ShRNAs combinados pantalla para reactivación de MeCP2 en el cromosoma de X inactivo

Vid Leko; Smitha Sripathy; Robin L. Adrianse; Taylor Loe; Angela Park; Uyen Lao; Eric J. Foss; Marisa S. Bartolomei; Antonio Bedalov

doi:10.3791/56398

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Artículo de método

ShRNAs combinados pantalla para reactivación de MeCP2 en el cromosoma de X inactivo

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DOI:

10.3791/56398

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2 de marzo de 2018

Vid Leko¹^,² , Smitha Sripathy¹ , Robin L. Adrianse¹ , Taylor Loe¹ , Angela Park¹ , Uyen Lao¹ , Eric J. Foss¹ , Marisa S. Bartolomei³ , Antonio Bedalov¹^,⁴

¹Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, ²Hematology Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, ³Epigenetics Program, Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, ⁴Departments of Medicine and Biochemistry, University of Washington

En este artículo

Resumen

Divulgamos una pequeña horquilla RNA (shRNA) y el siguiente protocolo basado en la secuencia de generación para la identificación de reguladores de la inactivación del cromosoma x en una línea celular murina con luciferasa de luciérnaga y genes de resistencia a Higromicina fusionado a la metil CpG Unión proteína 2 ( MeCP2) gen en el cromosoma X inactivo.

Resumen

Avance genéticos pantallas usando genes del reportero insertados en la heterocromatina se han utilizado para investigar los mecanismos de control epigenético en organismos modelo. Tecnologías incluyendo horquilla corta RNAs (shRNAs) y agrupadas regularmente otro corto palindrómico repeticiones (CRISPR) han permitido que tales pantallas en células de mamíferos diploides. Aquí describimos una pantalla shRNA a gran escala de los reguladores de la inactivación del X-cromosoma (XCI), utilizando una línea celular murina con luciferasa de luciérnaga y genes de resistencia a Higromicina golpeó en el c-término de la proteína de unión a CpG de metilo 2 (MeCP2) gene en el cromosoma x inactivo (Xi). Reactivación de la construcción en la línea celular de reportero confiere ventaja de supervivencia en selección de higromicina B, lo que nos permite una biblioteca grande de shRNA y identificar reguladores que reactivaron el reportero midiendo su selección posterior enriquecimiento utilizando secuenciación de próxima generación. Las horquillas enriquecidas entonces fueron validadas individualmente por prueba de su capacidad para activar el reportero de luciferasa en Xi.

Introducción

Una las formas más comunes de deficiencia mental hereditaria en las mujeres, el síndrome de Rett, es causada por mutaciones heterozigóticas en MeCP2, un gen del cromosoma x que codifica una proteína esencial para la función neuronal normal¹. Un enfoque potencial para el tratamiento de este trastorno sería la reactivación del alelo tipo salvaje de MeCP2 en la Xi, como restauración de expresión MeCP2 fue demostrado revertir déficits neurológicos en un modelo de ratón de esta enfermedad¹^, ² ^, ⁴. sin embargo, silenciamiento epige....