Péptidos de penetración celular biotinilado para estudiar interacciones de proteínas intracelulares

Las interacciones proteína-proteína son esenciales para una gran variedad de procesos celulares. Para comprender estos procesos, se requieren métodos para la identificación de las interacciones de proteínas en el complejo entorno intracelular. Uno de los métodos más utilizados para identificar a socios de la interacción de una proteína es utilizar esa proteína o un péptido mimético de una parte de esa proteína como cebo en los experimentos de desplegable de afinidad seguidos de detección de proteínas. El sistema avidina-biotina se utiliza con frecuencia debido a la alta afinidad, especificidad e interacción estable entre avidina y la biotina de^1,2. Generalmente, la biotina es covalentemente al cebo (proteína o péptido) y después de un período de incubación con los lysates de la célula para permitir el establecimiento de interacciones, el cebo biotinilado a sus socios intracelulares es derribado con avidina o avidina derivados conjugan con granos de apoyo. Entonces, se detectan las interacciones proteína cebo después de lavado y elución análisis desnaturalizando electroforesis seguida de Western blot. Uno de los problemas de esta técnica es que las interacciones entre la proteína de interés y sus socios intracelulares tienen lugar fuera del contexto celular. Esto es especialmente importante para las interacciones involucradas en vías de transducción de señal porque ocurren en lugares específicos intracelulares, son transitorios y típicamente son realizadas por proteínas no abundantes. Por lo tanto, dentro de los lysates de la célula estas interacciones se pueden enmascarar por otros más abundantes proteínas o por proteínas que generalmente no están en las inmediaciones.

Péptidos de penetración celular (CPPs) son péptidos cortos (≤ 40 aminoácidos), compuestas en su mayor parte por aminoácidos catiónicos que son capaces de transportar una amplia gama de moléculas en casi cualquier celular³. Cargas tales como proteínas, DNA plasmídico, siRNA, virus, agentes de imagen y diferentes nanopartículas han sido conjugadas a CPPs y eficientemente internalizada^4,5. Debido a esta capacidad de transporte son también conocidos como dominios proteína de transducción de señales (PTDs), membrana translocan secuencias (MTSs) y péptidos troyanos. Entre la CPPs, el TAT péptido de la proteína del transactivator de VIH TAT⁶ ha sido uno de los más ampliamente estudiados ^7,8,9. TAT es un nonapéptido que contiene 2 residuos de lisina y arginina 6 y por lo tanto es altamente catiónico. Sustitución de estudios ha demostrado que la carga positiva neta de TAT es necesaria por interacciones electrostáticas con las membranas del plasma de las células eucariotas y su posterior interiorización¹⁰. Semejantemente a otros CPPs, TAT cargado positivamente fuertemente se une electrostáticamente a las varias cargado negativamente especies presentes en la superficie extracelular de las membranas celulares, incluyendo los grupos cabeza del lípido, glicoproteínas y proteoglicanos^{3 , 10}. la bioactivos de cargas transportadas por TAT ser inmediatamente libres en el citosol para llegar a sus socios intracelulares.

Aquí presentamos un método que combina el CPP TAT con biotina para el estudio de las interacciones intracelulares. El objetivo es diseñar cebos de penetrar en la célula mediante la fusión de la biomolécula blanco al TAT y a la biotina. La principal ventaja de esta propuesta es que las interacciones entre el cebo y sus socios llevará a cabo dentro de su contexto celular. Para demostrar la eficacia de este método que utiliza como cebo una pequeña secuencia de la proteína Cx43 que se ha reportado interacción intracelular con el proto-oncogene c-Src^11,12,13. Cx43 es una proteína integral de membrana que se expresa ampliamente en astrocitos¹⁴regula en gliomas de alto grado, el tumor maligno más común del sistema nervioso central^{15,16,17 ,18}. Ha sido demostrado previamente que la región de Cx43 que interactúa con el c-Src (aminoácidos 266-283 de Cx43 humana; PubMed: P17302) fundido a TAT (TAT-Cx43_266-283) inhibe la actividad oncogénica del c-Srcin las células de glioma y células de glioma madre (GSCs)^19,20,21. Para diseñar el cebo intracelular, Cx43_266-283 ha fundido a TAT en el N-terminal (TAT-Cx43_266-283) y a la biotina en la terminal C (TAT-Cx43_266-283- B). Esta estrategia se ha utilizado con éxito en el glioma de rata C6 línea de celular para identificar c-Src, c-terminal Quinasa Src (CSK) y fosfatasa y tensina (PTEN) de homólogo como intracelulares asociados de esta región de Cx43²⁰. Aquí, describimos este método probar su eficacia en humanos GSCs, que son muy relevantes para el tratamiento de glioma, pero mucho más difícil transfectar que las células de glioma de tallo no.

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo en la Universidad de Salamanca.

1. las células

1. Dos días antes de comenzar el procedimiento, la placa de las células a la densidad requerida a ser confluentes el día del experimento. La placa de las células en placas o frascos. Sin embargo, la extracción de proteína será más fácil de las placas. Es conveniente preparar por lo menos 4 placas de 78 cm² o 2 frascos de 150 cm² por condición por experimento, para asegurarse que los resultados sean coherentes.
2. En este estudio, placa humana G166 GSCs en 4 frascos de 150 cm², cultivados en células de RHB-A suplementado con 2% B27, 1% N2, 20 ng/mL EGF y b-FGF descrito por Pollard et al.²². Proceso cuando se alcanza la confluencia. Por ejemplo, cuando las células 5 x 10⁶ G166 fueron plateadas en un matraz de 150 cm² , se procesaron 2 días después de la galjanoplastia.

2. biotinilado CPPs

1. Gira los frascos que contienen el liofilizado biotinilado CPPs (BCPPs) en 8200 x g durante 30 s, para evitar algunos del polvo restante en la tapa. Incluir un control BCPP para asegurarse de que las interacciones encontradas son específicas de la secuencia de destino. En este estudio, el control BCPP era TAT-biotina (TAT-B) y el tratamiento BCPP era TAT Cx43_266-283- B. Podrían utilizarse otros controles, tales como TAT fragmentos fusionados para revueltos o mutados bond a la biotina.
2. Disolver el BCPPs en el medio de cultivo correspondiente a la solución indicada por el fabricante; por ejemplo, para obtener una solución de 2 mg/mL BCPP para tratar GSCs Añadir 0,5 mL de medio de cultivo de GSC a un vial que contiene 1 mg de lo BCPP. Vórtice y asegúrese de que el péptido se disuelve bien.

3. tubos

Nota: Prepare por lo menos doce tubos de 1.5 mL por condición necesaria en la sección 7.

1. Marque los primeros 3 tubos por condición. Tengan el volumen total de Lisados celulares obtenidos en el paso 6.4.
2. Marque en 3 tubos por condición. Estos tubos tienen el primer sobrenadantes obtenidos tras paso de lisis y girando los lisados celulares, 7.2.
3. La marca B en 3 tubos por condición. Estos tubos tendrá una pequeña alícuota de sobrenadante de la primera. Estos lisados servirá como las muestras de Western blot en paso 7.3.
4. La marca C en 3 tubos por condición. Estos tubos tienen los sobrenadantes obtenidos tras el desplegable con NeutrAvidin, paso 7.7.
   Nota: Esto es importante en caso de que el Western blot no mostraron ninguna señal de proteínas, lo que significa las proteínas no fueron tiradas o se perdieron en algún paso del procedimiento. Si esto fuera la situación, repita el proceso para bajar las proteínas.

4. celular tratamiento con las BCPPs

1. Aspire el medio de cultivo.
2. Vuelva a colocar el correspondiente volumen de medio fresco necesaria para incubar las BCPPs en el menor volumen posible de medio según los tiempos de incubación. Es muy importante que en cualquier caso, el medio cubre completamente toda la superficie de la placa/frasco para que las células no se resequen, por ejemplo, 6 mL por 150 cm² para una incubación de 30 min.
3. Añadir el volumen de la solución madre de BCPP a las culturas de célula para llegar a la concentración que ha demostrado para ser eficaz. En este estudio 50 μm TAT Cx43_266-283- B ha demostrado para reducir la proliferación de GSC.
   1. Por lo tanto, añadir 92,8 μl de 2 mg/mL de Cx43 TAT_266-283- B (MW = 3723.34 g/mol) por mL de medio de cultivo para obtener una concentración final de 50 μm TAT Cx43_266-283- B. Si el volumen a añadir es diferente de péptidos de control, con medio de cultivo hasta el mismo volumen final. Por ejemplo, 49,1 μl TAT-B (MW = 1914.31 g/mol) más 43,7 μl de medio de GSC se agregaron por mL de medio de cultivo para obtener una concentración final de 50 μm TAT-B.
4. Colocar las células en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO₂ durante 30 minutos para asegurarse de que las interacciones entre lo BCPP y sus socios intracelulares ocurren. Si la interacción dura más, incubar por más tiempo o ajustar tiempos en caso de que la experimento consistió en un curso de tiempo. Además, la interacción de interés puede ser promovida o impedida por estimulantes diferentes vías de señalización intracelulares.

5. tampones y soluciones.

1. Preparar pH PBS 7.4: 136 mM NaCl; 2,7 mM de KCl; 7,8 mM Na₂HPO₄·2H₂O; 1,7 mM KH₂PO₄.
2. Preparación de buffer de lisis de proteínas: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 137 mM NaCl, 1% IGEPAL, antes de usar, agregar lo siguiente: 1/100 (v/v) proteasa inhibidor de Cocktail, 1 mM de fluoruro de sodio, 1 mM Phenylmethanesulfonyl fluoruro (PMSF) y 0,1 mM ortovanadato de sodio.
3. Preparar el Tampón Laemmli: (4 x: 0.18 M Tris-HCl pH 6.8; 5 M glicerol; 3,7% SDS (p/v); 0,6 M β-mercaptoetanol o 9 mM DTT, azul de bromofenol 0.04% (v/v) (BB)).

6. extracción de proteínas

Nota: Extracción de proteínas se realizó como se describió anteriormente^20,23. Llevar a cabo esta sección del procedimiento a 4 ° C.

1. Aspire completamente el medio de cultivo.
2. Lavado 3 x 10 mL de fosfato helada con tampón salino (PBS) por 150 cm² muy cuidadosamente para evitar la separación de la célula.
3. Para obtener la célula lisada, añadir 3 mL de tampón de lisis por 150 cm² y bien raspar la superficie utilizando un raspador celular. El placa/el matraz a 45 grados de inclinación hará más fácil reunir los lysates de la célula en sus tubos correspondientes.
4. Vierta 1 mL de lisado por el tubo celular en tres tubos de 1,5 mL. Estos tubos se marcará con la condición y la repetición como se indica en el paso 3.1.

7. pull-down

1. Centrifugar los tubos de 1,5 mL a 11.000 x g por 10 min a 4 ° C.
2. Transferir el sobrenadante a nuevos tubos (A).
3. Tomar una alícuota de este sobrenadante por condición a tubos diferentes (B), es decir, 50 μL por tubo. Añadir 4 x Laemmli buffer (a 16.6 μl para 50 μl de lisado) y congelar a-20 ° C. Estos lisados servirá muestras de inmunoblot como de costumbre.
4. Homogeneizar muy bien el NeutrAvidin Agarose por agitación suave. Cortar las puntas de las pipetas para aumentar su diámetro y mejorar el uso de los granos.

8. Western Blot

Nota: Western blotting se realizó como se describió previamente²⁴.

1. Volumen equivalente de cada muestra por carril en midigels Bis-Tris (4-12%) en un sistema de electroforesis de Midi-célula de carga.
2. Proteínas de Transblot usando un sistema Blot seco en una pila normal de nitrocelulosa.
3. La membrana con el 10% de la mancha Ponceau durante 10 minutos.
4. Lavar las membranas 3 x 5 min con 5 mL de TTBS.
5. Bloquear las membranas con leche 7% en TTBS durante 1 h con agitación suave en tubos o cajas pequeñas. Asegúrese de que el volumen utilizado es suficiente para cubrir las membranas y que no seque, es decir, 40 mL por membrana midi todo.
6. Lavar 3 veces, 5 minutos con 5 mL de TTBS.
7. Incubar durante una noche a 4 ° C con anticuerpo primario contra la proteína de interés con agitación suave.
8. Lavar 3 veces, 5 minutos con 5 mL de TTBS.
9. Incubar la membrana a temperatura ambiente con el correspondiente conjugado con peroxidasa de anticuerpo secundario en TTBS durante 1 hora.
10. Lavar 3 veces, 5 minutos con 5 mL de TTBS.
11. Desarrollar con un sustrato quimioluminiscente en un sistema de quimioluminiscencia.

9. resolución de problemas

1. Si después de desarrollar el Western blot ninguna de las muestras no mostraron ninguna señal en absoluto para las proteínas, compruebe el Ponceau.
   Nota: La membrana de Ponceau debe mostrar definida y cargado de numerosas bandas a lo largo de los carriles. Si las bandas no son muy sensibles, la cantidad de proteínas cargada puede no ser suficiente o la transferencia puede haber ido mal. Considerar repetir el Western blot.
2. Si no hay ninguna mancha en la membrana de Ponceau en cualquier carril, repita todo el procedimiento desde el paso 7.4 en los tubos (C).
3. Si después de desarrollar el Western blot, una señal de la proteína es muy débil pero el Ponceau mostró proteínas, incubar nuevamente la membrana con el anticuerpo primario por más tiempo. Si la señal sigue siendo bastante débil, incubar nuevamente a temperatura ambiente.

10. otras técnicas usadas en este artículo

1. Inmunocitoquímica de BCPPs
   1. Fijar las células en paraformaldehído al 4% (0,2 mL por cm²) por 20 min.
   2. Lavar 3 veces, 5 minutos con PBS (0,2 mL por cm²).
   3. Aplicar el anticuerpo correspondiente (por lo menos 0,15 mL por cm²) diluido en solución de anticuerpo a la concentración indicada del fabricante contra la proteína de interés durante la noche a 4 ° C.
   4. Incuban con un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo (0,15 mL por cm²) por 2 h a temperatura ambiente.
   5. Repita los pasos 10.1.2-10.1.4 con otros anticuerpos contra las proteínas de sus interés. Tenga cuidado de no hacer uso de la misma especie para diferentes anticuerpos primarios o mismo fluoróforos de longitud de onda para los anticuerpos secundarios.
   6. Monte las células usando el reactivo antifade (0,005 mL por cm²).
   7. Analice en un microscopio de fluorescencia, conectado a una cámara digital.
2. Ensayo MTT
   1. Las células a 37 ° C en placas de 24 pocillos de cultivo.
   2. Incubar las células en la oscuridad durante 75 min con 0.15 mL del medio de cultivo por cm² que contiene 0,5 mg/mL MTT.
   3. Aspire el medio e incubar las células durante 10 min en la oscuridad con dimetil sulfóxido (0,25 mL por cm²) con agitación suave.
   4. Medir la absorbancia a una longitud de onda de 570 nm utilizando un lector de microplacas.

Antes de usar BCPPs para estudio de la interacción intracelular, es fundamental para comparar los efectos de BCPP vs CPP para validar los resultados obtenidos con BCPP. Por lo tanto, para estudiar si la inclusión de la biotina modifica la actividad de la secuencia de destino, en primer lugar analizamos el efecto de Cx43 TAT266-283- B en comparación con TAT Cx43266-283 G166 GSCs morfología. Para ello, se realizaron algunos análisis de inmunofluorescencia de dos proteínas citoesqueléticas, F-actina y α-tubulina después de 24 h de tratamiento. La figura 1 que muestra G166 GSCs en presencia de 50 μm TAT Cx43266-283 o TAT-Cx43266-283- B adquieren una forma más redondeada en comparación con las prolongaciones celulares alargadas y ampliadas que se muestra en los controles (TAT o TAT-B). De hecho, la Figura 1b muestra que filamentos de actina están montados sobre todo como redes de actina cuando las células fueron tratadas con TAT Cx43266-283 o TAT-Cx43266-283- B mientras que forman más haces de actina en las células control (tratado con TAT o TAT-B)25. Por el contrario, distribución de α-tubulina no varía entre las diferentes condiciones. Estos resultados mostraron que la presencia de biotina no modificó el efecto de la secuencia de destino en la morfología del GSCs G166. En anteriores estudios20,21, nos mostró que el TAT-Cx43266-283 redujo G166 GSCs proliferación. En este estudio, investigamos si TAT Cx43266-283- B ejerce los mismos efectos en el crecimiento como TAT-Cx43266-283. Para ello, analizamos la proliferación G166 GSCs por ensayo MTT después de 72 h de tratamiento. El ensayo MTT es un ensayo colorimétrico para evaluar la actividad metabólica de la célula. MTT se metaboliza por las enzimas de oxidorreductasas NAD (P) H en la mitocondria, lo que refleja el número de células viables presentes. La figura 2 muestra que la reducción en la viabilidad de las células G166 GSCs no es significativamente diferente cuando las células fueron tratadas con 50 μm TAT Cx43266-283 o 50 μm TAT Cx43266-283- B. De hecho, ambos disminución significativa de la proliferación G166 GSCs en comparación con el control, TAT o TAT-B.

Una vez que confirmamos que el efecto de la secuencia Diana en G166 GSCs (TAT-Cx43266-283) no fue modificado por la inclusión de la biotina en la terminal C (TAT-Cx43266-283- B), investigamos los socios intracelulares de esta secuencia siguiendo el protocolo descrito en este estudio (figura 3). Porque han participado en el mecanismo de internalización de TAT26caveolas, se analizó la presencia de caveolina-1 (Cav-1) en los desplegables. Análisis de Western blot (figura 4) mostraron que TAT-B y TAT-Cx43266-283- B interactuar con Cav-1. Sin embargo, la capacidad de Cx43 TAT266-283- B contratar c-Src, PTEN y CSK es más fuerte que la encontrada con TAT-B. Quinasa de adhesión focal (FAK) es un sustrato de c-Src que no se ha demostrado que interactuar con la Cx43. De hecho, FAK no mostró ninguna interacción significativa con TAT-B o TAT-Cx43266-283- B.

Para confirmar la interacción entre TAT Cx43266-283- B y c-Src, GSCs G166 se incubaron con 50 μm TAT Cx43266-283- B por 30 min y su localización fue seguida con estreptavidina fluorescente microscopia confocal (figura 5 ). Nuestros resultados mostraron que la distribución intracelular de Cx43 TAT266-283- B está cerca de la membrana plasmática (demostrada por la coloración de fosfatidilserina) y coincide con el de c-Src. De hecho, los análisis de colocalización revelaron algunos puntos de co-localización (blanco) entre TAT Cx43266-283- B y c-Src de la imagen de fusión. En consecuencia, la microscopia confocal estudios confirman los resultados obtenidos con el protocolo de desplegable BCPP descrito en este estudio.

Figura 1: Efecto de BCPP y CPP sobre la morfología de la GSC.
G166 GSCs era plateados con una densidad baja (2 x 104 células / cm2) y después de 24 h se incubaron con control μm 50 CPP (TAT), control BCPP (TAT-B), CPP (TAT-Cx43266-283) el tratamiento o tratamiento BCPP (TAT-Cx43266-283- B) . a) F-actina (rojo), α-tubulina (verde) y combinadas + DAPI immunostaining del mismo campo mostrando G166 GSCs morfología. Barra = 50 μm. b) immunostaining de F-actina que la distribución diferente de la F-actina en G166 GSCs después de la incubación por 24 h con 50 μm CPP (TAT) de control o control BCPP (TAT-B) en comparación con el tratamiento de μm 50 CPP (TAT-Cx43266-283) o BCPP (TAT- de la Cx43 266-283-B). Barras = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Efecto de BCPP y CPP sobre la viabilidad de la GSC.
GSCs G166 se plateado en 5500 células/cm2 en multiwell 24 placas y se incubaron con 50 μm control péptidos, CPP (TAT) o BCPP (TAT-B), o 50 μm tratamiento péptidos CPP (TAT-Cx43266-283) o BCPP (TAT-Cx43266-283- B). La viabilidad celular se analizó mediante un análisis MTT después de 72 h. Los resultados se expresan como absorbancia del MTT y son la media ± SEM de por lo menos 3 experimentos (++ p˂0.01 vs control. ** p˂0.01, *** p˂0.001 vs TAT o TAT-B; unidireccional ANOVA withTukey después del ensayo). Tenga en cuenta que no existen diferencias significativas entre los efectos de la CPPs vs BCPPs. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Diagrama de protocolo.
Representación gráfica paso a paso del procedimiento como se describe en la sección "Protocolo", desde la incubación de las BCPPs hasta las BCPPs eluídas y sus proteínas interactuantes obtained.1) incubar las células en cultivo con BCPPs en la concentración deseada para el tiempo requerido. 2) durante la incubación, las BCPPs se internalizan e interactúan con sus compañeros intracelulares. 3) lavar las células 3 veces en el hielo con PBS helado. 4) lyse las células para extraer las proteínas. 5) a los tubos de transferencia lysates de la célula.6) girar a 11000 x g por 10 min a 4 ° C. 7) transferencia los sobrenadantes a nuevos tubos (A) y mantenga una pequeña alícuota de los lisados de proceso como regular Western blot muestras en tubo (B). 8) suspender las cuentas NeutrAvidin Agarose y añadir 50 μL en cada tubo un utilizando una pipeta de corte. 9) incubar con agitándolo suavemente durante 12 h a 4 ° C para permitir que las perlas de agarosa NeutrAvidin interactuar con BCPPs y sus socios. 10) de la vuelta durante 1 min a 3000 x g a los granos con el biotinilado de pellets cebos y sus proteínas interactuantes a ellos. 11) transferir sobrenadante a tubos nuevos (C) y mantenerlos para utilizar en caso de que el desplegable necesita ser repetido. 12) lavar el sedimento cinco veces con tampón de lisis fresco, suspender por inversión, de la vuelta durante 1 min a 3000 x g y descartar el sobrenadante. 13) eliminar cuidadosamente el sobrenadante. 14) añadir el volumen deseado de 4 x Tampón Laemmli y eluir las proteínas a 100 ° C por 5 min 15) Spin en 8200 x g durante 30 s para que sedimenten los granos. 16) transferir las proteínas eluídas encontradas en el sobrenadante con capilares consejos a nuevos tubos (D). 17) cargar en geles para el análisis de Western blot. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Estudio de las interacciones intracelulares de Cx43 TAT266-283- B en G166 GSCs por hacia abajo seguida de Western blot.
GSCs G166 se incubaron con 50 μm B TAT o TAT-Cx43266-283- B. Después de 30 minutos, las células fueron sometidas a lisis y TAT-B o TAT-Cx43266-283- B a sus socios intracelulares fueron tirados con NeutrAvidin granos. Las proteínas eluídas se carga y se analizaron por Western blot para el estudio de los niveles de FAK, c-Src, CSK, PTEN y Cav-1. Nota: que Cav-1 interactúa con ambos B TAT TAT Cx43266-283- B, c-Src, PTEN y CSK interactúan preferentemente con TAT Cx43266-283- B y FAK no mostró ninguna interacción con TAT-B o TAT-Cx43266-283-B. por favor Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Confirmación de Cx43 TAT266-283- B intracelulares interacciones en G166 GSCs por microscopia confocal.
GSCs G166 se incubaron con 50 μm TAT Cx43266-283- B. Después de 30 min, células eran fijadas y procesadas para localizar TAT Cx43266-283- B con Cy2-estreptavidina (verde), c-Src por inmunofluorescencia (rojo) y fosfatidilserina con anexina V (azul). Tener en cuenta algunos puntos de co-localización (blanco) entre TAT Cx43266-283- B y c-Src, cerca de la membrana del plasma en las imágenes de fusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.