Este manuscrito describe el análisis de variación número de la copia realizado en la DNA del suero o plasma utilizando el método PCR en tiempo real. Este método es adecuado para la predicción de resistencia a medicamentos en pacientes con cáncer de próstata resistente a castración, pero podría ser informativa también para otras enfermedades.
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Artículo de método
Suero y Plasma copia número detección mediante PCR en tiempo real
En este artículo
Resumen
Resumen
Suero y plasma de la célula ADN libre (cfDNA) se ha mostrado como una fuente informativa, no-invasivo de biomarcadores para el diagnóstico de cáncer, pronóstico, seguimiento y predicción de la resistencia al tratamiento. A partir de la hipótesis de que el aumento del número de copias de genes andrógenos receptor (AR) (CN) es un evento frecuente en cáncer de próstata de resistencia de castración metastático (mCRPC), nos proponemos analizar este evento en cfDNA como un biomarcador predictivo potencial.
Se evaluaron AR CN en cfDNA con 2 diferentes ensayos PCR en tiempo real y 2 genes de referencia (RNaseP y hace1). Cantidad de ADN de 60 ng fue utilizado para cada combinación de ensayo. AR Aumento de las CN se confirmó mediante PCR Digital como un método más preciso. Análisis de variación de CN ya ha demostrado para ser informativo para la predicción de la resistencia al tratamiento en el ajuste de mCRPC, pero podría ser útil también para otros fines en diferentes contextos de paciente. Análisis CN en cfDNA tiene varias ventajas: es no invasivo, rápido y fácil de realizar, y se parte de un pequeño volumen de suero o plasma.
Introducción
ADN libre de la célula (cfDNA) en la sangre que circula ha demostrado ser una fuente óptima de biomarcadores para el diagnóstico de cáncer, pronóstico, seguimiento y predicción de tratamiento resistencia1,2. Muchos estudios han demostrado una buena concordancia entre alteraciones del ADN (mutaciones, variaciones de número de copia, las modificaciones epigenéticas en los tejidos) y los que se encuentran en el correspondiente plasma las muestras1, confirmando que circula ADN del tumor (ctDNA) es informativo para el tumor primario y metastático tejido alteraciones3.....
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Protocolo
El protocolo consiste en el aislamiento de ADN de muestras de suero o plasma para realizar PCR en tiempo real para el análisis del número de copia. Se realizaron la extracción de ADN, control de la cantidad de ADN (espectrofotómetro) y PCR en tiempo real para objetivos específicos. En la figura 1, se informó un resumen de los procedimientos y la línea de tiempo.
El protocolo sigue las pautas del primer Comité de ética de investigación humana.
1. suero recopilación y el procesamiento
- Recoger aproximadamente 5 mL sangre entera en un tubo de suero sin anticoagulante para obt....
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Resultados
Concentración total cfDNA fue cuantificable por espectrofotometría para todas las muestras analizadas, mostrando un nivel medio de 6,12 ng/μl (rango: 23.71 2.00 ng/μL) para las muestras de suero y una media de 3.21 ng/μl (rango: 2.31-8.49 ng/μL) para muestras de plasma. Se analizaron un total de 115 muestras de experimentos PCR en tiempo real.
Sensibilidad de la prueba se evaluó mediante suero mezclado ADN de pacientes con alta .......
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Discusión
AR Análisis CN en suero y plasma de la muestra representa un nuevo enfoque no invasivo para la estratificación de pacientes con cáncer de próstata resistente a castración (CPRP). Se ha demostrado recientemente que el CN AR es capaz de predecir los resultados en pacientes de CPRP tratados con abiraterona y enzalutamide, antes y después de quimioterapia7,8,9,10.
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Divulgaciones
Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Agradecemos a Chiara Molinari y Filippo Martignano apoyo en análisis de datos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de suero BD Vacutainer | Becton Dickinson | 367814 | tubo de sangre entera para suero |
| BD Vacutainer Tubos de EDTA | Becton Dickinson | 366643 | tubo de sangre total para plasma |
| Etanol absoluto | VWR | el usuario podría utilizar también otras empresas | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Ensayos prediseñados y validados con FAM-dye. Se utilizó el siguiente ensayo: AR_assay1: hs04107225 y AR_assay2: hs04511283 |
| Ensayo de número de copias TaqMan (modificado) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Ensayo prediseñado modificado con tinte VIC: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Ensayo de referencia del número de copias, humano, RNasa P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Mezcla maestra para PCR en tiempo real |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | Kit de extracción de ADN |
| MicroAmp Placas de 96 pocillos | N8010560 | Thermo Fisher Scientific | para PCR en tiempo real |
| Espectrofotómetro NanoDrop 1000 | Thermo Fisher Scientific | : | el usuario también podría utilizar otros métodos espectrofotométricos para cuantificar el ADN |
| 7500 Sistema rápido de PCR en tiempo real | Biosistema aplicado | : | el usuario también puede usar otro instrumento en tiempo real |
| Software CopyCaller | Software Biosistema aplicado | para el análisis del número de copias |
Referencias
- Salvi, S., et al. Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights. Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).
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Reimpresiones y permisos
