Artículo de método

Vivo de la célula de microscopía de fluorescencia para observar procesos esenciales durante el crecimiento de la célula microbiana

DOI:

10.3791/56497

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24 de noviembre de 2017

 ,  , 
1Division of Biological Sciences, University of Missouri

En este artículo

Resumen

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Es difícil entender la función de los procesos esenciales en bacterias. Microscopía de fluorescencia con objetivo específicos de colorantes puede proporcionar ideas claves en la progresión de crecimiento y el ciclo celular la célula microbiana. Aquí, Agrobacterium tumefaciens se utiliza como una bacteria modelo para resaltar los métodos de proyección de imagen de células vivas para la caracterización de los procesos esenciales.

Resumen

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Los procesos celulares básicos como la replicación del ADN y segregación, la síntesis de proteínas, biosíntesis de la pared celular y división celular dependen de la función de proteínas que son esenciales para la supervivencia bacteriana. Una serie de objetivos específicos de colorantes puede utilizarse como sondas para mejor entienden estos procesos. Tinción con colorantes lipófilos permite la observación de la estructura de la membrana, visualización de microdominios lipídicos y la detección de las ampollas de la membrana. Uso de fluorescentes d-aminoácidos (FDAAs) a los sitios de la biosíntesis del peptidoglicano de la sonda puede indicar posibles defectos en la biogénesis de la pared celular o patrones de crecimiento de la célula. Por último, las manchas de ácido nucleico pueden indicar posibles defectos en la segregación de replicación o cromosoma de ADN. ADN de Cianina manchas etiqueta viven las células y son conveniente para Time-lapse microscopía permite observaciones en tiempo real de morfología nucleoid durante el crecimiento de la célula. Protocolos para el etiquetado de células pueden aplicarse a mutantes de agotamiento de la proteína para identificar defectos en la estructura de la membrana, la biogénesis de la pared celular o la segregación cromosómica. Además, Time-lapse microscopia puede utilizarse para monitorizar los cambios morfológicos como una proteína esencial se elimina y puede proporcionar perspectivas adicionales en función de la proteína. Por ejemplo, el agotamiento de proteínas esencial división celular produce filamentación o ramificación, mientras que el agotamiento de proteínas de crecimiento celular puede causar células llegar a ser más corto o más redondos. Aquí, los protocolos para el crecimiento de la célula, específico del destino etiquetado y microscopía de Time-lapse se proporcionan para el patógeno de la planta bacteriano tumefaciens de la agrobacteria. Juntos, tintes específicos del destino y Time-lapse microscopia permiten caracterización de procesos esenciales en a. tumefaciens. Por último, los protocolos proporcionados pueden modificarse fácilmente para probar procesos esenciales en otras bacterias.

Introducción

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Progresión a través del ciclo de la célula bacteriana requiere la coordinación de muchos procesos incluyendo biosíntesis de membrana y pared celular, replicación del DNA y la segregación y división celular. Para entender completamente la complejidad de la biología de la célula bacteriana, es necesario estudiar estos acontecimientos esenciales; sin embargo, se trata de una tarea no trivial ya que la viabilidad celular se ve comprometida cuando componentes clave de estos caminos son mutagenized. Microscopía de epifluorescencia juntada con colorantes específicos del destino es un enfoque poderoso para estos procesos esenciales en el tipo salvaje y mutante de cepas bacterianas.

Colorantes específicos de peptidoglicano son fluorescentes antibióticos (vancomicina-FL, bocillin-FL) y fluorescente-d-amino ácidos (por ejemplo, 7-hidroxicumarina-3-carboxílico ácido-3-amino-d-alanina, HADA; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan-3-amino-d-alanina , NADA; tetramethylrhodamine-3-amino-d-alanina; TADA). En bacterias Gram positivas, el uso de concentraciones subletales de fluorescentes antibióticos análogos a los sitios de la biosíntesis del peptidoglicano de la sonda ha sido una estrategia efectiva para revelar peptidoglicano patrones de inserción de1,2, 3,4. Mientras que el etiquetado fluorescente vancomicina se ha utilizado para ganar penetraciones en el peptidoglicano patrones de inserción en bacterias Gram-negativas fija5, la membrana externa proporciona generalmente una barrera de permeabilidad que impide el uso de fluorescentes antibióticos como sonda para la biosíntesis de peptidoglicano en células vivas. Por el contrario, pulsos cortos de fluorescente d-aminoácidos o d-aminoácidos con grupos funcionales de biorthogonal covalente etiqueta regiones de reciente inserción de peptidoglicano en una amplia gama de vida las células bacterianas6,7. Patrones de inserción de peptidoglicano que se han observado con los d-aminoácidos sintéticos incluyen punteado y septal (Escherichia coli y Bacillus subtilis), polar y septal (Agrobacterium tumefaciens y Listeria monocytogenes), sólo septal (Staphylococcus aureus) y apical (Streptomyces venezuelaa)6,7. Estas observaciones indican que las bacterias exhiben diversos patrones de la biogénesis de la pared celular y que el uso de sintéticos d aminoácidos como sondas para examinar los patrones de crecimiento es una estrategia valiosa en muchas bacterias.

Tintes que etiquetar los cromosomas bacterianos incluyen la carpeta de surco menor específicos de ácido desoxirribonucleico (ADN) (4, 6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) y colorantes de Cianina de alta afinidad (verde y naranja; vea la lista de materiales). La coloración de DAPI de células fijas ayuda a enumeración de bacterias a partir de muestras ambientales8, mientras que la coloración de DAPI de células vivas se utiliza para indicar la viabilidad bacteriana9. En cambio, colorantes de Cianina como naranja y verde son frecuentemente descritos como células "muertas" impermeant membrana manchas para enumerar las células no viables9. Sorprendentemente, cuando estos reactivos se utilizan para sondar la morfología del nucleoide bacteriano durante el crecimiento de la célula, DAPI, naranja y verde todos mostraron ser membrana florescente y capaz de etiquetado células vivas10. En vivo las células de e. coli , la coloración de DAPI de ADN aparece difusa debido a auto fluorescencia del citoplasma y exposiciones repetidas de células con tinción DAPI a luz ultravioleta (UV) perturba la estructura nucleoide del10. Tinción e. coli o B. subtilis con naranja revela que este tinte es membrana florescente y proporciona fluorescencia de larga duración sobre la Unión al ADN en células vivas sin afectar el crecimiento de la célula, replicación del ADN o cromosoma segregación10 . Estas observaciones sugieren que colorantes de Cianina ADN pueden utilizarse para controlar la morfología de nucleoids durante el crecimiento celular de muchas bacterias.

Phospholipid-specific stryl tintes como N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) fenil) hexatrienyl) dibromuro de pyridinium (4-64; véase la lista de materiales) son compuestos catiónicos y asociar preferentemente con carga negativa fosfolípidos como la cardiolipina y fosfatidilglicerol11. Se observan patrones distintos al 4-64 se utiliza para etiquetar la membrana de bacterias diferentes. En Escherichia coli, 4-64 se enriquece en los polos, en bandas a lo largo de la pared lateral y en los sitios de la división de pre-divisional células de12. En Bacillus subtilis, 4-64 etiquetado permite la visualización de lípidos espirales13. En Agrobacterium tumefaciens, 4-64 etiquetas la membrana externa y se observa un patrón característico "Herradura" en el que el polo de crecimiento carece de etiquetado14,15. Estas observaciones indican que estas bacterias exhiben distribuciones lípido heterogéneo debido a la presencia de los dominios de lípidos que contribuyen a la asimetría celular. Cambios en los patrones Etiquetadoras 4-64 como la presencia de las etiquetas difusas, las ampollas o vesículas, invaginaciones o contracción de la membrana puede ser informativa en la caracterización de mutantes que afectan a la distribución o la biosíntesis de lípidos.

Más allá de la coloración de las células, es necesario determinar la función de las proteínas que participan en los procesos esenciales. La caracterización de las proteínas esenciales es un desafío técnico porque no es posible eliminar genes esenciales y estudiar las consecuencias fenotípicas. Así, han surgido enfoques alternativos que agotan la proteína. Por ejemplo, un gen esencial se puede poner bajo el control de un promotor inducible en lugar de su promotor nativo. Promotores inducibles son sensibles a moléculas pequeñas tales como; Isopropil-β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG)17,18,19,20,21, arabinosa22,16, vanillate17,23, de zinc y así la transcripción del gen objetivo deja de xilosa23, y la proteína de interés se agota cuando se retira el inductor. Enfoques alternativos para el agotamiento de proteínas esenciales de interés incluyen riboswitches sintético24 que utiliza las interacciones ARN molécula pequeña para impedir la transcripción de genes diana, CRISPR interferencia25,26 a bloque de transcripción de genes diana y proteína inducible degradación27,28 que utiliza etiquetas de péptidos a las proteínas de la blanco para la degradación por la proteasa de ClpXP. Cepas de agotamiento proporcionan solamente un a corto plazo para la caracterización antes de que las células pierden viabilidad, por lo tanto, la proyección de imagen microscópica de células en el tiempo durante el agotamiento de la proteína es un potente enfoque para la caracterización. De hecho, microscopía de células bacterianas vivas ha permitido a los investigadores a ganar penetraciones en los procesos biológicos fundamentales, incluyendo los mecanismos de mantenimiento de forma celular, secreción y compartimentación29.

A. tumefaciens es un patógeno de planta bacteriana30 e ingeniero genético natural31,32. Así, los mecanismos relacionados con la patogenicidad, incluyendo huésped-patógeno interacciones33,34,35, secreción36y host transformación30,31, 37 han sido ampliamente investigados. Para diseñar estrategias que prevención la enfermedad de a. tumefaciens mediada o aumentar la planta de transformación, los procesos esenciales para la supervivencia de a. tumefaciens deban entenderse mejor. El uso de colorantes específicos del destino y el reciente desarrollo de una estrategia de agotamiento de la proteína de a. tumefaciens18 proporciona un medio para investigar los procesos esenciales.

Aquí, cuentan con protocolos detallados para el análisis microscópico de cepas de tipo salvaje y mutante proteína agotamiento de a. tumefaciens . Los dos primeros protocolos describen cómo preparar las células y etiquetarlos con colorantes específicos del destino. El tercer Protocolo proporciona instrucciones paso a paso para preparar pastillas de agarosa (figura 1) y proyección de imagen las células bacterianas (figura 2, figura 3, figura 4). Estos protocolos también pueden ser adecuados para otras bacterias con adaptaciones adicionales para tener en cuenta las condiciones de los diferentes medios de comunicación, las tasas de crecimiento, requerimientos de oxígeno y estructuras celulares.

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Protocolo

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1. crecimiento de las cepas de a. tumefaciens

  1. Cultivo de cepas de a. tumefaciens
    1. Utilice una punta de palillo o pipeta de madera estéril para inocular 1 mL de medio de crecimiento de ATGN (véase lista de materiales para la receta) con una sola Colonia de la cepa deseada.
      Nota: Para las cepas de a. tumefaciens agotamiento, el ATGN debe contener 1 mM IPTG como un inductor para mantener la biosíntesis de la proteína esencial.
    2. Crecen las cepas de a. tumefaciens noche en ATGN a 28 ° C con agitación a 225 rpm.
    3. Medir la densidad óptica de las células a 600 nm (OD600) utilizando un espectrofotómetro. Diluir el cultivo celular un OD600 = ~0.2 y continúan creciendo hasta OD600 = ~0.6 está alcanzado. Para cepas de agotamiento, seguir creciendo con inductor hasta OD600 = ~0.6 está alcanzado.
    4. Utilizar cepas de tipo salvaje y mutante de a. tumefaciens a OD600 = ~0.6 para el objetivo específico de tinción o Time-lapse microscopía (ver artículos 2 y 3.1). Para cepas de agotamiento, lavar el inductor (ver sección 1.2).
  2. Eliminación del inductor para la caracterización de cepas de agotamiento de la proteína de a. tumefaciens
    1. 1 mL de cultivo exponencial de pellets (OD600 = ~0.4-0.6) por centrifugación a 7.000 x g por 5 min en una centrífuga de sobremesa a temperatura ambiente.
    2. Para lavar, eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en medio fresco sin inductor y sedimenten las células como se describe anteriormente (1.2.1). Lavar las células de un total de 3 veces en medios frescos.
    3. Resuspender el precipitado final en medios frescos y concentrar las células a un OD600 = ~0.8 inmediata tinción con colorantes específicos objetivo (sección 2 y Figura 4B-D) o microscopía de Time-lapse (sección 3.2 y Figura 4A) . Alternativamente, la agotan las células para la cantidad de tiempo deseada por cultivo de células en medios sin inductor antes de la coloración y la proyección de imagen de las células.

2. objetivo específico de tinción de las células a. tumefaciens

  1. Etiquetado ácida d-amino fluorescente de la pared celular
    Nota: FDAAs son no tóxico fluorescentes d-aminoácidos que se incorporan fácilmente en el peptidoglicano de a. tumefaciens . Este sencillo procedimiento etiquetado sondas crecimiento patrones en células vivas6. Protocolos para la síntesis de cuatro FDAAs están disponibles38.
    1. 500 μl de cultivo exponencial de pellets (OD600 = ~0.4-0.6) por centrifugación a 7.000 x g por 5 min en una centrífuga de sobremesa. Resuspender el precipitado de células en 100 μl de medio fresco.
    2. Añadir 5 μl de 5 mM FDAA para lavado y concentrado de células e Incube por 2 minutos en la oscuridad.
      Nota: Limitar FDAA exposición a la luz. El tiempo de incubación varía dependiendo de la tasa de crecimiento de la cepa. Normalmente, los tiempos de incubación deben ser 5-10% de la duplicación de tiempo6.
    3. Sedimenten las células por centrifugación y lavar el pellet celular con tampón fosfato salino (PBS) tres veces.
    4. Resuspender el precipitado en 50 μl PBS.
      Nota: El volumen de PBS utilizados por resuspensión puede variar según tamaño de la pelotilla.
    5. Aplicar 0.8-1 μl de células a un colchón de agarosa y la imagen mediante microscopía de epifluorescencia inmediatamente (ver secciones 3.1 y 3.2).
      1. Como alternativa, dejar más incorporación de etiqueta mediante la fijación de las células con etanol al 70% helada. Resuspender el precipitado de células en 1 mL de etanol al 70% helada e incubar en hielo por 15 minutos.
      2. Recoger las células por centrifugación y resuspender en un pequeño volumen de PBS para la proyección de imagen en un momento posterior. Almacenar suspensiones celulares a 4 ° C y de imagen dentro de 48 horas.
  2. ADN de tinción con DAPI o mancha naranja
    Nota: Observar ADN estructura, las células están marcadas con DAPI o naranja (tinción de células muertas). Aunque clásicamente se describe como una"muerte celular", la naranja es florescente, Fotoestables y no afecta el crecimiento de las células bacterianas, permitiendo a DNA de células vivas imágenes10. En a. tumefaciens, naranja Etiquetadoras obras bien en células vivas y es adecuados para microscopía Time-lapse (figura 3). En contraste, el ultravioleta (UV) exposición a la luz necesaria para la proyección de imagen células con tinción DAPI es fototóxica (figura 3) y tinción DAPI es más adecuado para la tinción de células vivas para la proyección de imagen inmediata o tinción de células fijas.
    1. La coloración de DAPI de células
      1. 1 mL de cultivo exponencial de pellets (OD600 = ~0.4-0.6) por centrifugación a 7.000 x g por 5 min en una centrífuga de sobremesa.
      2. Opcionalmente, para fijar las células antes de la tinción, Resuspender el precipitado de células en 1 mL de etanol al 70% helada. Incubar en hielo durante 10-15 minutos recogen las células por centrifugación como se describen en 2.2.1.1.
      3. Resuspender el precipitado de células en 1 mL de PBS con 1 μl de la solución madre de DAPI (1 mg/mL; ver la Tabla de materiales). Mezclar suavemente mediante pipeteo e incubar durante 5 minutos en la oscuridad.
      4. Pellet de células por centrifugación a 7.000 x g durante 5 min y resuspender en 1 mL de PBS para eliminar exceso DAPI. Lavan las células dos veces más y resuspender el precipitado en 50 μl PBS o en los medios de comunicación.
      5. Aplicar 0.8-1 μl de células a un colchón de agarosa y la imagen mediante microscopía de epifluorescencia inmediatamente. Consulte las secciones 3.1 y 3.2.
        Nota: Este Protocolo no es óptimo para Time-lapse microscopia observar la dinámica del cromosoma (figura 3). Considere el uso de la coloración naranja como una alternativa (consulte la sección 2.2.2).
    2. Coloración naranja de células vivas
    3. 1 mL de cultivo exponencial de pellets (OD600 = ~0.4-0.6) por centrifugación a 7.000 x g por 5 min en una centrífuga de sobremesa. Resuspender el precipitado de células en 1 mL de PBS con 1 μl de la solución madre naranja (véase lista de materiales). Mezclar suavemente mediante pipeteo e incubar por 5 min en la oscuridad.
    4. Pellet de células por centrifugación y resuspender en 1 mL de PBS para eliminar exceso naranja. Lavan las células dos veces más y resuspender el precipitado en 50 μl PBS.
    5. Aplicar 0.8-1 μl de células a un colchón de agarosa y la imagen mediante microscopía de epifluorescencia inmediatamente. Consulte las secciones 3.1 y 3.2.
      Nota: Este protocolo trabaja con células vivas y es adecuado para microscopía de lapso de tiempo observar la dinámica del cromosoma (figura 3). Si no es conveniente a la imagen inmediatamente, las células pueden fijarse en etanol al 70% helada (ver apartado 2.2.1.2).
  3. Membrana de etiquetado
    Nota: El tinte fluorescente styryl lipofílico 4-64 se ha utilizado extensivamente para observar la membrana de las células bacterianas. A diferencia de muchas bacterias, 4-64 con la etiqueta de las células a. tumefaciens no rotular uniformemente, pero algo con frecuencia exhiben un patrón de "Herradura"14,15. El polo de crecimiento es notable, casi desprovisto de manchas mientras que el polo viejo es intensamente marcado. 4-64 permite visualización de patrones de crecimiento celular y la estructura de la membrana en a. tumefaciens.
    1. Añadir FM 4-64 a una concentración final de 8 μg/mL en 1 mL de cultivo de células de la fase exponencial e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos en la oscuridad.
    2. Pelotilla células marcadas por centrifugación a 7.000 x g durante 5 minutos en una centrifugadora de escritorio y resuspender el precipitado de células en 1 mL de PBS. Lavar las células de un total de tres veces para eliminar el exceso de tinte.
    3. Resuspender las células en un volumen pequeño de PBS y punto en una almohadilla de agarosa a la imagen inmediatamente. (Véanse las secciones 3.1 y 3.2)
      PRECAUCIÓN: Las células deben ser reflejadas inmediatamente para observar patrones característicos de etiquetado.

3. la proyección de imagen de las células a. tumefaciens

  1. Preparación del pad de agarosa
    Nota: La figura 1 contiene una secuencia de imágenes (panel A) y esquema (panel B) de una almohadilla de agarosa típica preparada para microscopía de Time-lapse. Cojines de agarosa se preparan normalmente según sea necesario.
    1. 3.1.1. utilizar un cubreobjetos como guía y corte un 22 x 22 mm cuadrado de laboratorio de la película (véase lista de materiales) ejecutando un bisturí alrededor de los bordes.
    2. Cortar un cuadrado en el centro de la película de laboratorio dejando un ~ 2-5 frontera mm para servir como una junta para la almohadilla de agarosa. Deseche la abertura del centro.
    3. Coloque el empaque de película en un portaobjetos de vidrio (75 mm x 25 mm) limpiado con amoniaco y limpiador sin alcohol (véase lista de materiales) y calentar hasta que la película se derrita ligeramente sobre el vidrio (imagen de arriba en la figura 1A). Película de laboratorio del derretimiento, utilice el borde de un conjunto de bloque de calor a 70 ° C o derretir suavemente a la llama.
    4. Preparar la solución de agarosa mezclando ~0.075 g agarosa (véase lista de materiales) en 5 mL de medio en un matraz pequeño. Calentar la solución en un microondas con agitación periódica para mezclar hasta que la agarosa se disuelve y la solución es clara. Mantener la solución de agarosa en 55-70 ° C y usar para la construcción de múltiples pastillas de agarosa dentro de 48 horas.
    5. Media pipeta que contiene 1.2-1.5% agarosa en el centro de la Junta.
      Nota: El volumen de los medios de comunicación suele ser de 50-60 μL pero variará según el tamaño de la Junta. Agregar medios a una diapositiva de frío pueden causar la agarosa se solidifique demasiado rápidamente, así la diapositiva debe mantenerse sobre una superficie caliente. El borde de un bloque de calor situado a 70 ° C obras bien. Agarosa de agua o soluciones de agarosa tamponado como tamponada fosfato salino (PBS) pueden utilizarse en lugar de los medios de comunicación que contenga agarosa para aplicaciones en las que el crecimiento celular continua no es necesario. Para cepas de agotamiento de la proyección de imagen, puede ser inductor de presentes o ausentes en los medios de comunicación. Presencia del inductor puede utilizarse como un control, mientras que la ausencia del inductor revelará el fenotipo de agotamiento.
    6. Coloque un cubreobjetos sobre el empaque para distribuir uniformemente la agarosa.
    7. Colocar el portaobjetos sobre una superficie fría, solidificar para min ~ 2 Evite un secado excesivo de la almohadilla de agarosa como resultado una superficie rugosa en la agarosa y puesta en común de la suspensión de la célula cuando se aplica a la superficie.
    8. Deslice con cuidado el cubreobjetos de la almohadilla de agarosa.
      PRECAUCIÓN: No se apresure este paso. La almohadilla de agarosa puede rasgar fácilmente y una almohadilla de agarosa desigual puede dificultar la proyección de imagen.
    9. Seque la almohadilla de la agarosa al aire durante 1-2 min a temperatura ambiente aparezca seca la superficie de la almohadilla. Con el bisturí, quitar una pequeña tira de agarosa para crear una bolsa de aire (imagen media, figura 1A); la bolsa de aire es típicamente ~ 2 x 7-10 mm y las células a. tumefaciens tienden a crecen mejor cerca de la bolsa de aire (figura 1).
      Nota: Para la proyección de imagen de células fijas o en condiciones donde el crecimiento no se controla, una bolsa de aire no es necesaria.
    10. Punto 0.8-1 μl de células sobre la almohadilla de la agarosa y la tapa con un cubreobjetos nuevo. Coloque con cuidado el cubreobjetos sobre la parte superior de la almohadilla de la agarosa para la distribución de las células a través de la superficie de la almohadilla de agarosa.
    11. Sellar los bordes del cubreobjetos con VALAP fundido (ver la Tabla de materiales para la receta; Figura 1A, imagen inferior). Para sellar a lo largo de los bordes y esquinas del cubreobjetos puede causar sequedad de la almohadilla de agarosa, que conducirá a la deriva de las células durante la proyección de imagen. Nota: Sólo es necesario sellado de cubreobjetos para la proyección de imagen de lapso de tiempo a largo plazo.

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Figura 1: preparación de agarosa pad. (A) imagen secuencia del Protocolo de preparación del pad de agarosa. Imagen 1 es una diapositiva con el empaque de película de laboratorio. En la imagen 2, se visualizan la agarosa cojín y bolsa de aire. Finalmente, la imagen 3 muestra la plataforma completa agarosa con las células bajo un cubreobjetos y sella con VALAP. (B) un esquema de una almohadilla de agarosa para Time-lapse microscopía se proporciona. Principales características de la almohadilla de agarosa están marcadas en el esquema. (C) el bolsillo de aire promovió el crecimiento de a. tumefaciens sobre soportes de agarosa. Se muestran imágenes de las células de a. tumefaciens wildtype cultivadas en una almohadilla de agarosa durante 20 horas. Imágenes fueron tomadas en posiciones cada vez más distantes de la bolsa de aire. La distancia desde el borde más cercano de la imagen a la bolsa de aire se muestra por encima de cada imagen. Barra de escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. La proyección de imagen
    Nota: Imágenes epifluorescencia, contraste de interferencia diferencial y contraste de fases se realiza con un microscopio invertido con enfoque automático basado en hardware, una etapa automatizada, filtros estándar, una fuente de luz LED, inmersión de aceite de 60 X objetivos (NA 1.4) para contraste de fase o de contraste de interferencia diferencial (DIC) y una 1K multiplicadores de electrón--dispositivo de carga acoplada (EMCCD) de la cámara. El microscopio debe colocarse en una sala de temperatura controlada. Alternativamente, puede utilizarse un escenario más cálido o cámara para mantener temperaturas constantes durante proyección de imagen.
    1. Microscopía de epifluorescencia
      Nota: Para imágenes de fluorescencia de células vivas, es necesario limitar el número de adquisiciones de la imagen y optimizar el tiempo de exposición para minimizar el fotoblanqueo y fototoxicidad. Para la proyección de imagen de cada tinte, es aconsejable encontrar un tiempo de exposición óptimo que proporciona detección de fluorescencia suficiente pero no lleva al fotoblanqueo o fototoxicidad. En las figuras 2-4, se utilizaron tiempos de exposición de 200 ms para todas las imágenes de fluorescencia. Para las secuencias de lapso de tiempo que se muestra en la figura 3, imágenes fueron adquiridas cada 10 minutos durante 3 horas.
      1. Colocar aceite de inmersión en el objetivo deseado y coloque el carro invertido en el soporte de diapositivas en el escenario. Utilice las perillas de enfoque para poner las células en el foco.
      2. Adquirir las imágenes de fase (o DIC) y el filtro de la fluorescencia deseada.
        Nota: Las máximas longitudes de onda de excitación y emisión para las manchas en la figura 2, figura 3y figura 4 son los siguientes: HADA (405/460), NADA (450/555), TADA (555/570), 4-64 (515/640), DAPI (360/460), naranja (547/570).
    2. Microscopía de Time-lapse
      Nota: Durante el Time-lapse microscopía las siguientes características son controlados por el ordenador: x, y y z filtros de posición, persianas y fluorescencia. Un sistema de enfoque automático basado en hardware es óptimo para mantener la atención durante la proyección de imagen de Time-lapse. Alternativamente, puede utilizarse un lazo basado en software de enfoque automático.
      1. Colocar aceite de inmersión en el objetivo deseado y coloque el carro invertido en el soporte de diapositivas en el escenario. Utilice las perillas de enfoque para poner las células en el foco.
      2. Opcionalmente: Adquirir múltiples (x, y) posiciones. Seleccionar al azar 10 campos de células en proximidad cercana a la bolsa de aire de los cojines de la agarosa.
      3. Puesta en marcha la adquisición de la secuencia de tiempo a la imagen en fase o CID en el intervalo de tiempo deseado.
        Nota: Para la secuencia Time-lapse que se muestra en la figura 4, DIC imágenes fueron adquiridas con la exposición de ms de 30 cada 10 minutos para las 14 h. Cuando utilice imágenes de fluorescencia durante el Time-lapse microscopia, ajuste el tiempo de exposición y el intervalo de adquisición para minimizar el fotoblanqueo y fototoxicidad.

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Resultados

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Objetivo específico de tipo salvaje Las células de a. tumefaciens
Para ilustrar esa morfología de la célula no se ve afectada por los pasos de lavado o tratamiento con DMSO 1% (que se utiliza para diluir los tintes fluorescentes), las células fueron imágenes directamente de la cultura (figura 2A, panel izquierdo), después de lavar las células por centrifugación como se describe en 1.2 (

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Discusión

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Este protocolo contiene una serie de procedimientos para la investigación de cepas de tipo salvaje, mutante y el agotamiento de a. tumefaciens . Cabe destacar que todos los procedimientos enumerados en la sección de protocolo pueden ser fácilmente adaptados para otras cepas bacterianas con modificaciones adicionales para tener en cuenta medios de cultivo, temperaturas y tasas de crecimiento.

El uso de colorantes específicos del destino es una valiosa herramienta para proporcionar una ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Agradecemos a Michael VanNieuwenhze (Indiana University) por el don de las FDAAs en la figura 2 y figura 4. Agradecemos a los miembros del laboratorio de marrón para la retroalimentación durante la preparación de este manuscrito. Investigación en el laboratorio de marrón en la división y crecimiento de las células a. tumefaciens es apoyada por la National Science Foundation (IOS1557806).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Agrobacterium tumefaciens C58ATCC33970Watson B, Currier TC, Gordon MP, Chilton MD, Nester EW. 1975. Plásmido requerido para la virulencia de Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol 123:255-264.
Agrobacterium tumefaciens C58Δ tetRA::mini-Tn7T-GM-Ptac-ctrA Δ ctrAFigueroa-Cuilan W, Daniel JJ, Howell M, Sulaiman A, Brown PJB. 2016. La inserción de mini-Tn7 en un sitio artificial attTn7 permite la depelación del regulador maestro esencial CtrA en el fitopatógeno Agrobacterium tumefaciens. Appl Environ Microbiol. 82:5015-5025.
NombreCompanyNúmero de catálogo>Comentarios
Media Components
ATGN Minimal MediumA 1 L de agua esterilizada añadir 50 ml de tampón 20X, 50 ml de sales 20X, 12,5 ml de glucosa al 40%. Para los platos, agregue 15 g de Bacto Agar a 1 L de agua y autoclave. Enfriar a 55 ° C y añadir 50 ml de tampón 20X, 50 ml de sales 20X, 12,5 ml de glucosa al 40%.
Agregue214 g/L de KH2PO4 al agua y ajuste el pH a 7.0 con hidróxido de sodio. Autoclave.
NaOHFisher BioReagentsBP359
KH2PO4Fisher ChemicalP288
20X AT Sales Añadir40 g/L (NH4)2SO4, 3,2 g/L MgSO4• 7H2O, 0,2 g/L CaCl2• 2H2O, y 0,024 g/L MnSO4• H2O al agua. Autoclave.
(NH4)2SO4Fisher ChemicalA701
MgSO4• 7H2OFisher BioReagentsBP213
CaCl2• 2H2OFisher BioReagentsBP510
MnSO4• H2OFisher ChemicalM114
GlucosaFisher ChemicalD16Prepare un 40% de caldo en agua. Filtro esterilizante.
Bacto AgarFisher BioReagentsBP1423Añadir 15 g a 1 L de agua al preparar los platos.
NombreCompany>Número de catálogoComentarios
Opcional Aditivos de medios
KanamycinGoldBioK-120Preparar como una solución madre de 100 mg/ml en agua y filtrar esterilización. Uso a la concentración final de 200 µ g/ml.
IPTGGoldBioI2481C5Prepare como una solución madre de 1 M en agua y filtro esterilizante. Úselo a la concentración final de 1 mM según sea necesario para la inducción.
Nombre>CompanyNúmero de catálogoComentarios
Materiales de microscopía
cristales Sparkle.
Cubreobjetos de Microscopio Fisherbrand12-541-B22 X 22 mm. Nº 1.5. Limpie con limpiador de vidrios Sparkle.
Limpiador de vidrio SparkleHome Depot 203261385libre de amoníaco y alcohol.
Agarosa ultra puraInvitrogen16500-100Agregue al agua, PBS o medio hasta una concentración final de 1 a 1.5%. Derrita en el microondas y colóquelo en una
PBSBioReagentsBP399500a 70 C para diluir a 1X con agua estéril.
ParafilmBemisPM-999 Película delaboratorio utilizada como junta en la preparación de almohadillas de agarosa.
VALAPAgregue pesos iguales de lanolina, cera de parafina y vaselina a un tubo cónico. Tubo de calor en 70 ° C seco, en perlas o al baño maría para derretir y mezclar. Aplique VALAP mientras aún está fundido.
Manteca de lanolinaSAAQINSQ-LAB-R1
VaselinaTarget Corp.06-17644
Velas artesanalescera de parafina263012
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
>Colorantes específicos del objetivo
DMSOBioreactivosFisher BP231-1Úselo para diluir soluciones madre de tintes según sea necesario.
FDAAs (NADA, HADA,TADA)Los FDAAspueden ser sintetizados o adquiridos a través de un acuerdo con Mike VanNieuwenhze (Universidad de Indiana). Prepare 100 mM de solución madre en DMSO. Utilizar a una concentración final de 5 mM.
DAPIThermoFisher Scientific62247Prepare 1 mg/ml de solución madre en DMSO. Uso a la concentración final de 1 & micro; g/ml.
SYTOX Orange Nucleic Acid StainInvitrogenS11368La concentración de existencias es de 5 mM en DMSO. Utilizar a la concentración final de 5 µM.
FM4-64InvitrogenT3166Prepare solución madre de 8 mg/ml en DMSO. Úselo a la concentración final de 8 & micro; g/ml.
NombreCompanyNúmero de catálogoComentarios
>Equipo
Baño secoSheldon Manufacturing, Inc.52120-200
Perlas térmicas metálicasLab Armor42370-002
Microscopio de epifluorescencia equipado con una cámaraEn este trabajo se utiliza la Nikon Eclipse TiE equipada con una cámara QImaging Rolera em-c2 1K con dispositivo de carga acoplada a la multiplicación de electrones (EMCCD).
Microscope Slides Fisherbrand 12-550D 25 X 75 X 1.0 mm. Limpiar con limpiador de solución de 10X de PBS BioReagents de EMCDD

Referencias

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