El ensayo cometa es un método eficiente para detectar daños en el ADN como sola y doble hebra de ADN se rompe. Se describen ensayos cometa alcalino y neutral para medir el daño del ADN en células de cáncer para evaluar el efecto terapéutico de la quimioterapia.
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Artículo de método
Evaluar In Vitro el daño de ADN utilizando el ensayo cometa
En este artículo
Resumen
Resumen
Daños en el ADN es un fenómeno común para cada celda durante su vida útil y se definición como una alteración de la estructura química de la DNA genomic. Tratamientos contra el cáncer, tales como radio y quimioterapia, introduce gran cantidad de daño de ADN adicional, llevando a la detención del ciclo celular y apoptosis para limitar la progresión del cáncer. Evaluación cuantitativa del daño de la DNA durante la terapia experimental del cáncer es un paso clave para justificar la eficacia de un agente genotóxico. En este estudio, nos centramos en un análisis de electroforesis unicelular, también conocido como el ensayo del cometa, que puede cuantificar solo y doble cadena ADN rompe en vitro. El ensayo cometa es un método de cuantificación de daños de ADN que es eficiente y fácil de realizar, y tiene demandas de tiempo y dentro de presupuesto bajo y alta reproducibilidad. Aquí, destacamos la utilidad del ensayo cometa para un estudio preclínico por evaluar el efecto genotóxico de la terapia de combinación de olaparib/temozolomida a las células de glioma U251.
Introducción
El análisis del cometa primero fue desarrollado por Ostling y Johanson en 1984 demostrando que la migración del ADN de fragmentos de los núcleos en un estado neutro1. La técnica fue desarrollada más tarde por Singh et al., mostrando que una condición alcalina aumenta sustancialmente la especificidad y la reproducibilidad del ensayo2. Desde entonces, el análisis del cometa neutro se utiliza sobre todo para detectar roturas de la DNA de doble cadena, mientras que el ensayo del cometa alcalino es más sensible para cantidades más pequeñas de daño en el ADN, incluyendo solo y doble cadena de ADN rompe, sitios álcali ....
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Protocolo
1. preparar reactivos
- 1 x PBS
- diluir 100 mL 10 x PBS con 900 mL dH 2 O y ajustar el pH a 7.4 con un medidor de pH. Almacenar a temperatura ambiente.
- Solución de lisis (LS)
- preparar 2.5 M NaCl, 100 mM disódico EDTA, 10 mM Tris base y 200 mM NaOH en 900 mL dH 2 O; comúnmente tarda unos 20 minutos para permitir que la mezcla se disuelva completamente. Ajustar el pH a 10 con un medidor de pH. Agregar 1% Sodio Lauril sarcosinato y 1% Tritón X-100 y ajustar el volumen final a 1000 mL. Refrigerar a 4 ° C durante al menos 30 minutos antes de su uso.
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Resultados
El presente Protocolo describe un flujo de trabajo paso a paso para la ejecución del ensayo de cometa y análisis de datos (figura 1). Resultados de los ensayos de comet alcalino y neutro mostraron que la cola del cometa de doxorrubicina-U251 las células tratadas (1 μm, 20 h) era más largo y tenía mayor intensidad de ADN, lo que sugiere una sustancial acumulación de ADN fragmentado debido a la quimioterapia (figura 2).
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Discusión
El ensayo cometa es una herramienta eficaz para medir solo y doble cadena roturas del ADN a nivel celular. El ensayo se ha aplicado extensamente como un "estándar de oro" en los estudios sobre genotoxicidad y biomonitoreo13, que van desde lesiones de base ADN reticulaciones, desarrollo de fármacos y sitios sensibles de álcali. En el presente estudio, hemos mostrado dos protocolos distintos paso a paso para los ensayos de comet alcalino y neutro, respectivamente. Combinación de electroforesis unice.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por el programa de investigación intramuros de los NIH, el NCI y el CCR. Todos los autores recibieron beca de investigación intramuros de NIH, NCI y CCR.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10x PBS(Ca++, Mg++ libre) | TEKnova | P0196 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| EDTA | TEKnova | E0308 | |
| Trizma base | Sigma T1503 | ||
| NaOH | Sigma | 72068 | |
| Lauril sarcosinato de sodio | Sigma | L7414 | |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
| Acetato de sodio | Sigma | 32318 | |
| Ácido acético glacial | Sigma | 695092 | |
| Acetato de amonio | Sigma | A1542 | |
| SYBR | Green Invitrogen | S33102 | |
| Low punto de fusión agarosa | Invitrogen | 16520 | |
| Agarosa | Invitrogen | 16500 | |
| 95% etanol | WARNER-GRAHAM | #64-17-5 | |
| Tripsina | GIBICO | 25300-054 | |
| Name | Company | Número de catálogo | Comentarios |
| Consumibles | |||
| portaobjetos de tejido de vidrio | ELECTRÓNICA MICROSCOPY SCIENCES | 63422-11 | |
| Kimwipes | KIMberly-Clark | ||
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL DENVILLE Puntas | DENVILLE | ||
| SHARP | |||
| strong>Name | Company | Número de catálogo | >Comentarios |
| Equipos | |||
| Fuente de alimentación | Bio-Rad | ||
| Incubadora | Quincy Lab Modelo | 12-140E | |
| Microscopio fluorescente | Zeiss | LSM700 | |
| Micropipeta | Eppendorf |
Referencias
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. ....
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Reimpresiones y permisos
