Artículo de método

Protocolo de mejora para la inmunoprecipitación de cromatina de músculo esquelético de ratón

DOI:

10.3791/56504

⸱

6 de noviembre de 2017

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1Department of Functional Genomics and Cancer, Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire

En este artículo

Resumen

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Se presenta un nuevo protocolo para la preparación de la cromatina de músculo esquelético de ratón adulto adaptado al estudio de la regulación de los genes en las fibras musculares por inmunoprecipitación de cromatina.

Resumen

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Se describe un protocolo eficiente y reproducible para la preparación de la cromatina de músculo esquelético de ratón adulto, un tejido resistente físicamente con un alto contenido de proteínas estructurales. Disecada extremidades músculos de ratones adultos físicamente se interrumpen por homogeneización mecánica, o una combinación de picado y douncing, en un tampón hipotónico antes de fijación formaldehído de la célula lisada. Los núcleos fijos son purificados por más ciclos de homogeneización mecánica o douncing y filtraciones secuenciales para eliminar restos celulares. Los núcleos purificados pueden ser sonicados inmediatamente o en una etapa posterior después de congelar. La cromatina puede ser sonicada eficientemente y es conveniente para los experimentos de inmunoprecipitación de cromatina, como lo demuestran los perfiles obtenido para factores de transcripción, ARN polimerasa II y modificaciones covalentes de histonas. Los eventos de enlace detectados con cromatina preparada por este protocolo son predominantemente aquellos que toman lugar en los núcleos de la fibra muscular a pesar de la presencia de cromatina de otro satélite de fibra-asociada y las células endoteliales. Este protocolo, por tanto, se adapta para estudiar la regulación de los genes en el músculo esquelético de ratón adulto.

Introducción

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Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) acoplada a la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) y secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) se han convertido en los métodos de elección para el estudio de transcripción y regulación epigenética de la expresión génica en distintos tejidos y tipos de la célula1. Esta técnica permite perfiles de genoma de modificaciones covalentes de la cromatina, ocupación variante de la histona y transcripción factor vinculante2,3.

Mientras que realizar ChIP de células cultivadas está bien establecida, ChIP de tejidos mamíferos sigue siendo más difícil. Preparación de cromatina chip implica varios pasos críticos que necesitan ser optimizados para todo tipo de tejidos y células. La cromatina puede ser preparada de los lisados celulares de las células cultivadas o purificación siguiente de sus núcleos. En el caso de tejidos mamíferos, lisis eficiente fijación formaldehído y purificación de núcleos son críticos para asegurar la óptima recuperación de la cromatina. Por otra parte, la elección de fijar los núcleos antes o después de su purificación debe determinarse experimentalmente. A pesar de estos obstáculos, el ChIP se ha realizado con éxito de tejidos como el hígado, testículo, cerebro4,5,6. En el caso del músculo esquelético, la interrupción de un tejido resistente físicamente, que exhibe un alto contenido de proteínas estructurales y el aislamiento de sus núcleos es particularmente desafiante. Dada esta especificidad, protocolos optimizados para otros tejidos no dan resultados satisfactorios para los músculos esqueléticos.

Aquí se describe un protocolo para aislar la cromatina ChIP-grado de tejido de músculo esquelético de ratón que consiste en alterar físicamente el tejido, fijación de formaldehído y el aislamiento de núcleos y sonicación. La eficacia de este método para preparar conveniente para el ChIP de este tejido la cromatina fue demostrada realizando qPCR ChIP y ChIP-seq para varios factores de transcripción, ARN polimerasa II y de modificaciones covalentes de histonas7.

Esta nueva técnica es mucho más rápida que un protocolo previamente divulgados8 que comprende largos pasos de digestión colagenasa durante ese tiempo, cambios en la localización genómica de factores de transcripción y pueden ocurrir alteraciones en la expresión génica. La rapidez con que los núcleos son aislados y fijo hace que el método descrito aquí particularmente atractiva para preparar cromatina que refleja más fielmente el estado nativo ocupación genómica. Por otra parte, aunque tienen otros métodos para la extracción de proteína o aislamiento de cromatina de tejido muscular han sido descrito8,9,10 y utilizado para los experimentos de ChIP-qPCR en genes seleccionados, sin ChIP-seq se ha reportado datos usarlos. El método aquí es conveniente para la transcripción factor e histona modificación ChIP-seq y por lo tanto debe ser también adecuado para 3 / 4C o aplicaciones de captura de conformación de la cromatina de HiC.

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Protocolo

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ratones fueron mantenidos de conformidad con las directrices institucionales sobre el uso y cuidado de animales de laboratorio y de acuerdo con directrices nacionales de cuidado Animal (Comisión Directiva 86/609/CEE; El francés decreto no.87-848). Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Nacional de ética francés.

1. aislamiento de tejido muscular

  1. sacrificio adultos 6 a 8 semanas de edad ratón por dislocación cervical. Sterlise la extremidad por lavado con etanol al 70% y disecar los músculos de extremidades (gastrocnemio, tibial Anterior, cuadriceps) utilizando tijeras de punta fina y fórceps.
    Nota: Un ratón debe generar alrededor de 500 mg de tejido.
  2. Pique los músculos en un tubo de ensayo 2 mL que contiene 1 mL de tampón hipotónico helada a una preparación homogénea de pequeño (< 2-3 mm 3) piezas finas tijeras y dejar el tubo de agitación en un agitador de Banco superior a 4 ° C durante 5-10 min

2. Lisis de tejido

Nota: consulte la tabla 1 para todos tampón composiciones.

  1. Traslado el homogenizado a un tubo de fondo redondo de 14 mL y resuspender en tampón hipotónico frío (libre de EDTA inhibidor de la proteasa cóctel y PMSF) de 5 mL.
    1. Homogenise tejido muscular picada mediante un flojo dounce (20-30 movimientos dentro de 3 minutos) o un homogeneizador de tejidos mecánicos para 15-30 s en tubos de fondo redondo 14 mL.
      Nota: La eficiencia de la lisis puede evaluarse en esta etapa por microscopia ligera, y si es necesario, puede realizarse la interrupción adicional.
  2. Traslado el homogeneizado en tubos de 15 mL y completar volumen a 10 mL con tampón hipotónico frío. Fijar el homogeneizado como se describe a continuación antes de proceder con el ratón siguiente.

3. Fijación

  1. añadir formaldehído a concentración final de 1% y agitar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
  2. Añadir glicina a una concentración final de 0,125 M en cada tubo para detener la fijación y agitar durante 5-10 min a temperatura ambiente.

4. Preparación de núcleos

Nota: consulte la tabla 1 para todos tampón composiciones.

  1. Homogenise fijo lisado usar un flojo dounce (5-10 movimientos).
    1. Transferencia a un tubo de 15 mL y centrifugar a 1.000 x g durante 5 min a 4 ° C para obtener núcleos y ruina celular.
  2. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en tampón hipotónico fresco 5 mL. Filtrar el lisado a través de un tamiz celular de 70 μm en un tubo de 50 mL. Volver a filtrar el líquido filtrado a través de un tamiz de 40 μm celular.
  3. Transferir el filtrado a un tubo de 15 mL y centrifugar a 1.000 x g durante 5 minutos a 4 ° C para obtener el pellet nuclear.
    Nota: En esta etapa, los núcleos pueden ser sonicados inmediatamente, o el rápido congelado como una pelotilla seca en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C.

5. Sonicación

  1. evaluar el volumen de la pastilla nuclear (alrededor de 50 μL para homogeneización mecánica y dounce) y resuspender en tampón de sonicación hasta 3 a 4 veces del volumen nuclear lleno y someter a ultrasonidos durante 10-15 min a 4 ° C utilizando un sonicador .
    Nota: La cromatina puede ser analizada inmediatamente como se describe a continuación (6) o congelada y almacenada a -80 ° C.

6. Evaluar el tamaño del fragmento de la cromatina tras sonicación

Nota: consulte la tabla 1 para todos tampón composiciones.

  1. Para de-reticular, 30 μl de la cromatina en un tubo de ensayo de 1,5 mL y añadir 20 μl 5 M NaCl. El volumen a 500 μl e incubar a 65 ° C durante la noche.
    1. Al día siguiente, realizar un tratamiento con proteinasa K de 1 μl (stock de 20 mg/mL), 10 μl 2 M Tris pH 6.8 y 10 μl de EDTA de 0,5 M por 1 h a 42 º C. Realice un fenol-cloroformo/cloroformo la extracción y precipitar el ADN con 1 volumen de sodio acetat e (3 M) y 2 volúmenes de etanol al 100% para una h a-80 ° C o durante la noche-20 ° C.
  2. De la pelotilla de la DNA por centrifugación a 13.500 x g durante 15 minutos decantar el sobrenadante y lavar el pellet con etanol 70% frío y centrifugar nuevamente por 5 min, decantar el sobrenadante y secar el pellet.
  3. Resuspender el precipitado en el volumen original (30 μL) de tampón TE. Medir la concentración de ADN en un espectrofotómetro la absorbancia a 260 nm/280 nm. Pipetear 500-1.000 ng de ADN junto con una escala de tamaño de DNA en carriles separados de un gel de agarosa al 1,5% y realizar la electroforesis para determinar el tamaño de fragmento de cromatina.
    Nota: Tamaño del fragmento debe estar entre 200-500 pares de bases y no debe ser fragmentos de peso molecular perceptible corresponde a no - o mal-fragmentación ADN. Si es necesario, la solución de la cromatina (paso 5) puede volver a sonicada durante más tiempo y entonces volvieron a analizar como se describe anteriormente hasta obtener el tamaño óptimo es.

7. Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)

Nota: consulte la tabla 1 para todos tampón composiciones.

  1. Abalorios de sepharose del bloque G de la proteína por tomar 1 mL de la mezcla de 50% en etanol. Pellets de los granos por centrifugación a 400 x g durante 1 min en una sobremesa centrifugar y lavan con 1 mL de la centrifugadora de buffer TE a 400 x g y repetición el Washington
    1. Después de la segunda centrifugación, resuspender en 1 mL de tampón de dilución de ChIP con 25 μl de BSA (stock 20 mg/mL) y 20 μl de levadura tRNA (stock 10 mg/mL). Bloquear las cuentas de al menos 2 h antes de su uso por rotación (40-60 rpm) a 4 ° C.
    2. Diluir 50 μg de la cromatina (paso 5) 8 a 10 veces con tampón de dilución de la viruta. Añadir 50 μl de mezcla de grano bloqueado e incubar por 2 h giratoria (40-60 rpm) a 4 ° C. Centrifugar a 400 x g a 4 ° C para obtener previamente despejado de la cromatina y transferirlo a un tubo nuevo.
  2. Para la inmunoprecipitación, añadir la cantidad apropiada de anticuerpo primario (p. ej., 1-2 μg por 10 μg de cromatina) e incubar durante una noche con giro en 4 ° C.
    Nota: La cantidad óptima de anticuerpo puede ser recomendada por el proveedor o se puede determinar empíricamente mediante la realización de ChIP-qPCR con diferentes cantidades de anticuerpo hasta enriquecimiento óptima se observa. También sepharose proteína G puede ser reemplazado por proteína A sefarosa según el subtipo de anticuerpo usado.
  3. Añadir las cuentas bloqueadas al día siguiente e incubar durante 1 h con rotación (40-60 rpm) a 4 ° C. Centrifugar a 400 x g por 20-30 s los granos de la pelotilla, eliminar el sobrenadante, y empezar el ChIP lava.
  4. ChIP lavados: realice los siguientes lavados con los almacenadores intermediarios: una vez con tampón salino de baja y luego dos veces con tampón salino alto, dos veces con tampón de LiCl y finalmente dos veces con Buffer TE.
    1. Realizar cada lavado durante 10 min con rotación (40-60 rpm) a 4 ° C y de la pelotilla de las cuentas entre cada colada por centrifugación a 400 x g por 20-30 s en una centrífuga de mesa.
  5. La elución, quite el último lavado y resuspender los granos en 250 μl de tampón de elución (recién preparado) por 15 min a temperatura ambiente agitando.
  6. Centrifugar a 400 x g y recoger el eluido en un tubo nuevo. Realizar este paso dos veces y luego de-reticulación el efluente durante la noche con 20 μl de NaCl 5 M y 1 μl Rnasa A (10 mg/mL), tratamiento con proteinasa K y fenol-cloroformo/cloroformo extractuar como en el paso 6.
  7. Resuspender en 50 μl de buffer TE y utilizar alícuotas para qPCR ChIP según protocolos estándar 15 para comprobar la calidad de la viruta de.

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Resultados

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Para aislar los núcleos, realizamos la homogeneización mecánica del tejido muscular disecado y picada para 15 o 45 s, en 18.000 y 22.000 rpm (véase Tabla de materiales). En todas las condiciones, los núcleos podrían ser separados de los desechos de tejido, pero el rendimiento fue óptimo con la velocidad más baja (figura 1A-B). Núcleos también pueden ser preparados por douncing 3-5 minutos (figura 1A

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Discusión

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Aquí describimos un nuevo protocolo para la preparación de cromatina de músculo esquelético de ratón adulto y muestran que esta cromatina es conveniente para los experimentos de ChIP que detectan modificaciones covalentes de la histona y atascamiento del factor de transcripción en los núcleos de la fibra muscular. Este protocolo implica varios pasos críticos. El primero es tejido que se pueden realizar por corte mecánico o dounce. Corte mecánico es más rápido y más reproducible y por lo tanto es el método de elección. Si...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

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Agradecemos a todo el personal de la planta de secuenciación de alto rendimiento IGBMC, miembro del consorcio "Francia Génomique" (ANR10-INBS-09-08) y todos los servicios generales de IGBMC en particular el personal de la instalación animal IGBMC. Este trabajo fue financiado por becas del CNRS, INSERM, la AFM, la Ligue Nationale contre le Cancer, los franceses del estado fondo a través de la ANR en el programa Investissements Avenir con ANR-10-IDEX-0002-02, la empresa Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 y la ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito. S.J fue apoyado por la Ligue Nationale contre le cáncer de la ANR-AR2GR-16-CE11-009-01 y V.U por el Ministère de l ' enseignement et de la Recherche. ID es un 'équipe labellisée' de la Ligue Nationale contre le cáncer.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
T 25 digital ULTRA-TURRAXT 18 ULTRA-TURRAX0009022800
PMSFSIGMA-ALDRICH CHIMIE SARLP7626-25G
Cóctel Inhibidor de la Proteasa-Libre de EDTARoche Diagnostics11873580001
Proteína G Perlas de SefarosaSIGMA-ALDRICH CHIMIEP-3296
Proteinasa KSIGMA-ALDRICH CHIMIEP-2308
Filtros de células 70umCorning BV431751
Filtros de células 40umCorning BV352340
Formaldehído Grado EMEuromedex15710-S
Rnase AFischer Scientific 12091039
Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico 25:24:1SIGMA-ALDRICH CHIMIEP3803
BSASIGMA-ALDRICH CHIMIEB4287-25G
LEVADURA TRNASIGMA-ALDRICH CHIMIER5636
Azul de GlucógenoAMIBIONAM9516
Pol II Anticuerpo ChIPSanta CruzSC-9001
H3K27ac Anticuerpo ChIPMotivo activo39133
Tead4 Anticuerpo ChIPAviva Biología de Sistemas(ARP38276_P050)
IGEPALSIGMA-ALDRICH CHIMIEI-3021
E220 Ultrasonido EnfocadoCovaris E220
NameCompanyNúmero de catálogoComentarios
Artículos adicionales
Tijeras
Loose Dounce
15 ml y 50 ml tubos falcon 14
ml tubos redondos de
1,5 ml y 2 ml tubos Eppendorf 70
μ m y 40 μ Filtros de células m (Corning)

Referencias

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