Artículo de método

Método de tubo de rodillo modificado precisamente localizada y repetitiva imagen intermitente durante el cultivo a largo plazo de las rebanadas de cerebro en un sistema cerrado

DOI:

10.3791/56436

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28 de diciembre de 2017

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1Department of Biochemistry and Molecular Biology and Molecular, Cellular and Integrated Neuroscience Program, Colorado State University, 2IBMC-Instituto de Biologia Molecular e Celular, i3S-Instituto de Investigaçãoe Inovação em Saúde, ICBAS, Universidade do Porto, 3Denali Therapeutics

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Presentado aquí es un método de tubo de rodillo modificado para cultivo e intermitente proyección de imagen de alta resolución del cerebro de roedor rodajas durante muchas semanas con reposicionamiento preciso en photoetched cubreobjetos. Viabilidad neuronal y la morfología de la rebanada se mantienen bien. Se proporcionan aplicaciones de este sistema totalmente cerrado con virus para la expresión específica de tipo celular.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rebanadas de cerebro de roedor cultivadas son útiles para estudiar el comportamiento celular y molecular de las neuronas y glia en un entorno que mantiene muchas de sus interacciones normales en vivo . Rebanadas de una variedad de líneas de ratón transgénico o el uso de vectores virales para la expresión de proteínas fluorescencia etiquetas o reporteros en rebanadas de cerebro de tipo salvaje permiten proyección de imagen de alta resolución por microscopía de fluorescencia. Aunque se han desarrollado varios métodos para rebanadas de cerebro, combinando cultura rebanada con la capacidad para realizar la proyección de imagen repetitiva imagen alta resolución de células específicas en rebanadas vivo durante largos períodos de tiempo ha planteado problemas. Esto es especialmente cierto cuando los vectores virales se utilizan para la expresión de proteínas exógenas, puesto que esto se hace mejor en un sistema cerrado para proteger a los usuarios y evitar la contaminación cruzada. Simples modificaciones al método de cultivo rodaja rodillo tubo cerebro que permiten la repetitiva imagen de alta resolución de rebanadas durante muchas semanas en un sistema cerrado se divulgan. Rodajas en photoetched cubreobjetos de cultivo permite el uso de marcas fiduciales a rápidamente y exactamente colocar el escenario para el campo idéntico de la imagen en el tiempo antes y después de diferentes tratamientos. Se muestran ejemplos para el uso de este método combinado con tinción neuronal específica y expresión en hipocampo slice arquitectura viral mediada por la expresión neuronal de proteínas fluorescentes y el desarrollo de la patología de cofilin, que previamente se observó en el hipocampo de la enfermedad de Alzheimer (AD) en respuesta al tratamiento de la rebanada con oligómeros del péptido amiloide-β (Aβ).

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cultivo primario de neuronas disociadas de las regiones del cerebro de roedor es un instrumento importante utilizado por los investigadores para observar respuestas a patológico implicado estímulos. Sin embargo, estos estudios tienen la desventaja de mirar las neuronas en 2D solo y sin su sistema de soporte de glial. Además, a menos que se cultivan bajo condiciones de muy alta densidad (640 neuronas/mm2 o cerca de 16% de la superficie) en el cual se convierte en imposible seguir un resultado aleatorio de una dendrita o un axón para más que una corta distancia del cuerpo celular hipocampal viabilidad neuronal durante 4 semanas LTO1, limitar el uso de culturas disociadas estudios extendidos de patologías relacionadas con la edad. El cultivo de las rebanadas de cerebro de roedor es una opción atractiva que supera estas limitaciones al mantener una arquitectura celular organizado y viabilidad durante semanas o meses. Condiciones para el mantenimiento de diferentes regiones del cerebro de roedor en sector cultura han sido descritas2.

Dos métodos principales son ampliamente utilizados para el cultivo a largo plazo de las rebanadas de cerebro: permite para girar en un incubador de rodillo para proporcionar aireación4cultivo de membranas en la interfaz aire-líquido3 o cultivo en cubreobjetos en tubos cerrados. Sectores cultivados en las membranas pueden ser directamente reflejadas con microscopía de fluorescencia de alta resolución usando un microscopio vertical y de objetivos de inmersión de agua5. Por otra parte, sectores cultivados en las membranas han sido transferidos a platos de fondo de vidrio para lograr la buena resolución de espinas dendríticas usando un microscopio invertido6. Sin embargo, ambos métodos de rebanadas en las membranas de la proyección de imagen son sistemas abiertos que requieren cambios medianas y suelen utilizan antifúngicos o antibióticos para prevenir o reducir la contaminación5,6. Rodajas en una membrana en la interfase medio aire mantienen excelente morfología y supervivencia, pero volviendo a lugares precisos en imágenes repetitivas a alta magnificación es extremadamente difícil a menos que el experimento sigue sólo pequeños grupos de células expresan un marcador fluorescente. Aunque se han utilizado láminas en membranas con viral mediada por la expresión de los transgenes5,6, protocolos de bioseguridad pueden requerir un sistema de cultivo cerrado se emplea para ciertos vectores virales que se utilizan para expresión de fluorescencia con la etiqueta proteínas y reporteros de fisiología de la célula. Además, objetivos de inmersión requieren descontaminación entre las muestras que se seguirá en la cultura5. Una aplicación importante de las culturas de interfaz de membrana es la combinación de imágenes de alta resolución con electrofisiología en vez puntos7.

El método de tubo de rodillo con cubreobjetos dentro del tubo plástico no permite cualquier electrofisiología o la proyección de imagen de alta resolución sin quitar el cubreobjetos. Por lo tanto, este método se ha aplicado más a menudo posible a los estudios a largo plazo en el que se han hecho observaciones posteriores a la fijación8. Se describe aquí es un método que utiliza la técnica de cultivo de tubo de rodillo pero en tubos perforados hacia fuera con rodajas en cubre-objetos que pueden ser reflejada repetidamente durante el tiempo que las culturas se mantiene. El sistema cerrado no requiere ningún cambio medio para la proyección de imagen y utiliza photoetched cubreobjetos para proporcionar marcas fiduciales que permiten la proyección de imagen a gran aumento, después de días o semanas, los precisos campos anteriormente reflejados.

Aplicamos este método para examinar los cambios en el hipocampo de roedor, una región del cerebro importante en la memoria y el aprendizaje. El hipocampo de roedor a menudo se estudia como modelo para patológicas o relacionadas con la edad cambios observados durante el desarrollo de deterioro cognitivo9, como las que ocurren en AD. Nuestro método está particularmente bien adaptado para el estudio de los cambios patológicos que se desarrollan dentro de una sola rebanada con el tiempo en respuesta a cambios ambientales, tales como aumento de péptidos Aβ, que es característico de AD8. Una patología asociada con cerebro humano y roedor AD es la presencia de agregados de actina cofilin y varillas, los paquetes que contiene éste de filamentos de actina y cofilin están en una relación molar 1:110,11, 12. las barras se han observado en fijadas rebanadas de hipocampo de rata después del tratamiento de Aβ, así como dentro de un trozo de cerebro de roedor vivo expresando cofilin-GFP sometido a hipoxia8, y pueden contribuir a la disfunción sináptica en AD y accidente cerebrovascular. Aquí utilizamos este nuevo método de cultivo para observar la evolución temporal y distribución dentro de rebanadas de expresadas proteínas fluorescentes quiméricas exógenas introducidas por virus diferentes. Luego utilizamos la expresión específica neuronal de una construcción de reportero cofilin para seguir el desarrollo de la barra de cofilin y patología agregada en rebanadas hippocampal en respuesta al tratamiento con oligómeros de Aß soluble (Aβo).

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Protocolo

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Uso de animales sigue cría aprobado y protocolos de uso de animales que se ajusten al cuidado Animal y utilizar las pautas de la Universidad Estatal de Colorado.

Nota: El protocolo a continuación describe el método de preparación y cultura para la incubación a largo plazo y la proyección de imagen intermitente de rebanadas hippocampal. Una sola rebanada hippocampal se une a un cubreobjetos photoetched especialmente preparado con un coágulo de plasma, y luego el cubreobjetos se sellan en la parte plana de un tubo de rodillo perforado-hacia fuera, que se mantiene en una incubadora de rodillo. Se disuelven los coágulos de plasma con plasmina antes de la infección viral de la expresión de la proteína fluorescente y proyección de imagen de alta resolución. Un colorante vital neuronal fluorescente se utiliza para las neuronas dentro de las rebanadas de la imagen.

1. preparación del estante de tubo de rodillo

  1. Uso la plantilla se muestra en la figura 1A imprime al tamaño que se muestra en la barra de escala. Con un clavo, taladro pequeño (lo suficientemente grande para un marcador de punta fina) en la plantilla centrada en los agujeros.
  2. Fijar la plantilla en el fondo de un plato de cultivo de tejidos de 15 cm (diámetro nominal de 14 cm) y marque la posición de los agujeros. Repetir este proceso en un segundo plato.
  3. Con brocas para taladro diseñados para plásticos, perfore seis agujeros de diámetro de 1,5 cm en cada plato en una matriz hexagonal (4,8 cm centro a centro) con centros de agujero 2,5 cm desde el borde del plato. Perfore tres agujeros (3 mm de diámetro) 12 mm desde el borde que equidistantly se colocan entre dos de los agujeros más grandes como se muestra en la figura 1A.
  4. Con el fondo de cada plato uno frente al otro, coloque un tornillo de máquina largo de 2,5 pulgadas (3/16 de pulgada de diámetro) con una arandela plana por uno de los agujeritos, seguidos por una segunda arandela plana, una pieza de polietileno tubería (separador, 4,7 cm), otra arandela plana , el segundo plato de cultivo de tejidos, otra arandela plana, una arandela de bloqueo y una tuerca.
  5. Repita el paso 1.4 sobre los dos tornillos y apriete solamente libremente hasta que todos los tornillos de máquina. Luego apriete bien las tuercas.
  6. Trabajar los ojales (5/16 de pulgada espesor, diámetro de agujero de 5/8 pulgada) en los orificios del plato inferior para obtener el final tubo bastidor (figura 1B; se muestra con dos tubos). Coloque una etiqueta en cada estante con un número único.

2. preparación de los tubos del rodillo y cubreobjetos

  1. Hacer la plantilla para el taladrado en tubos roller
    1. Perfore un orificio de 1.5 cm 8 cm de profundidad en la zona centro de 2 x 4 x 5,5 pulgadas el bloque de madera en un ángulo tal que el lado plano del rodillo tubo voluntad ser casi paralelo con el bloque cuando se insertan (figura 2A).
    2. Agrande el orificio utilizando una lima redonda de madera para ampliar tanto el agujero para permitir la inserción del tubo de la forma cónica (tubos de rodillos son un poco más grandes de diámetro cerca del extremo de la tapa) (figura 2B).
    3. Taladrar un agujero vertical de 1,5 cm diámetro, 5.5 cm desde el lado del bloque y centrado sobre el agujero lateral (figura 2C).
    4. Cuando el agujero lateral es afilado lo suficiente, inserte un tubo del rodillo que está marcado en el punto deseado para centrar el agujero para el corte y coloque el tubo de modo que esté centrado el lugar marcado en el agujero vertical de 1,5 cm.
    5. Retire el tubo y mida la distancia desde el punto hasta el final del tubo. Marque esta distancia desde el centro del agujero en la plantilla e introduzca un clavo para proporcionar una parada para colocar correctamente el tubo de perforación (flecha en figura 2C).
    6. Utilice una sierra para cortar las uñas al ras con la superficie de un bloque de madera para evitar lesiones.
    7. Añadir clips de resorte en la parte inferior de la plantilla si hay una prensa del taladro con ranuras que permiten que sea anclada (figura 2D negro flecha). De lo contrario, use abrazaderas en C para sostener la plantilla firmemente en la prensa del taladro.
  2. Utilizando la plantilla descrita para sujetar y colocar un tubo de plástico cultura cara plana 11 cm con la cara plana hacia arriba (figura 2A), taladre un orificio de diámetro 6 mm con el centro de 1,0 cm de la parte inferior y centrada entre los lados del tubo.
    Nota: Debe utilizarse una broca de taladro diseñada para plástico.
  3. Con una herramienta giratoria de desbarbado, suavizar los bordes del agujero (figura 2E) y 4 ranuras en la parte interior borde del orificio (figura 2E, de la inserción) para facilitar el drenaje del agujero durante la rotación.
  4. Con un agujero de 12 mm perforar, cortar discos de diámetro de 12 mm de láminas de caucho no tóxico doble cara adhesivo silicon. Usando un sacador de papel de un agujero estándar (diámetro de 6 mm), haga un agujero en el centro de cada disco.
  5. Enjuague los tubos perforados con etanol al 70%, el aire los seque en un gabinete de seguridad biológica y para esterilizar los tubos y los discos perforados de adhesivo durante 40 minutos bajo la lámpara UV (30 W a una distancia promedio de 70 cm) en el gabinete de seguridad biológica.
  6. Vuelva a colocar los tubos y discos después de 20 minutos para que todas las superficies expuestas son esterilizadas. Bajo condiciones estériles, retire el blanco de un disco adhesivo y pegue el caucho de silicona en el exterior de un tubo, alineando los orificios (figura 2F).
    PRECAUCIÓN: Para evitar la exposición Ultravioleta, use protección para los ojos y cerrar la caja antes de encender la lámpara Ultravioleta.
  7. Limpiar 12 mm diámetro photoetched (100 centro número 1 mm cuadrados) cubreobjetos de cristal alemán. Sostenga suavemente el cubreobjetos con el fórceps y la inmersión en etanol absoluto, seguido por el agua, seguido de etanol absoluto y finalmente sumergir el cubreobjetos en una llama para quemar el etanol. Permiten el cubreobjetos que se enfríe.
  8. Sostiene el cubreobjetos con pinzas, sumerja en 3 aminopropyltriethoxysilane 2% en acetona por 10 s. Enjuague el cubreobjetos con agua ultrapura y déjela secar al aire.
  9. El cubreobjetos en papel de filtro estéril dentro de una seguridad biológica gabinete y gire a la luz en el ultravioleta. Exponer a cada lado del cubreobjetos por 20 min.
    PRECAUCIÓN: Para evitar la exposición Ultravioleta, use protección para los ojos y cerrar la caja antes de encender la lámpara Ultravioleta.

3. hipocampo sector preparación

  1. Antes de comenzar la disección, preparar las mitades de hojas de afeitar de doble filos para el picador de tejido. Dobla las hojas a lo largo con cuidado con los dedos y ajustar a la mitad.
  2. Enjuague las mitades de la hoja con acetona, utilizando un hisopo de algodón para limpiarlos, seguido por enjuague en etanol absoluto y secado de aire.
Antes de montar un disco medio en la chopper de tejido, esterilizar por lavado con etanol al 70%.
  • Seguir protocolos de actuación aprobados por el Animal cuidado institucional y el Comité de uso; después de la anestesia isoflurano, eutanasia una cría de ratón o rata de 4-7 días por decapitación y quite la cabeza con tijeras o guillotina.
    Nota: El protocolo de cerebro sector cultura es independiente de cepa de rata, ratón o genotipo. Muchas líneas de ratón transgénico con diferentes fondos genéticos se han utilizado.
  • Enjuague la cabeza con etanol al 70% y colocar en una placa de Petri de 60 mm. Hasta el montaje final de la rebanada del cerebro en el tubo del rodillo, todos de los siguientes pasos se llevan a cabo en una campana de flujo laminar para mantener la esterilidad.
  • Usando una cuchilla quirúrgica #21, haga un corte sagital a través de la piel y el cráneo. Con un fórceps de Dumont #5, cáscara de nuevo la piel y el cráneo para exponer el cerebro.
  • Con pinzas cerradas, suavemente fastidiar a todo el cerebro, liberando pellizcando con las pinzas a través del vástago de cerebro detrás del cerebelo. Colocar el cerebro en un plato de 60 mm estéril que contiene glucosa de Solution/0.5% sal balanceada de 4 ° C Gey (GBSS glucosa).
  • Usando un microscopio de disección para visualizar el cerebro (figura 3A), coloque el lado dorsal del cerebro arriba y cortar el tercio frontal del cerebro y el cerebelo con una cuchilla quirúrgica (figura 3B).
    1. Con pinzas, sujete el recortado cerebro posterior hacia arriba y lado ventral contra el lado de la placa de Petri para la estabilidad. Suavemente se burlan ausentes meninges alrededor de la línea media sagital y extirpar el tejido de cerebro medio usando un fórceps Dumont #5 con punta fino (figura 3C, círculo discontinua).
    2. Hacer dos cortes a lo largo de la parte del cerebro a lo abierto (figura 3C, líneas discontinuas). Una vez que el cerebro se coloca el lado dorsal hacia abajo y abierta de propagación, debe verse la fisura hipocampal (D,figura 3, flecha).
    3. Transferir el cerebro abierto de extensión a un pedazo de película plástica polychlorotrifluoroethylene y posición para cortar en el escenario de un chopper de tejido. Moje la hoja con glucosa GBSS y picar el hipocampo en rodajas gruesas de ~ 300 μm.
    4. Con una pipeta, enjuague el cerebro rebanado apagado la película plástica en un plato fresco 60 mm que contiene glucosa GBSS (figura 3E). Suavemente apriete y tease, con pinzas con punta finas, las meninges restantes y otros tejidos no hipocampo (figura 3F) de las láminas (figura 3G, H).

    • 4. galjanoplastia rebanadas

    1. Una vez que han sido obtenidas de rodajas, Coloque 2 μl de plasma de pollo en el centro del lado photoetched de un cubreobjetos preparado. Se separó el plasma ligeramente para conseguir un lugar de 3-4 mm de diámetro.
      Nota: El lado photoetched es el lado superior del cubreobjetos cuando se mira a través de un microscopio de disección, tales que los números están orientados correctamente.
    2. Transferencia 1 rebanada del cerebro con una espátula estéril de punta estrecha (figura 4A) hasta el lugar de plasma (figura 4B). Utilice pinzas cerradas para mantener la rodaja en la punta de la espátula mientras levanta la rebanada de la GBSS/glucosa.
    3. Toque la espátula al plasma spot sobre el cubreobjetos y con unas pinzas cerradas, empuje la rodaja sobre el cubreobjetos.
    4. Mezcla 2.5 μl de plasma con 2.5 μl de la trombina en un tubo separado. Rápidamente Coloque 2.5 μl de esta mezcla sobre y alrededor de la rebanada y la pipeta hacia arriba y hacia abajo suavemente para mezclarlo (figura 4B).
      Nota: El plasma se coagule dentro de 10-15 s, así que esto debe hacerse rápidamente. Si slice es un problema, mezclar 5 plasma μl con trombina μl 5 y 4-5 μL en el segmento, eliminar algunos después de mezclar para que la rodaja se encuentra sobre el cubreobjetos.
    5. Quite el plástico transparente desde el lado expuesto del adhesivo de caucho de silicona previamente colocado en un tubo de rodillo y colocar el cubreobjetos con la rebanada del cerebro sobre el adhesivo alinear el segmento dentro del orificio (figura 4C).
    6. Para garantizar la adherencia, presionar suave, incluso para el cubreobjetos con el dedo pulgar presionando uniformemente el cubreobjetos y mantiene durante aproximadamente 1 minuto durante la transferencia para el gabinete de seguridad biológica.
    7. En un gabinete de seguridad biológica, agregar 0,8 mL de medio de cultivo A Neurobasal completado (Tabla de materiales) a cada tubo (figura 4D).
    8. Flujo de una mezcla de aire 95% de 5% CO2a través de una pipeta de Pasteur de la enchufada de algodón estéril sostenida firmemente por una abrazadera. Enjuagar el tubo del rodillo con la mezcla de gas y cerrar rápidamente el tubo, se retira de alrededor de la pipeta.
    9. Etiqueta los tubos con el número de sector y número de estante. Introduzca los tubos en un bastidor de rodillos, asegurando que estén equilibrados geométricamente. Si hay un número impar de los tubos, añadir tubos para equilibrar.
    10. Coloque las parrillas en una incubadora de rodillo de 35 ° C con los rodillos girando el bastidor de rodillo en sobre RPH de 10-13 (figura 4E). Para mantener el medio en la parte inferior de los tubos, inclinar la incubadora hacia atrás aproximadamente 5° levantando su frente en una mesa.
    11. Introduzca el número de corte y tubo sobre una hoja de cálculo, que se utiliza para registrar toda la información de tratamientos de corte y las fechas de observación.
    12. En aproximadamente el día 6 en la cultura, añadir 1 μl (0.002 U) de la plasmina activa a cada tubo.
    13. Después de que los coágulos se disuelven totalmente (generalmente dentro de algunas horas), quitarlo del medio y reemplazarlo con medio fresco sin plasmina. Si es necesario, rebanadas pueden incubarse con plasmina durante la noche y el medio cambió al día siguiente.
    14. Generalmente se incuban rebanadas durante al menos 7-10 días antes de su uso en experimentos. Aspirar el medio y sustituirlo en día 3 o 4, el día 7 y cada 7 días después de eso.

    5. preparación de vectores virales para la expresión de transgenes

    Nota: Expresión de transgenes en las neuronas del sector culturas se logra mediante el uso de los cerebros de los roedores modificados genéticamente o mediante la introducción del transgén por infección con virus deficientes recombinante replicación.Adenovirus (AV), virus adeno-asociados (AAV) y lentivirus recombinante vectores se todos han utilizado en nuestras culturas hippocampal de la rebanada para la expresión de quimeras de la proteína fluorescente diferente en rebanadas de cerebro.

    1. Preparar la replicación deficiente AV para expresar el RNA de interés según los métodos descrito en otra parte13,14. Título de los virus para U infecciosa/mL por el método de dilución seriada con un anticuerpo para una proteína viral expresada como describen14. Observar cofilin agregados y la formación de la barra de cofilin-actina, utilizar el cDNA de cofilin-R21Q-mRFP (plásmido #51279)16.
      Nota: El sinapsina 1 promotor es una excelente expresión específica neuronal15, mientras que el promotor de citomegalovirus es útil para la conducción de los niveles de alta expresión en muchos tipos de la célula13.
    2. Prepare AAV la transfección de la transferencia de plásmido que contiene el gen de interés y un plásmido rep/tapa, con o sin un plásmido helper, en las células HEK293 empaquetado, que suministrar el gen E1 viral, como se describió anteriormente17,18.
      Nota: También es posible la inserción específica en el anfitrión célula genoma19AAV recombinante. El plásmido de transferencia, utilizamos cofilin humano 1 con una terminal C mRFP1 fluorescencia proteína etiqueta (plásmido #50856) clonada en un sinapsina que contienen el promotor AAV plásmido aguas abajo del sensor GCaMP5G calcio20. Un trozo de ADN que codifican la secuencia de péptido auto Hendedoras P2A se inserta por PCR entre GCaMP5G y cofilin-RFP durante la preparación del plásmido de transferencia para proporcionar expresión de ambas proteínas de una sola de transcripción AAV21.
    3. Preparación de vectores recombinantes lentivirus por la transfección del plásmido de transferencia que contiene el gen o ADNc de interés e integración de señales, junto con un lentivirus de la tercera generación embalaje mezcla que divide el viral gag, pol, rev y los genes de vsv-g en tres plásmidos separados22,23.
    4. Para el plásmido de transferencia, utilice un solo paso sistema24 de clonación para ensamblar el promotor sinapsina y cDNA cofilin-R21Q-mRFP (del plásmido #51279) en pLKO.1-GFP (plásmido #30323), con el promotor sinapsina y cofilin-R21Q-mRFP reemplazando el hPGK promotor y cDNA GFP, respectivamente.
    5. Transfectar final plásmido en las células HEK293T por fosfato de calcio como se describió anteriormente23.
    6. Recoger medio de cuatro platos de 10 cm, concentrado a 500 μl con concentradores centrífugos de corte de 150K y almacenar los lentivirus final a-80 ° C en alícuotas pequeñas después de la rápida congelación en nitrógeno líquido. Descongelar una alícuota sólo una vez para infectar las células.
    7. Determinar empíricamente que el volumen de cada tipo de virus preparados para obtener el grado de expresión deseada al establecer un número de segmento diferentes culturas para seguir la expresión de los transgenes después de la infección con diferentes cantidades de virus.
      Nota: Normalmente, se utiliza 1-10 μl de virus por rebanada.

    6. rebanar los tratamientos

    1. Rebanadas de infección con el virus de
      1. Trabajar en un gabinete de seguridad biológico aprobado para el trabajo de virus en el nivel de seguridad biológica adecuado para el vector, mezclar una alícuota del virus (generalmente 1-10 μl) con 0.8 mL de medio completo.
      2. Aspire el medio de la rebanada utilizando una pipeta Pasteur estéril en una trampa de colección que contiene cloro. Una trampa de secundaria utiliza siempre entre la primera trampa y la fuente de vacío.
      3. Sustituir este medio con la alícuota que contiene virus preparada sobre retomar los tubos de cultivo de un estante y colocar en la incubadora.
      4. Después de 2-5 días de incubación de las láminas con el virus en el gabinete de seguridad biológica, quitarlo del medio que contiene el virus con una pipeta de transferencia estéril y colocar en una botella que contiene un agente antiviral aprobado para matar el virus.
    2. Tinción de neuronas con colorante vital
      1. Preparar y guardar alícuotas de colorante vital neuronal fluorescente25 μl 4 congelación rápida de alícuotas en nitrógeno líquido a una concentración de 100 μm y almacenar a-20 ° C. No congelar/descongelar el tinte más de una vez.
      2. Para etiquetar las neuronas para visualización por microscopía de fluorescencia, descongele una alícuota del colorante vital neuronal y diluir 4 ml de medio completo de Neurobasal (concentración final de tinte es 100 nM).
      3. Retire el medio de rebanadas por la aspiración (o con una pipeta si el medio contiene virus) y reemplazarlo con 0,8 mL de medio conteniendo colorante vital neuronal de 100 nM. Regresa las rebanadas al aparato de rodillos en la incubadora.
      4. Después las rebanadas de 2 h de incubación, aspirar el medio que contiene el tinte y reemplazarlo con 0,8 mL de medio completo fresco en un gabinete de seguridad biológica.
        Nota: El etiquetado de las neuronas en rebanadas con colorante vital requiere varias horas de incubación. Las primeras imágenes se toman generalmente 24 h después del tratamiento de tinte. Aunque las neuronas están marcadas específicamente, no hay fluorescencia del fondo que declina durante 2-3 días para dar mejor imagen neuronal. Intensidad del colorante vital declina después de 72 h.
      5. Para seguir cambios en la morfología de la rebanada con el tiempo, cambiarle las rebanadas cada 7 días.

    7. cortar la proyección de imagen

    1. Rebanadas de vista en un microscopio invertido. Para imágenes de fluorescencia más brillantes, a las 24 h antes de la proyección de imagen, cambio de medio de cultivo con medio de Neurobasal A completo sin el indicador de pH rojo de fenol.
      Nota: Para los experimentos divulgados aquí, rebanadas son vistas en un microscopio de fluorescencia confocal de disco giratorio invertido equipado con una codificación lineal x, y etapa con piezo z control y una cámara digital de alta resolución sensible.
    2. El tubo con la cultura de la rebanada que se desliza el soporte del tubo a la medida (figura 5A), que se coloca en el adaptador de fase (figura 5B), para mantener el cubreobjetos perpendicular de los aparatos de tubo de rodillo de transferencia el objetivo y mantener el corte en la misma orientación durante las sesiones de proyección de imagen repetitivas en intervalos largos.
    3. Empuje el control deslizante en el adaptador de etapa apretado en el tubo para mantener el tubo en posición (figura 5B).
    Mantener la temperatura de la rebanada a 35 ° C durante proyección de imagen por el uso de calefacción las tiras y un termorregulador controlador incorporado en el adaptador de por encargo de la etapa (figura 5C).
    Nota: Datos del titular de tubo, adaptador de la etapa, y calentador puede consultarse en: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/.
  • Usando una potencia baja (por ej., 4 X) objetivo y transiluminación de campo brillante, se centran en la cuadrícula photoetched (figura 6A) en el segmento. Para la sesión inicial de la imagen, buscar rápidamente alrededor de la rodaja para localizar y registrar el número de las diversas regiones donde se desea la proyección de imagen de mayor aumento (e.g., cornu ammonis (CA) 1, CA3, giro dentado (DG), etc.).
  • Hacia la etapa de la primera plaza de parrilla que contiene una región de interés. Cambiar a los 20 X objetivo de aire y localizar una marca de referencia (por ej., punta de un número grabado al agua fuerte) (figura 6B).
  • Cambiar a un objetivo más alto de energía (40 X o 60 X), localice la marca fiducial y entonces registro la x y posición y de la etapa. Mover el escenario para encontrar los campos de interés cercanos y registro su x e y se desplaza desde la marca fiducial (figura 6B, flecha). Si lo desea, repita en otras zonas de la red.
    Nota: Estas posiciones off-set de la marca fiducial permiten localización constante de la misma ubicación de cubreobjetos cuando se desliza el segmento aunque la x original, y configuración de la marca fiducial cambia cuando el adaptador de tubo o etapa se quitan y se sustituye.
  • Capturar una imagen Z-stack dentro de cada campo seleccionado usando el control objetivo de microscopio o un control de fase de piezo, si está disponible.
    Nota: Los planos de imagen generalmente se obtienen a intervalos de 0.5 μm a 2 μm, dependiendo del tamaño y la resolución deseada de las características de la imagen. Creación de una imagen 3D de calidad requiere que características se extienden sobre varios planos de adquisición y así para visualizar características más pequeñas, más pequeños intervalos se requieren entre planos.
  • Mantener el total de tiempo para cada rebanada tan corto como sea posible.
    Nota: Sesiones de proyección de imagen la mayoría informaron aquí en 18 min/rebanada. Sin embargo, nosotros hemos reflejado algunas rebanadas de diez o más veces e incluso como largo como 40 min en una sola sesión, sin daño aparente en la supervivencia a largo plazo de la rebanada.

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    Resultados

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Para determinar la precisión con marcas fiduciales pueden utilizarse para crear una nueva imagen de las mismas células dentro de los mismos campos con el tiempo, examinamos rebanadas en photoetched cubreobjetos (figura 6A). Las neuronas se visualizaron mediante tinción con un colorante vital (100 nM para 2 h; no se mancha las células no neuronales), que desaparece de las neuronas con el tiempo sin dañar las células25. ...

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    Discusión

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    El método de tubo de rodillo que se describe aquí permite el cultivo a largo plazo y la proyección de imagen en alta resolución del tejido de cerebro en rodajas. Un problema importante con la técnica de corte aplicado aquí es en el montaje y mantenimiento de las rebanadas. Recubrimientos de cubreobjetos que apoyan la adhesión de la rebanada, promover la rebanada adelgazamiento por aumento de la extensión de neuritas y la migración de las células de la rodaja; así, evitamos la utilización de estos sustratos. La inserción ...

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    Materiales

    Lista de materiales utilizados en este artículo
    NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
    Fondos de platos de cultivo de 15 cmVWR Scientific25384-326
    Tornillos de metal de cabeza Phillips (#10-32)Herrajes Ace de2,5" de largo y 3/16" de diámetro
    Arandelas planas #10máquina de hardware
    (#10-32)de hardware
     Herrajes ACE 5/16", de grosor; 5/8", diámetro del orificio; 1.125",
    OD Tubería de polietileno (5/16"; OD, 3/16"; ID)ACE Herrajescortados a 1.8" de longitud
    Arandela de seguridad #10ACE Herrajes
    Taladro Prensa, 5 velocidades Ace HardwareProTech Modelo 1201
    Nunclon Delta Tubos de lados planos VWR62407-076
    Brocas, 3 mm, 6 mm y 15 mm Herrajes AceDiablo marca freudBrocas para cortar plástico.
    Brocas para madera, 1,5 cm y 1 mmAce Hardware
    Lima de madera, 1/4" redondaAce Harware
    Clips de resorte, 16 mm Soporte a presiónAce Hardware
    Herramienta de desbarbado de cabezal giratorio, 5"Ace Hardware26307
    Lámina de silicona adhesiva (Secure Seal)Grace Bio-Labs6665810,5 mm de espesor
    Perforadora de 6 mmOffice Max
    Perforadora de 12 mmthepunchbunch.com
    70% Etanol
    Fototecado Coverslips, 12 mm de diámetroBellco Glass, Inc.1916-91012
    Quemador
    Etanol
    Agua
    3-aminopropiltrietoxilanoSigma-AldrichA3648
    AcetonaSigma-Aldrich179124
    #5 Pinzas DumontHerramientas de ciencia fina11251-30
    Picadora de pañuelos McIlwainTed Pella, Inc.10180
    Hojas de afeitar de doble filoTed Pella, Inc.121-6
    Papel de filtro WhatmanVWR28450-182Cortado en círculos de 5,8 cm de diámetro
    Policloro-trifluoro-etileno (Aclar)Ted Pella, Inc.10501-10Cortar en círculos de 5,8 cm de diámetro
    #21 Cuchilla quirúrgicaVWR Scientific25860-144
    #5 Pinzas DumontFine Science Tools11251-30
    Espátula, inoxidable con extremo cónicoVWR82027-518
    Gey's Solución salina equilibradaSigma-AldrichG9779 
      GlucosaThermoFisher Scientific15023-02125% (p/v) Solución, 0,2 mm filtro esterilizado
    Plasma de pollo CocalicoBiologicals30-0300-5LRehidratar en agua estéril, centrífuga a 2500 x g 30 min a 4 & deg; C, congele rápidamente las alícuotas en nitrógeno líquido y almacene en   -80 °C.
    Trombina Tópica (Bovina)PfizerThrombin-JMIAlícuotas de congelación rápida en nitrógeno líquido a 1.000 unidades/mL internacionales en diluyente proporcionado y almacenamiento a -80 °C. Utilizar a 250 unidades/mL.
    Sistema de rodillosBellco BiotechSciERA
    FormaModel 3956
    N21-MAXThermoFisher ScientificAR008
    Pluma/Estreptococo (100X)ThermoFisher Scientific15140122
    200 mM GlutaminaThermoFisher Scientific 25030081
    GlucosaThermoFisher Scientific15023-021Solución al 25% (p/v), filtro de 0,2 mm esterilizado
    Neurobasal AThermoFisher Scientific10888-022 Medio completo: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0,625 mL 200 mM de glutamina, 0,180 mL de glucosa al 25%, 0,250 mL 100x pen/estreptococo.
    Embalaje de lentivirus de tercera generaciónLife TechnologiesK4975-00
    159 K Filtros centrífugos de corte (Centricon)EMD Millipore
    Sistema de clonación lentiviral (InFusion)Clonetech
    Plásmidos 30323, 50856, 51279Addgene
    Colorante de viabilidad celular neuronal (NeuO)Tecnologías de células madre1801Descongele una vez y congele rápidamente en 4 y micro; L alícuotas. Almacenar a -20 ° C
    Microscopio invertidoOlympusIX83
    Objetivos de microscopioOlympusair: 4X, 20; aceite: 40X, 60X,
    sistema confocal de disco giratorioYokagawaCSU22
    Cámara microscópica EMCCDFotometríaCascade II
    Codificación lineal (x,y), piezo z etapa superior planaASI
    Microscopio láseres e integraciónIntelligent Imaging Innovations
    HEK293T célulasAmerican Type Culture CollectionCRL-3216
    Human PlasminSigma AldrichP18670.002 U/mL en albúmina sérica bovina al 0.1% (filtro de 0.2 mm esterilizado), congelación rápida en nitrógeno líquido y almacenamiento a -80 °C.
    Tuercas de tornillo de ACEOjales de goma ACEBunsenabsolutonanopura celulares Incubadora de rodillos

    Referencias

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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