Alto rendimiento de secuenciación paralelo a la idoneidad de la medida de Leptospira interrogans Transposon inserción mutantes durante oro sirios Hamster infección

Resumen

Aquí describimos una técnica que combina la mutagénesis de transposon con secuenciación de alto rendimiento para identificar y cuantificar a mutantes de transposon leptoespiral en tejidos después de un desafío de hámsters. Este protocolo puede utilizarse para mutantes de pantalla para la supervivencia y difusión en los animales y también se puede aplicar a estudios en vitro .

Resumen

En este manuscrito, describimos un transposón (Tn-Seq) técnica para identificar y cuantificar a Leptospira interrogans mutantes alterados en gimnasio durante la infección de hámsters sirios dorados de secuenciación. TN-Seq combina mutagénesis de transposon al azar con el poder de la tecnología de secuenciación de alto rendimiento. Los animales se enfrentan con un grupo de mutantes de transposon (entrada piscina), seguido por la recolección de la sangre y los tejidos unos días más tarde para identificar y cuantificar el número de mutantes en cada órgano (piscinas de salida). Las piscinas de salida se comparan con la piscina entrada para evaluar la aptitud en vivo de cada mutante. Este enfoque permite la proyección de un gran número de mutantes en un número limitado de animales. Con pequeñas modificaciones, este protocolo se puede realizar con cualquier modelo animal de la leptospirosis, embalse host modelos como las ratas y la infección aguda como hámsters, así como estudios en vitro . TN-Seq proporciona una poderosa herramienta para pantalla para mutantes con defectos de fitness en vivo y en vitro .

Introducción

Identificación de genes de virulencia de algunas bacterias como Leptospira spp., es difícil debido al número limitado de herramientas genéticas disponibles. Un método comúnmente utilizado es la creación de una colección de mutantes por mutagénesis de transposon al azar seguido de la identificación del sitio de inserción en cada mutante y virulencia pruebas de mutantes de transposon individual en un modelo animal. Este enfoque es lento, costoso y requiere un gran número de animales.

Cuando mutagénesis al azar primero fue desarrollada para el patógeno Leptospira interrogans, genes implicados en virulencia fueron identificado....

Protocolo

PRECAUCIÓN: Las cepas patógenas de Leptospira spp deben manipularse bajo procedimientos de contención de bioseguridad nivel 2 (BSL-2). Debe llevarse equipo de protección personal (EPP). Un gabinete de bioseguridad clase II debe ser utilizado para todas las manipulaciones de patógena Leptospira spp.

1. creación de los transposones mutante biblioteca¹⁵

1. Transferencia de los transposones en Leptospira spp. por conjugación (figura 1)
   1. Inocular un volumen de la fase exponencial cultura de spp de Lepto....

Resultados

Creación de una biblioteca de mutantes de transposon en L. interrogans por verbal requiere una unidad de filtración, como se muestra en la figura 1. Hemos recuperado 100-200 transconjugants de cada apareamiento.

El sitio de inserción del transposón se identifica en cada mutante por secuenciación del producto PCR generado por PCR semi-random que se dirige al final de los transposones y secue.......

Discusión

Aunque se presentan los resultados de nuestro experimento piloto para hámster desafiado por vía intraperitoneal con mutantes de L. interrogans 42¹⁷, esperamos que piscinas más grandes de mutantes pueden ser defendidos por Tn-SS. Porque la frecuencia de transconjugants es baja (100-200 transconjugants/apareamiento), varios apareamientos son necesarias para generar un número suficiente de mutantes para los grandes experimentos de Tn-Seq. Mantener un gran número de mutantes en cultivos líqui.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sulfato de kanamicina de Streptomyces kanamyceticus	Sigma-Aldrich	K4000
Ácido 2,6-diaminopimélico	Sigma-Aldrich	D1377
Espectinomicina diclorhidrato pentahidratado	Sigma-Aldrich	S4014
Microscopio Axio Lab A1 con un condensador de campo oscuro	Zeiss	490950-001-000
DNeasy kit de sangre y tejidos	Qiagen	69504/69506
MinElute PCR Purificación	Qiagen	28004/28006
QIAquick kit de purificación PCR	Qiagen	28104/28106
Modelo 505 Desmembrador sónico	Fisher Scientific	FB-505
2.5" Bocina de copa	Fisher Scientific	FB-4625
Bead Ruptor 24	Omni International	19-010	Paso 3.1.2.4
Desoxinucleotidil transferasa terminal	Promega	M828C
Mezcla maestra Phusion	Thermo Scientific	F531	Preparación de bibliotecas genómicas, paso 3.4.
DreamTaq Master Mix	Thermo Scientific	K9011/K9012	Identificación del lugar de inserción del transposón, paso 1.2.
dCTP	Thermo Scientific	R0151
ddCTP	Affymetrix/ USBProductos	77112
T100 Termociclador	BioRad	1861096
Qubit 2.0	fluorómetro Invitrogen	Q32866	paso 3.6.
Kit de ensayo Qubit dsDNA HS	: Invitrogen	Q32851/Q32854	paso 3.6.
Tubos de ensayo Qubit life	technologies	Q32856	paso 3.6.
PBS pH 7.2 (1X)	Gibco	20012-027 20012-050
Bisturí desechable No10	Feather	2975#10
Plástico K2 EDTA 2 ml tubos	BD vacutainer	367841
jeringa U-100 con 26G x & frac12; ” aguja	BD vacutainer	329652	desafío IP, paso 2.2.1.
Jeringa de punta Luer-Lok de 3 mL BD	vacutainer	309657	Punción cardíaca, paso 2.4.2.
Aguja de 25G X 5/8"	BD vacutainer	305901	Punción cardíaca, paso 2.4.2.
Base de vidrio fritado de 25 mm con tapón	EMD Millipore	XX1002502	Sistema de unidad de filtración, paso 1.1.7.
Abrazadera de resorte de aluminio de 25 mm	EMD Millipore	XX1002503	Sistema de unidad de filtración, paso 1.1.7.
Embudo de vidrio de borosilcate de 15 ml EMD	Millipore	XX1002514	Sistema de unidad de filtración, paso 1.1.7.
Matraz Erlenmeyer de brazo lateral de 125 ml	EMD Millipore	XX1002505	Sistema de unidad de filtración, paso 1.1.7.
Filtro de acetato-celulosa VVPP (tamaño de poro 0,1 mm; diámetro 25 mm)	EMD Millipore	VVLP02500

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