En este estudio, presentamos un procedimiento fácil y eficiente para evaluar la interrupción de la barrera sangre - cerebro en enfermedades neurodegenerativas. Para lograr nuestro objetivo, nos infunde isotiocianato de fluoresceína de alto peso molecular etiquetado (FITC)-albúmina en yugular de ratón de la vena y evaluado su salida en el parénquima cerebral por microscopía de fluorescencia.
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Artículo de método
Evaluación de la permeabilidad de la barrera hemato - encefálica por infusión intravenosa de albúmina marcado con FITC en un modelo murino de enfermedad neurodegenerativa
En este artículo
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Resumen
Resumen
La interrupción de la integridad de la barrera blood - brain (BBB) es una característica común de distintas enfermedades neurológicas y neurodegenerativas. Aunque la interacción entre homeostasis perturbada de BBB y la patogenia de los trastornos cerebrales necesita mayor investigación, el desarrollo y validación de un procedimiento confiable para detectar con precisión alteraciones BBB pueden ser crucial y representan una herramienta útil para predecir la enfermedad potencialmente la progresión y desarrollo habían concentrado en estrategias terapéuticas.
Aquí, presentamos un procedimiento fácil y eficiente para evaluar salida BBB en una condición neurodegenerative como eso que ocurre en un modelo de ratón preclínica de la enfermedad de Huntington, en el que son claramente detectables precozmente en defectos en la permeabilidad de BBB la enfermedad. En concreto, el alto peso molecular isotiocianato de fluoresceína etiquetado (FITC)-albúmina, que es capaz de cruzar el BBB solamente cuando éste se deteriora, es agudo infundida en la vena yugular de un ratón y su distribución en los distritos vasculares o parenquimatosos se determina por microscopía de fluorescencia.
Acumulación de verde fluorescente-albúmina en el parénquima del cerebro funciona como un índice de permeabilidad BBB aberrante y, cuando se cuantificaron utilizando software de procesamiento de imagen J, se divulga como intensidad de la fluorescencia verde.
Introducción
Homeostasis en el sistema nervioso central (SNC) es un prerrequisito para la comunicación adecuada y la función de las células neuronales. El parénquima de la CNS está cerrado de la periferia por la endotelial barrera blood - brain (BBB), que representa la interfaz entre el cerebro y la circulación sanguínea periférica y desempeña un papel crucial en las conversaciones entre estos dos barrios1 ,2. El BBB es un complejo y dinámica de la estructura tridimensional se compone principalmente de micro vasos endoteliales células especializadas (ECs) enlazadas entre sí mediante complejos de Unión intercelulares - ens....
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Protocolo
todos los procedimientos en animales fueron aprobados por la Junta de revisión cuidado de IRCCS Neuromed Animal y por " Istituto Superiore di Sanità " (número de permiso: 1163/2015-PR) y estaban de acuerdo con las directrices de la UE Directiva 2010 / 63/EU para los experimentos con animales.
1. preparación de FITC-albúmina solución para ser inyectada en la vena yugular
Nota: todos los experimentos eran llevado en manifiesto ratones de EH de R6/2 (11 - semanas de edad) y en edad y sexo-emparejado el salvaje-tipo (peso) control hermanos de camada.
- Disolver FITC-albúmina en polvo (véase
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Resultados
Infusión adecuada de FITC-albúmina en los resultados de la vena yugular en la extravasación del trazador fluorescencia verde de la circulación sanguínea en el cerebro parenchymawhen que la BBB es peligro6. En condiciones fisiológicas, distribución de la albúmina infundida de fluorescente está restringido al interior de los vasos del cerebro y no hay señal en el parénquima perivascular alrededor de área o cerebro es detectable (figura 1A
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Discusión
La técnica que Describimos aquí es principalmente útil para la detección de fugas BBB en condiciones de enfermedad cerebral. Disfunción BBB está ganando atención como una característica común de diversos trastornos neurológicos4. Anteriormente se utilizó este enfoque para describir el derangement principios de integridad BBB en un modelo de ratón de una enfermedad neurodegenerativa rara como HD6.
Este método toma ventaja de la relativa simplicida.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de interés divulgar
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la "Fondazione Neuromed" y financiado por el Ministerio italiano de salud "Ricerca Corrente" a V.M.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Albúmina-fluorescina isotiocianato conjiugado | SIGMA | A9771-100MG | |
| pAb anti-Laminina | Novus Biologicals | NB300-144 | |
| CY3 anti-conejo hecho en cabra | MILLIPORE | AP132 | |
| SUPERFROST PLUS | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Cubreobjetos 24 X 50 mm | Thermo Scientific (DIAPATH) | 61050 | |
| Compuesto Kilik Temperatura óptima de corte (OCT) | Bio Optica | 05-9801 | |
| VECTASHIELD Medios de montaje | VECTOR | H-1500 | Medios de montaje con DAPI |
| iNSu/Insulina ligera Jeringa desechable | RAYS Health & INS1ML26G13 | ||
| 30G 1/2" | BD Microlance | 304000 | Aguja para Insulina Desechable Jeringa |
| Bisturí Mango | F.S.T.91003-12 | ||
| #22 Bisturí Desechable | F.S.T. | 10022-00 | |
| Tijeras Iris Finas 10,5 cm | F.S.T. | 14094-11 | |
| Pinzas Dumont #5745 45° 0.10 x 0.06 mm | F.S.T. | 11251-35 | |
| Pinza Graefe 10 cm | F.S.T. | 11051-10 | |
| Pinzas Dumont #5 0.1 X 0.06 mm | F.S.T. | 11251-20 | |
| Parche médico | Medicalis | 34788 | |
| Paño de toalla desechable estéril | Dispotech | TVO50VE | |
| Microscopio estereoscópico | NIKON | SMZ 745 T | |
| Iluminador óptico luz LED (C-FLED2) | Iluminador óptico NIKON | 1003167 | para microscopio estereoscópico |
| Eclipse Ni-U Microscopio | Nikon | 932162 | Microscopio de epifluorescencia |
| Microscopio cámara digital | Nikon | DS-Ri2 | Cámara de microscopio |
| Intenslight | Nikon | C-HGFI | Lámpara de microscopio |
| NIS-Elements 64 bits | Nikon | AR 4.40.00 | Software de análisis |
| Maquinilla de afeitar eléctrica | Gemei | GM-3007 |
Referencias
- Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier. Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).
- Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. Anatomy and physiology of the blood-brain barrier. Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).
- Moretti, R., et al.
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease
Posted by JoVE Editors on 11/10/2017. Citeable Link.
An erratum was issued for: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease. One of the author's names was corrected from:
Maglione Vittorio
to:
Vittorio Maglione
