Artículo de método

Un método conveniente para la extracción y análisis con cromatografía líquida de alta presión de los neurotransmisores catecolaminas y sus metabolitos

DOI:

10.3791/56445

⸱

1 de marzo de 2018

 ,  ,  ,  , 
1School of Public Health of Southeast University, Laboratory of Environment and Biosafety Research Institute of Southeast University in Suzhou, 2Key Laboratory of Child Development and Learning Science (Ministry of Education), School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University, 3School of Public Health, Tianjin Medical University, 4British Columbia Academy, Nanjing Foreign Language School

En este artículo

Resumen

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Presentamos una cómoda extracción en fase sólida acoplada a cromatografía líquida de alta presión (HPLC) con detección electroquímica (ECD) para la determinación simultánea de los tres neurotransmisores monoamina y dos de sus metabolitos en la orina de los bebés. También identificamos el metabolito MHPG como un potencial biomarcador para el diagnóstico precoz de daño cerebral para los niños.

Resumen

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La extracción y análisis de los neurotransmisores catecolaminas en fluidos biológicos es de gran importancia en la evaluación de la función del sistema nervioso y las enfermedades, pero su medida exacta es todavía un reto. Muchos protocolos se han descrito para la medición de neurotransmisores por una variedad de instrumentos, incluyendo la cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Sin embargo, existen deficiencias, tales como operación complicada o difícil de detectar múltiples objetivos, que no se puede evitar, y en la actualidad, la técnica de análisis dominante sigue siendo HPLC juntada con sensible electroquímica o fluorimétrica detección, debido a su alta sensibilidad y buena selectividad. Aquí, se describe un protocolo detallado para el pretratamiento y la detección de catecolaminas con cromatografía líquida de alta presión con detección electroquímica (HPLC-ECD) en muestras de orina real de neonatos, mediante electrospun nanofibras compuesto compuesto de éter de corona poliméricos con el poliestireno como adsorbente, también conocido como el método de extracción (PFSPE) de la fase sólida de fibra lleno. Mostramos cómo orina muestras pueden ser precleaned fácilmente por una columna de fase sólida llena de nanofibras, y cómo los analitos en la muestra pueden enriquecerse rápidamente, desorbida y detectado en un sistema ECD. PFSPE simplifica notablemente los procedimientos de pretratamiento para las muestras biológicas, lo que permite disminución de tiempo, costo y reducción de la pérdida de objetivos.

En general, este trabajo ilustra un protocolo simple y conveniente para la extracción en fase sólida acoplada a un sistema de HPLC-ECD para determinación simultánea de los tres neurotransmisores monoamina (norepinefrina (NE), epinefrina (E), dopamina (DA)) y dos de sus metabolitos (3-metoxi-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) y ácido 3, 4-dihydroxy-fenilacético (DOPAC)) en la orina de los bebés. Se aplicó el protocolo establecido para evaluar las diferencias de catecolaminas urinarias y sus metabolitos entre neonatos de alto riesgo con daño cerebral perinatal y controles sanos. Análisis comparativo reveló una diferencia significativa de MHPG urinario entre los dos grupos, indicando que los metabolitos de catecolaminas pueden ser un marcador importante candidato para el diagnóstico precoz de casos en riesgo de daño cerebral en recién nacidos.

Introducción

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Neurotransmisores de catecolamina y su contenido de metabolitos en los fluidos corporales puede afectan la función neuronal y afectar el equilibrio de los Estados de la respuesta a estímulo a una gran parte1. Anomalías que puede causar una variedad de enfermedades, tales como pheochromacytoma, ganglioneuroma, neuroblastoma y trastornos neurológicos1,2. La extracción y la determinación de catecolaminas en fluidos corporales es significativo para el diagnóstico de las enfermedades relevantes. Sin embargo, las catecolaminas en muestras biológicas existen en bajas concentraciones y se oxida....

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Protocolo

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Se obtuvo consentimiento informado de los padres, y se obtuvo la aprobación de la Junta de revisión institucional para el estudio. El estudio se realizó según el código de ética de la Asociación Médica Mundial (declaración de Helsinki) para experimentos con seres humanos. Cuidadores de todos los participantes siempre consentimiento para ser incluidos en el estudio. Aprobación del Comité ético del Hospital Zhongda, afiliado con la Universidad del sureste, también se obtuvo.

1. preparación de las soluciones necesarias para la extracción y la determinación de catecolaminas y columnas

  1. Preparar la columna PFSPE. 1-2 mg de nanofibras PC....

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Resultados

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Este protocolo es un método simple y conveniente de PFSPE pretratar las muestras de orina y enriquecer las cinco catecolaminas para la detección mediante el sistema de HPLC-ECD; en la figura 1muestra un diagrama del proceso. El protocolo incluye principalmente cuatro pasos activación, carga, enjuague y liberador - junto con una pequeña cantidad de nanofibras PCE-PS y un dispositivo de extracción en fase sólida simple. La morfología de nanofibras PCE-PS se eva.......

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Discusión

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El método PFSPE propuesto en este documento puede ser significativa y significativa con respecto a su rapidez, sencillez y comodidad. Los adsorbentes utilizados en el protocolo son nanofibras electrospun, que tienen una proporción de volumen de área de superficie alta y por la adsorción de los analitos con alta eficiencia. El procedimiento sólo necesita unos pocos miligramos de nanofibras y un pequeño volumen de disolvente eluant y no requiere un paso de evaporación para concentrar los analitos. Aquí, hemos presentado un.......

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Divulgaciones

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Los autores certifican que no existe ningún conflicto de interés con cualquier entidad financiera sobre el material discutido en este artículo.

Agradecimientos

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Este estudio fue apoyado por la nacional ciencia Fundación de China (No.81172720, Nº 81673230), el Departamento de tecnología (Nº y Social desarrollo investigación programa de Jiangsu provincia de ciencia BE2016741), ciencia y tecnología de China la Administración General de supervisión de calidad, inspección y cuarentena (2015QK055), el programa del proyecto abierto del laboratorio clave de ciencia del Ministerio de educación, de aprendizaje y desarrollo del niño Universidad del sureste (CDL-2016-04). Reconocemos sinceramente Song Yuan y Ping Liu que nos ayudaron en la recogida de muestras.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
200 y micro; Lde pipeta para contener nanofibras
PCE-PS material depara la extracción de PFSPE
varilla de acero (aproximadamente 0,5 mm de diámetro)llene las nanofibras en la columna
jeringa de plástico hermética al gas (5 ml)comprima la solución en el extremo de la punta
metanolSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd67-56-1
ácido difenilborínico 2-aminoetiléster (DPBA)Sigma-Aldrich.IncA-106408reactivo complejo
norepinefrina(NE)Sigma-Aldrich.IncA-9512analito
3-metoxi-4-hidroxifenilglicol(MHPG)Sigma-Aldrich.IncH1377analito
epinefrina(E)Sigma-Aldrich.Inc100154-200503analito
3, 4- Ácido dihidroxifenilacético(DOPAC)Sigma-Aldrich.IncD-9128analito
dopamina(DA)Sigma-Aldrich.IncH-8502analito
3, 4-dihidroxibencilamina bromuro (DHBA)Sigma-Aldrich.Incetiquetainterior
858781 acetonitriloSigma-Aldrich.Inc75-05-8ácido
fosfórico en fase móvil y elurianteSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7664-38-2eluriante
Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd69-93-2
creatininaSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd60-27-5
citrato trisódicoSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd6132-04-3artificial
KClSinopharm Chemical ReagentCo. , Ltd7447-40-7orina artificial
NH4ClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd12125-02-9orina artificial
NaHCO3Sinopharm Chemical ReagentCo., LtdSWC0140326orina artificial
C2Na2O4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd62-76-0orina artificial
NaSO4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7757-82-6orina artificial
fosfato de hidrógeno disódicoSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10039-32-4
ureaSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd57-13-6orina artificial
NaClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7647-14-5orina artificial
MgSO4.7H2OSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10034-99-8artifical
orina CaCl2Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10035-04-8artificial
HClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7647-01-0artificial
ácido cítricoSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd77-92-9artificial y fase móvil
Sal disódica EDTASinopharm Chemical ReagentCo., Ltd34124-14-6fase móvil
ortofosfato de sodio monometálicoSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7558-80-7artificial y
sal sódica de ácido 1-heptanosulfónicoSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd22767-50-6
hidróxido de sodio deSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd1310-73-2 columna de
ácido fenilborónico de fase móvil (columna PBA)Aglilent12102018extracción de PBA
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Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Elhwuegi, A. S. Central monoamines and their role in major depression. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 28, 435-451 (2004).
  2. Da, C. F., Ngoabdalla, S., Houzel, J. C., Rehen, S. K. Murine model for Parkinsons disease: From 6-OH dopamine lesion to behavioral test. J. Vis. Exp. (35), e1376(2010).
  3. Varley, H., Gowenlock, A. H.

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