Este manuscrito describe un protocolo para aislar y la cultura osteoclastos en vitro de médula ósea de ratón y para estudiar el papel de lo mamíferos/mecanicista Diana de la rapamicina 1 complejo en la formación de osteoclastos.
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Artículo de método
Una base de RANKL osteoclasto cultura ensayo de médula ósea de ratón para investigar el papel de mTORC1 en la formación de osteoclastos
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En este artículo
Resumen
Resumen
Los osteoclastos son único hueso-resorbing células que diferencian del linaje monocito/macrófago de la médula ósea. Disfunción de los osteoclastos puede resultar en una serie de enfermedades metabólicas del hueso, incluyendo la osteoporosis. Para desarrollar objetivos de productos farmacéuticos para la prevención de pérdida de masa ósea patológica, se deben entender los mecanismos por el cual los osteoclastos diferencian de precursores. La capacidad de aislar y un gran número de osteoclastos en vitro la cultura es fundamental para determinar el papel de genes específicos en la diferenciación de los osteoclastos. Inactivación del mecanicista/mamíferos objetivo de rapamicina complejo 1 (TORC1) en osteoclastos puede disminuir el número de osteoclastos y aumenta la masa ósea; sin embargo, los mecanismos subyacentes requieren estudio adicional. En el presente estudio, se describe un protocolo basado en RANKL para aislar y cultura osteoclastos de médula ósea de ratón y estudiar la influencia de mTORC1 inactivación en la formación de osteoclastos. Este protocolo con éxito dio lugar a un gran número de osteoclastos gigantes, normalmente dentro de una semana. Supresión de Raptor deterioró la formación de osteoclastos y disminución de la actividad de la fosfatasa ácida tartrato resistente secretor, indicando que eso mTORC1 es fundamental para la formación de osteoclastos.
Introducción
El hueso es un órgano siempre-que cambia y es remodelado por osteoblastos y osteoclastos durante toda la vida. Osteoclastos se encargan de la resorción de la matriz mineralizada y osteoblastos sintetizan y secretan nuevo hueso matrices1. El equilibrio entre la reabsorción ósea y formación ósea es crucial para la salud de los huesos incluyendo el mantenimiento del hueso masa y respuesta a la estimulación y lesiones. Si este equilibrio se interrumpe, puede ocurrir una serie de enfermedades metabólicas óseas, incluyendo osteoporosis y enfermedades periodontales. En estas enfermedades, pérdida de masa ósea resultante de la resorción ósea osteoclást....
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Protocolo
Todos los procedimientos relativos a los animales se realizaron según el protocolo aprobado por el Panel administrativo de Stanford en el laboratorio Animal Care (APLAC) y fueron aprobados por el cuidado de animales y uso del Instituto de Shanghai de Bioquímica y celular Biología.
1. preparación
- Generar ratones de eliminación específicas de Raptor en osteoclastos (Raptorfl/fl; Ctsk-cre, en adelante RapCtsk) apareamiento Raptorfl/fl ratones ratones de Ctsk-cre . Usar los ratones Raptorfl/fl como el control de peso en este es....
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Resultados
Mediante el presente Protocolo, un gran número de osteoclastos gigantes fueron visto el día 6; Si no se observan osteoclastos gigantes, un día más de diferenciación de osteoclastos puede ser necesario (figura 1). Formación de osteoclastos exitosa fue confirmada por trampa de tinción (figura 2A). Osteoclastos son células de color rojo/morado vino gigantes con más de 3 núcleos. Más de 250 osteoclastos se obtuvieron en cada pocillo .......
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Discusión
El ensayo de osteoclastogenic es el método más utilizado para aislar y cultura osteoclastos en vitro12,13. Mientras que varias inducciones basadas en RANKL osteoclasto se han descrito13,14,15, el presente estudio describe un protocolo con algunas modificaciones basadas en los métodos anteriores.
En el estudio anterior, eran placas BMM.......
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Divulgaciones
Todos los autores afirman que tienen no hay conflictos de intereses.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Dr. Minghan Tong y S. Kato para ratones y reactivos que amablemente. Agradecemos a los miembros del laboratorio de Zou para discusiones útiles. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de 973 programa del Ministerio Chino de ciencia y tecnología (MOST) [2014CB964704 y 2015CB964503], programa de investigación clínica del Hospital de 9 personas, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Gracias por la ayuda de instalaciones centrales para la biología de la célula e instalaciones centrales de Biología química, CAS centro de excelencia en Ciencia Molecular de la célula, Instituto Shanghai de Bioquímica y biología celular, Academia....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Raptorfl/fl | ratones The Jackson Laboratory 013188 | ||
| Ctsk-cre ratones | un regalo de S. Kato, Universidad de Tokio, Tokio, Japón | ||
| α-MEM | Corning | 10-022-CVR | |
| Glutamina | Gibico | 25030081 | |
| Penicilina estreptomicina | Gibico | 15140122 | |
| Suero fetal para terneros | BioInd | 04-001-1A | |
| Proteína M-CSF de ratón recombinante | R& D | Q3U4F9 | |
| Proteína RANKL recombinante de ratón | R& D | Q3TWY5 | |
| Tampón de lisis RBC | Beyotime | C3702 | |
| Azul de tripano | Sigma-Aldrich | 302643 | |
| Acetona | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Solución de citrato | Sigma-Aldrich | 915 | |
| Solución de formaldehído | Shanghai Chemical Co., Ltd. | ||
| Kit de fosfatasa ácida, leucocitos (TRAP) | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | |
| Granate rápido GBC Solución base | Sigma-Aldrich | 3872 | |
| Solución de nitrito de sodio | Sigma-Aldrich | 914 | |
| Naftol AS-BI Solución de fosfato | Sigma-Aldrich | 3871 | |
| Solución de acetato | Sigma-Aldrich | 3863 | |
| Solución de tartrato | Sigma-Aldrich | 3873 | |
| Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco | Corning | 21-031-CVR | |
| Ácido L-tartárico | Sigma-Aldrich | 251380 | |
| Tartrato de sodio dibásico deshidratado | Sigma-Aldrich | s4797 | |
| Glycine | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| MgCl2 | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| ZnCl2 | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| NaOH | Shanghái Químico Co., Ltd. | ||
| Sustrato de fosfatasa | Sigma-Aldrich | P4744 | |
| anti-Raptor | Tecnología de señalización celular | 2280 | |
| anti-P-proteína ribosómica S6 (S235/236) | Tecnología de señalización celular | 2317 | |
| proteína antirribosómica S6 | Tecnología de señalización celular | 2211 | |
| anti-β-actina | Santa Cruz Biotecnología | sc-130300 | |
| 37% formaldehído Xilong | membrana | ||
| científica de fluoruro de polivinilideno (PVDF) | Bio-Rad | ||
| Western Chemiluminiscent HRP Substrate (ECL) | Millipore | 00000367MSDS | |
| IX71 | Olympus | ||
| Envision | Perkin Elmer | ||
| 0,45 mm Jeringa Tijera | |||
| Pinza |
Referencias
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics<....
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Reimpresiones y permisos
