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Artículo de método

La cucaracha que silba como un modelo alternativo de animales no mamíferos para investigar la eficacia de la droga, virulencia y patogenia de Madagascar

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DOI:

10.3791/56491

⸱

24 de noviembre de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Bacteriology Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases, 2Southern Research, 3Headquarters Division, United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases

En este artículo

Resumen

Presentamos un protocolo para utilizar el Madagascar cucaracha que silba como un modelo alternativo de animales no mamíferos para llevar a cabo la virulencia bacteriana, patogenesia, Toxicidad farmacológica, eficacia de los medicamentos y estudios de la respuesta inmune innata.

Resumen

Muchos aspectos de la inmunidad innata se conservan entre mamíferos e insectos. Un insecto, la cucaracha del género Gromphadorhina, que silba de Madagascar puede ser utilizado como un modelo alternativo de animales para el estudio de la virulencia, interacción huésped-patógeno, respuesta inmune innata y eficacia de los medicamentos. Se proporcionan detalles para la cría, cuidado y cría de la cucaracha silbante. También nos ilustra cómo pueden ser infectado con bacterias como los patógenos intracelulares Burkholderia mallei y pseudomallei del B., B. thailandensis. Uso de la cucaracha silbante es barato y supera problemas relacionados con el uso de mamíferos en la investigación. Además, los resultados encontrados utilizando el modelo de cucaracha silbante son reproducibles y similares a los obtenidos con modelos de mamíferos. Así, la cucaracha silbante de Madagascar representa un host sustituto atractivo que debería estudiarse cuando se realizan estudios con animales.

Introducción

El uso de insectos como alternativa no mamíferos modelos animales para estudiar la patogenesia bacteriana y defensa del huésped natural ha ido ganando ímpetu en los últimos años. Logísticamente, esto es debido a su costo relativamente barato y la facilidad en la obtención, manejo y cuidado de insectos en comparación con los mamíferos. También no hay ninguna normativa que rige el uso de insectos en la investigación; no está sujeto a la competencia o restricciones establecidas por cualquier animal usan Comité o agencia gubernamental. Los insectos como modelos animales sustituto son particularmente susceptibles a los estudios de proyección integral de factores de virulencia, interacciones huésped-patógeno y evaluaciones de eficacia de los medicamentos antimicrobianos. Su uso puede reducir el número de mamíferos usados para la investigación de tal modo superar algunos de los dilemas éticos inherentes a la realización de los experimentos con animales 1,2.

Insectos pueden servir como anfitriones de suplente porque hay un alto grado de compatibilidad entre los sistemas inmunitarios innatos de insectos y mamíferos 1,3. Plasmatocitos insectos y mamíferos macrófagos fagocitar microorganismos 4. La contraparte de insectos para el neutrófilo es el hemocyte 5,6. Caminos del estallido oxidativo intracelular en insectos y células de mamífero son similares; especies reactivas de oxígeno en ambos se producen por orthologous p47phox y p67phox proteínas 5. Las cascadas de señalización aguas abajo de receptores Toll en insectos y receptores tipo Toll y de interleukin-1 en los mamíferos también son notablemente similares; ambos resultan en la producción de péptidos antimicrobianos, como defensinas 7. Así, los insectos pueden ser utilizados para estudio general mecanismos inmunes innatos que son compartidos por metazoarios.

Un insecto llamado la cucaracha del género Gromphadorhina, que silba de Madagascar es uno de la especie de cucaracha más grande que existe, alcanzando por lo general 5 a 8 cm en la madurez. Es nativo solamente a la isla de Madagascar y se caracteriza por el silbido que hace - un sonido que se produce cuando la cucaracha silbante expulsa aire a través de orificios respiratorios llamados espiráculos 8. El silbido distintivo sirve como una forma de comunicación social entre los silbidos de las cucarachas para el cortejo y la agresión 9 y se oye cuando un hombre está perturbado en su hábitat. La cucaracha que silba de Madagascar se mueve lento en comparación con la cucaracha americana y otras especies de plagas urbanas. Es fácil de cuidar y criar; una cucaracha silbante embarazada puede producir 20 a 30 crías a la vez. Un bebé silbido cucaracha, llamada ninfa, alcanza la madurez sexual en 5 meses después de sufrir 6 mudas y pueden vivir hasta 5 años en el salvaje y en cautiverio 8.

Hemos utilizado la Madagascar cucaracha que silba como anfitrión sustituto para la infección con los patógeno intracelulares mallei de Burkholderia, pseudomallei del B.y B. thailandensis 10,11. La virulencia de estos patógenos en silbar las cucarachas se comparó con su virulencia en el modelo animal de referencia de Burkholderia, el hámster sirio. Se encontró que la dosis letal (LD50) de 50% del pseudomallei del B. y B. mallei fue similar en ambos modelos con 11. Curiosamente, B. thailandensis, aunque insipidez en el modelo de roedor, es letal en la cucaracha silbante 11. Esta diferencia con respecto a la infección de B. thailandensis subraya la utilidad del modelo cucaracha silbante; B. thailandensis atenuando a mutantes puede resolverse más fácilmente en la cucaracha silbante que en modelos de roedores. Además, como B. thailandensis se utiliza a menudo como el organismo modelo para el pseudomallei del B. y B. mallei 10,12,13, identificación de atenuación mutaciones en él podría conducir a objetivos similares en sus parientes más virulentos.

A pesar de la diferencia en la virulencia de B. thailandensis en la cucaracha silbante versus el hámster sirio, mutaciones en factores de virulencia importantes, como los de la tipo 6 secreción sistema 1 (T6SS-1), que son atenuantes de B. mallei y Pseudomallei del B., son semejantemente atenuantes para B. thailandensis 11. El modelo de cucaracha silbante se valida más que individuales T6SS mutantes (T6SS-2 T6SS-6) en el pseudomallei del B., que no influyen en la virulencia en hámsteres sirios, siendo virulentos en el silbido de las cucarachas 11. Así, la cucaracha silbante es un modelo animal sustituto viable para las tres especies de Burkholderia . Recientemente se utilizó la cucaracha silbante como un modelo animal de sustituto para examinar la eficacia de la cloroquina fármaco antipalúdico (CLQ) contra Burkholderia infección 10 y su toxicidad.

Aquí, describimos la crianza y el cuidado de la Madagascar cucaracha que silba y proporcionar detalles sobre cómo infectar este insecto con tres especies de Burkholderia . Además, nos ilustran que la cucaracha silbante es un modelo sustituto viable para el estudio de virulencia y eficacia de los medicamentos en Burkholderia infecciones y que es probable que también puede servir como anfitrión sustituto para otros patógenos bacterianos en estudios similares.

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Protocolo

1. preparativos para el mantenimiento de una colonia de cucaracha silbante

  1. Preparación de jaulas para las silbante cucarachas vivir en. Aplique una capa delgada de vaselina, aproximadamente 20 a 30 mm de ancho, para el contorno de las paredes internas en la parte superior de la jaula para evitar que las cucarachas silbidas de salir de la jaula y escapar.
    Nota: Silbido cucarachas puede ser ubicado en una variedad de contenedores que tienen un gran espacio, son de suficiente altura y tienen tapas. Utilizar jaulas de ratón (~ 43 x 23 cm x 20 cm). Para jaulas destinados a 37 ° C, no aplicar vaselina.
  2. Incluyen una caja de cartón de huevo colocada boca abajo dentro de la jaula para proporcionar un escondite para los insectos naturalmente tímidos. No sustituya la caja de cartón de huevo con uno de espuma de poliestireno para evitar la ingestión de plástico.
  3. Para facilitar la limpieza y para aumentar la visibilidad de las ninfas recién nacidas, no ofrecen ropa de cama.
  4. Obtener el alimento de perro seco que contiene una composición de ~ 20% de proteína cruda. Groseramente moler la comida para perros con un procesador de alimentos o licuadora y almacenar a 4 ° C.
  5. Obtener varios platos poco profundos y piedras de acuario o con una esponja agua y alimento.
    Nota: los platos de Petri son recomendados.

2. silbido cucaracha cuidado y cría

  1. Obtener exogámica Madagascar silbido cucarachas (~ 5 cm) de un criador comercial. La especie utilizada en el presente Protocolo es Gromphadorhina laevigata. Desempaque la caja de envío que contiene las cucarachas sibilante inmediatamente sobre el recibo.
  2. Seguir las directrices apropiadas para el uso de equipo de protección personal en el manejo de animales.
    Nota: Use guantes gruesos para la manipulación de las cucarachas como cortan las garras tarsales de una cucaracha silbante.
  3. Transferencia hasta 75 grandes cucarachas sibilante (> 3 cm) por jaula grande. Las ninfas recién eclosionadas y menor la transferencia (< 3 cm) en una jaula separada.
    Nota: Mantener significativamente más de 75 grandes silbidos cucarachas por la jaula del ratón podrían conducir al deterioro de salud de la Colonia y también podrían resultar en muertes.
  4. Maneje una cucaracha recién mudada, que es blanquecino en color, con cuidado y evite apretándola. Por otra parte, permiten el exoesqueleto oscurecer y endurecer antes de manipularlo.
    Nota: No es necesario eliminar a los ácaros, Pseudois Gromphadorholaelaps, que a menudo acompañan a silbido cucarachas a la recepción de los criadores. Los ácaros beneficiosos mantienen limpio las cucarachas silba y son inofensivos a los seres humanos.
  5. Alimentar cucarachas silba con el alimento de perro seco molido en un plato bajo una o dos veces a la semana. Prever suficiente alimento de perro para asegurarse de que el silbante cucarachas tienen alimentos suficientes hasta la próxima alimentación. Deseche cualquier alimento que se ha convertido en húmedo y mohoso.
  6. Además de la comida para perros, ofrecen corte frutas y verduras, como manzanas, papas o lechuga en un plato bajo. Deseche alimentos mohosos o podridos.
  7. Proporcionar agua potable una vez o dos veces a la semana en un plato poco profundo pero no llene demasiado el plato para evitar derrames en la jaula. Colocar piedras de acuario pequeño o una esponja en el plato para proporcionar una plataforma de aterrizaje para pequeñas ninfas. Utilizar agua de ósmosis inversa, si está disponible.
  8. Mantener silbido cucarachas en la oscuridad a temperaturas entre 21 ° C y 30 ° C. Mantener grandes cucarachas silbante destinadas a experimentación a bajas temperaturas (~ 21 ° C) por 2 meses disminuir la reproducción y el embarazo. Por el contrario, mantener a las ninfas en temperaturas más altas (28 ° C a 30 ° C) para acelerar el crecimiento.
    Nota: Mantenga jaulas a temperatura ambiente (21 ° C) en un oscuro armario.
  9. Proporcionar humedad incluyendo un recipiente aparte agua si silbar las cucarachas se mantienen en una incubadora.
  10. Limpie la jaula sacando hacia fuera las heces secas regularmente o transfiriendo silbido cucarachas a una jaula limpia cada 2 a 3 semanas. Mantener seco el fondo de la jaula. Limpie la jaula inmediatamente si el exceso de agua se permite acumular y mezcla con el excremento en la parte inferior de la jaula.

3. cucaracha preparación para experimentación

  1. Transferir la cantidad de cucarachas silba en una jaula a una incubadora humidificada de 37 ° C 1 a 3 semanas antes de un experimento de aclimatación. Incluyen un grupo control para la inyección. Este período de aclimatación es fundamental para evitar el choque de la temperatura durante la experimentación.
  2. No aplique vaselina para jaulas destinados a 37 ° C ya que la temperatura más alta derrita la gelatina.
  3. Compruebe las cucarachas silba cada 1 a 2 días para reemplazar el agua y los alimentos y limpiar la jaula.
  4. Obtener recipientes de comida de plástico transparente desechable con tapa para agrupar las cucarachas sibilante durante la experimentación. Para la ventilación, agujeros en la tapa o el lado del contenedor con un clavo y un martillo.
    Nota: Utilice recipientes de tapón sobre snap cap contenedores en la configuración de nivel 3 de bioseguridad. Envases tapa de presión se pueden reforzar con cinta, si es necesario.
  5. En el día de la inyección, distribuya cucarachas silbante climatizadas de 6 a 12 en grupos por el envase, asegurando la distribución igual por sexo y masa corporal.
  6. Determinar el sexo de cucarachas silbidos individuales. Determinar el sexo por la prominencia de los cuernos en los machos y la falta en las hembras.
  7. Pesan las cucarachas silbidas individuales. Para facilitar el pesaje de una cucaracha silbante en el equilibrio, encerrarlo dentro de dos barcos de peso que han sido tarados.
    Nota: Para la consistencia entre experimentos, use cucarachas silba con un peso de 4 a 8 g. Sin embargo, se han encontrado ninguna diferencia en la supervivencia después de la infección entre cucarachas silbante grande (6 a 8 g) y pequeño (1.5 a 2 g). Estudios de drogas, uso cucarachas silba con un peso de ~ 5 g para obtener una concentración de droga más consistente por cuerpo masa.
  8. En lugar de un plato de agua, son agua de alto contenido frutas o verduras, como un trozo de manzana o de patata. Deseche la comida podrida. No proporcionar agua adicional para mantener el recipiente seco.
  9. Volver las cucarachas silba a 37 ° C hasta inyecciones.

4. preparaciones y cultura bacteriana

Nota: Las especies bacterianas utilizadas en este protocolo son B. mallei y pseudomallei del B. B. thailandensis. Todas las manipulaciones con B. mallei y pseudomallei del B. deben realizarse en clase II o gabinetes de seguridad biológica de clase III ubicado en un nivel de bioseguridad (BSL) laboratorio 3. Realizar manipulaciones con B. thailandensis en seguridad biológica similar gabinetes ubicados ya sea en un laboratorio BSL2 BSL3. Seguir procedimiento de funcionamiento de estándar institucional para trabajo de BSL3. Siga las directrices para el uso de equipo de protección personal al manipular las bacterias.

  1. Preparar un plato principal de Burkholderia por lo menos 3 días antes de la infección. Uso de Luria-Bertani (Lennox) (LB) agar para el pseudomallei del B. o B. thailandensis y uso LB agar suplementado con glicerol 4% para B. mallei. Bacterias de la racha de un stock de glicerol 25% almacenadas a-80 ° C.
    Nota: Siempre raya la placa principal directamente del material congelado glicerol; evitar paso serial de las bacterias de placa a placa ya que puede causar disminución de la virulencia.
  2. Inocular el caldo de 10 a 20 mL LB con varias colonias de B. pseudomallei o B. thailandensis de la placa principal. Del mismo modo inocular caldo LB suplementado con glicerol 4% para B. mallei.
  3. Agitar el caldo de cultivo a 175 a 250 rpm a 37 ° C para h ~ 18.
  4. Centrifugar 2 a 3 mL del cultivo a 5.000 x g por 10 min.
  5. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado bacteriano en tampón de fosfato estéril salino (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4).
  6. Diluir las bacterias con PBS para lograr una densidad óptica (OD) de 0,5, medida a una absorbancia de 600 nm en un espectrofotómetro.
  7. En serie diluir las bacterias diez veces en PBS de la do a partir de 0.5. Uso de estas suspensiones para la infección.
  8. Determinar las colonias formando unidades (UFC) del inóculo por dilución seriada y la galjanoplastia de alícuotas de μl 100 en medios de agar. Incube las placas a 37 ° C por 24 a 48 h.

5. preparaciones de la droga

  1. Determinar la cantidad apropiada de medicamento que ha de darse por cuerpo masa. La dosificación CLQ a la cucaracha silbante se basó en la dosis estándar para los mamíferos, que es de 50 mg/kg/día.
  2. Suspender o diluir la droga de interés en el vehículo. Por ejemplo, diluir CLQ en PBS a una concentración de 12 mg/mL. Esta concentración proporciona 300 μg de la droga a un g ~ 6 sibilante cucaracha en 25 μl inyectado volumen.
  3. Si es necesario, esterilizar la solución farmacológica al pasar por un filtro de jeringa 0,22 μm.
  4. Almacenar la solución farmacológica a 4 ° C hasta su uso. Caliente la solución farmacológica, al menos 21 ° C (temperatura ambiente) antes de las inyecciones.

6. montaje del inyector

  1. Establece el puntero en el volumen deseado (25 μl) girando el tornillo de ajuste en una pipeta repetitiva.
  2. Empuje la barra de lanzamiento de la pipeta repetitiva hacia adentro y tire hacia afuera el empujador. La pipeta repetitiva está lista para dar cabida a una jeringa cargada.
    Nota: Calibrar el volumen expulsado por la pipeta repetitiva mediante la medición de la cantidad de agua expulsada en el equilibrio.
  3. Llene una jeringa de 1 mL con suspensión contiene bacterias o fármacos.
  4. Conecte la jeringa a una estéril 26 o 27 G x 1/2 pulgada (o más) de la aguja.
  5. Golpee la jeringa para las burbujas de aire en la parte superior del flotador y expulsar las burbujas y alguna suspensión en un recipiente llenado de lejía del 10%.
  6. Coloque la jeringa en el clip de la jeringuilla de la pipeta repetitiva con el bisel de la aguja hacia arriba.
  7. Tire hacia afuera la barra de lanzamiento y pulse el botón dosificador firmemente para realizar inyecciones en blanco en un recipiente llenado de lejía del 10% hasta que el émbolo de la jeringa contra el empujador.
  8. Realizar 1 o 2 inyecciones en blanco adicionales para asegurar el líquido es expulsado fuera de la jeringa. La pipeta repetitiva está lista para las inyecciones.

7. cucaracha inyecciones

  1. Realizar todas las inyecciones de cucaracha en una clase II o clase III gabinete de seguridad biológica en un BSL2 o BSL3 ajuste uso institucional recomienda equipo de protección personal.
  2. Limpie las superficies de trabajo en el gabinete de seguridad que pueden entrar en contacto con las cucarachas sibilante. Use blanqueador 10% seguido de etanol al 70% para quitar cloro residual. Deje que la superficie a aire seco.
  3. Con una mano, agarre la cucaracha silbante por su lado. Inmovilizar una cucaracha silbante que no retroceda durante la inyección. Doble la cucaracha silbante ligeramente para que las membranas cutáneas entre terga abdominal están expuestas.
  4. Con la otra mano, sostenga la pipeta repetitiva que la aguja esté en 0° en ángulo de 30° de la línea media del dorso-ventral de la cucaracha silbante. Perforar la membrana cutánea junto a la 3rd, 4tho 5th TERGO del extremo posterior.
    Nota: Entrada de la aguja en la cucaracha silbante en el ángulo indicado asegura que la aguja no vaya a través y salir fuera de la cucaracha silbante. El sitio de inyección garantiza que el material expulsado es contenido dentro de la cavidad abdominal llenada de hemolinfa. Practique manteniendo las cucarachas silbante y de inyección con agua antes de las inyecciones de empresa con bacterias vivas o drogas.
  5. Pulse el botón de descarga para inyectar el volumen. Retirar suavemente la aguja en el mismo ángulo según lo utilizado para la entrada.
  6. Lugar la cucaracha silbante inyectado en un contenedor separado para distinguirla de las cucarachas silbidas que no se ha inyectado. Limpie cualquier hemolinfa que puede haber exudado hacia fuera desde el sitio de inyección.
  7. Continuar inyectando otro silbidas cucarachas dentro de un grupo usando la misma jeringa y aguja. Dejar de inyectarse antes de que el émbolo llega al fondo del cañón para evitar dosis incompleta de la última inyección.
  8. Inyecciones múltiples en una cucaracha silbante sola, como las bacterias y medicamentos, inyectar en diferentes lados de un TERGO en el lado dorsal de las sibilante cucarachas. Como alternativa, realizar múltiples inyecciones inyectando en diferentes terga (3rd a 5th).
  9. Asegúrese de que las tapas de los envases estén bien fijadas. Reforzar las tapas con cinta adhesiva, si es necesario.
  10. Incubar el silbido de las cucarachas en una incubadora humidificada 37 ° C.

8. registro silbido cucaracha morbilidad y mortalidad

  1. Realizar todos los exámenes de cucaracha silbante en un seguridad biológica clase II o clase III, gabinete con institucional recomienda equipo de protección personal. Limpiar las superficies en el gabinete de seguridad con lejía 10% seguido de etanol al 70%. Seque el área de trabajo al aire.
  2. Puntuación de silbido cucarachas de una vez o dos veces diariamente durante un período de 1 a 2 semanas usando la morbilidad puntuación tabla (tabla 1).
  3. Eliminar cucarachas muerto sibilante del recipiente y registre el número de sobrevivientes.
  4. La transferencia queda vivo silbido cucarachas a un recipiente limpio si se ha acumulado el exceso de humedad en la parte inferior del envase. Alternativamente, use toallas de papel desechables para limpiar el exceso de humedad.
  5. Vuelva a colocar comida podrida diario y retorno silbar las cucarachas a la incubadora humidificada 37 ° C.
  6. Al final del estudio, lugar de supervivientes en una bolsa de biohazard y congelar a-80 ° C a la eutanasia.
  7. Analizar estadísticamente datos14 para determinar la DL50 y por el análisis de Kaplan-Meier y Log-Rank para la supervivencia. Como con toda experimentación insectos, algunas muertes pueden ocurrir en el grupo de control. Estas muertes se atribuyen a la mortalidad natural de insectos 15. Para una discusión más detallada sobre cómo cuenta para muertes en el grupo de control, ver referencia15.

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Resultados

Esta sección muestra los resultados que se obtuvieron cuando las cucarachas silbante de Madagascar fueron infectadas con B. mallei pseudomallei del B., y B. thailandensis; los resultados muestran que este insecto es un modelo animal manejable para las diferentes especies de Burkholderia en el estudio de eficacia de los medicamentos contra la infección bacteriana, virulencia y toxicidad de la droga. Más sibilante cucarachas sobrevivieron en grupos que estaban inf...

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Discusión

Las condiciones experimentales óptimas comienzan con una colonia saludable de cucaracha silbante, que requiere un mínimo pero compromiso consistente en tiempo. Aunque silbido cucarachas puede ir para un período relativamente largo de tiempo (~ semanas) sin comida y agua, debe proporcionarse mantenimiento semanal o quincenal de la jaula. Esto incluye el control de los alimentos y el suministro de agua y asegurar que la jaula esté seca. Mantener las condiciones de vida seca es especialmente importante durante la aclimataci...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

J. Chua, N.A. Fisher, D. DeShazer y A.M. Friedlander diseñan los procedimientos descritos en el manuscrito. J. Chua, N.A. Fisher, S.D. Falcinelli y DeShazer D. realizan los experimentos. J. Chua escribió el manuscrito.

Los autores agradecen a Joshua J. W. Roan, Nora D. Doyle, Nicholas R. Carter y Steven A. Tobery de excelente asistencia técnica y David P. Fetterer y Steven J. Kern para el análisis estadístico.

El trabajo fue apoyado por la propuesta de agencia de reducción de amenaza de defensa #CBCALL12-THRB1-1-0270 A.M.F y de #CBS. MEDBIO.02.10.Rd.034 a D.D.

Opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones son las de los autores y no necesariamente son endosadas por el ejército de Estados Unidos.

El contenido de esta publicación no reflejan necesariamente las opiniones o políticas del Departamento de defensa, ni mención de nombres comerciales, productos comerciales, o las organizaciones implican la aprobación por el gobierno de Estados Unidos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cucaracha silbadora de Madagascar
   
 
 
 		Carolina Biological Supply Co, Burlington, NC 
Croquetas y Bits, cualquier saborBig Heart Pet Brands, San Francisco, CAUPC #079100519378
Encaje en recipientes de plástico desechables o equivalentesRubbermaid, Huntersville, NCUPC #FG7F71RETCHIL
Atornille en recipientes de plástico desechables o equivalentesRubbermaid, Huntersville, NCUPC #FG7J0000TCHIL
Tridak Serie STEPPER repetitiva pipetaDymax Corporation
www.dymax.com		T15469
Jeringa (1 mL) Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJde 309659
(26 o 27G x 1/2)Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ305109, 305111
Difosfato de cloroquinaSigma-Aldrich, St. Louis, MOC6628
Solución salina tamponada con fosfatoGibco/ Thermo Fisher Scientific, Gaithersburg, MD10010023
Difco Luria- Bertani (Lennox)Becton Dickinson, Chispas, MD240230
Agar Sigma-Aldrich, St. Louis, MOA1296
GlicerolSigma-Aldrich, St. Louis, MOG6279
143668 Aguja

Referencias

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