
| Software Living Image | Caliper Life Sciences | Para la obtención de imágenes de animales vivos | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000-US-CAN | Espectrofotómetro para la medición de ADN |
| Hisopos Prevantics | Thermo Fisher Scientific | 23-100-110 | Para la preparación para cirugías de piel |
| Suturas Prolene 5-0 Taper 30" | Thermo Fisher Scientific | NC0256891 | Suturas no absorbibles para la piel |
| Ungüento oftálmico de la marca Puralube | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | Para mantener los ojos húmedos durante la cirugía |
| Trans IT - QR Solución de administración hidrodinámica | Mirus Bio | MIR-5240 | Tampón de administración hidrodinámica para diluir ADN |
| Vicryl 5-0 Suturas J303H | Thermo Fisher Scientific | NC9816710 | Suturas reabsorbibles para la capa muscular |
| Wahl Mini Arco Clipper | Med-Vet International | 8787-1550 | Afeitadora para la preparación de la piel |
| Xenogen IVIS 200 | Caliper Life Sciences | Para la obtención de imágenes de animales vivos |
Referencias
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in ....
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Reimpresiones y permisos
