Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de entero, intacto el ratón glándulas mamarias para investigar la expresión de matriz extracelular (ECM) y morfología ductal. Las glándulas abdominales de ratón #4 se extrajeron de ratones femeninos nulíparas del 8-10 semanas de edad fijado en formalina tamponada neutra, seccionadas y teñido mediante inmunohistoquímica para las proteínas de la ECM.
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Artículo de método
Aislamiento de las glándulas mamarias del ratón intacto, todo para el análisis de expresión de la matriz extracelular y la morfología de la glándula
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Resumen
Resumen
El objetivo de este procedimiento era el #4 abdominal las glándulas mamarias de ratones femeninos nulíparas la cosecha con el fin de evaluar la expresión de ECM y arquitectura ductal. Aquí, un pequeño bolsillo debajo de la piel fue creado usando las tijeras de Mayo, permitiendo la separación de las glándulas en el tejido subcutáneo desde el peritoneo subyacente. Visualización de las glándulas fue ayudado por el uso de 3.5 lupas micro quirúrgicas x-R. La piel fue invertida y cubrió atrás que permite identificación de las almohadillas de grasa mamarias intactas. Cada una de las glándulas abdominales #4 fue disecada sin rodeos deslizando lateralmente la hoja de bisturí entre las glándulas y la capa subcutánea. Inmediatamente después de la cosecha, las glándulas se colocaron en 10% formalina tamponada neutra para el procesamiento posterior del tejido. Supresión de la glándula entera es ventajosa ya que sobre todo elimina el riesgo de excluir interacciones importantes de todo el tejido entre las células epiteliales ductales y otras poblaciones celulares microambiental que podrían perderse en una biopsia parcial. Uno de los inconvenientes de la metodología es el uso de secciones seriadas de tejidos fijadas que limita el análisis de expresión proteína y morfogénesis ductal a lugares discretos dentro de la glándula. Como tal, cambios en la expresión de proteína y arquitectura ductal en 3 dimensiones (3D) no es fácilmente obtenible. En general, la técnica es aplicable a los estudios que requiere todo intactas glándulas mamarias murinas para investigaciones posteriores tales como desarrollo cáncer ductal de morfogénesis o mama.
Introducción
El cáncer de mama se caracteriza por un grado considerable de tejido fibrosis1,2,3,4. Conocido como ECM, esta entidad no celular se encuentra en diferentes grados en todos los tejidos y se compone principalmente de una compleja red de colágenos fibrilares y no fibrilares, elastina y glicoproteínas además varias moléculas de señalización que son secuestrado en esta matriz. En condiciones homeostáticas, la deposición y la degradación de la ECM se controla bien. 5 durante la tumorogénesis de mama, se perturba el equilibrio de la deposición del ECM y la degradación. Así, tumores de mama se han divulgado para expresar proteínas ECM abundantes tales como colágenos, fibronectina y Tenascina-C entre otros. 6 la expresión anormal de estas proteínas además de más patrones de entrecruzamiento de la matriz se ha documentado para promover mama tumor metástasis, terapia y evolución resistencia1,3, 4,7,8,9.
Evaluar la composición del ECM y la morfología ductal, se realizó aislamiento de glándulas mamarias intactas. Aquí hemos utilizado mujeres nulíparas ratones deficientes de caveolina-1, una proteína integral de membrana que se ha ligado a una agresiva mama tumor firma10,11,12, controlar mujeres nulíparas B6 ratones. Procesamiento histológico y la coloración de estos tejidos permiten la identificación de varias proteínas de la ECM junto con la caracterización de la morfología ductal.
En general, el aislamiento de las glándulas mamarias enteros, intactos da a investigadores la oportunidad de investigar todo el tejido celulares o morfológicos cambios que ocurren en respuesta a factores exógenos o endógenos. Inconvenientes de la técnica están relacionadas con el análisis de secciones de tejido de 2 dimensiones (2D) en contraposición a una perspectiva 3D, que daría una imagen más completa de la morfología compleja del árbol ductal. Dada la complejidad de las interacciones célula-célula y célula-ECM que se producen en la glándula mamaria, el aislamiento de glándulas enteras, intactas es ventajoso para analizar eficientemente ductal expresión morfología y de la proteína en varias regiones de la mamario murino glándula.
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Protocolo
con sujetos animales en este protocolo los procedimientos fueron revisados y aprobados por la institucional Animal cuidado y uso de la Facultad de medicina osteopática de Filadelfia y todas las técnicas se llevaron a cabo bajo estrictas directrices éticas.
1. obtención de muestra y procesamiento
- seleccionar tema animal apropiado y el lugar en una cámara de CO 2. Para este experimento, usar 8-10 semanas viejo mujer B6 nulíparas. CG-Cav1tmMIs J y C57BI/6J.
- Vuelta en el flujo de gas a 30-40%. Una vez que el animal está visiblemente inconsciente después de unos 2 minutos, abra la válvula de gas a la presión total para un adicional 5 min
Nota: Confirman muerte de animales mediante la observación de signos visibles de la respiración (e.g. movimiento del pecho) por un período de 10 minutos después de la cesación de la entrega de CO 2. Si el animal todavía está vivo, se puede colocar en la cámara de CO 2. Dislocación cervical también puede utilizarse aunque no se recomienda como la sangre se puede acumular alrededor de las glándulas mamarias, interfiriendo con la disección y los resultados. - Después de sacrificio, perno canal en una posición supina y sature con etanol al 70%.
- Pellizcar la piel justo sobre el pubis con pinzas y nick con pequeñas tijeras quirúrgicas. Girando las tijeras, cortar la piel a lo largo de la línea media ventral en movimiento caudal a craneal.
- Con tijeras grandes o una pinza hemostática, sin rodeos disecar la fascia subcutánea bilateral, con precaución de no para perforar el peritoneo. Corte a lo largo de los márgenes horizontales en ambos extremos distales de la incisión. Las aletas
- pin la piel abrir y rociar nuevamente con etanol al 70%.
Nota: Aunque mejor distinción visual entre la glándula y el tejido subcutáneo circundante permite el uso de etanol al 70%, tenga cuidado para evitar la sequedad de los tejidos como resultado de uso de esta solución. Para evitar que se sequen, extirpar la glándula en un marco de tiempo no debe exceder los 4 minutos. Como alternativa a etanol al 70%, el investigador también puede sustituir un búfer de aislamiento general, tales como PBS 1 x, para evitar la desecación del tejido. - Localización de las glándulas mamarias de interés, deslice una hoja de bisturí #4 a lo largo de la parte interior de las aletas de la piel, cortar la glándula mamaria y asociado adiposo cutáneo de la dermis.
Nota: 3.5 x lupas quirúrgicas micro puede ayudar en la mejor visualización de las glándulas. - Inmediatamente sumerja la glándula recientemente aislada en tubo cónico que contiene el volumen de la solución del 10:1-tejido de formalina tamponada neutra 10% por 24-48 h.
Nota: Dependiendo de la intención del estudio, muchos fijadores alternativos pueden utilizarse como paraformaldehido, etanol para estudios de genómica y ARN comercialmente disponible preservar reservas. - Seguir protocolos institucionales para la inclusión en parafina, enviar muestras a un proveedor para el procesamiento, inclusión y rebanar/montaje de la diapositiva. Sección de los tejidos de 5 μm.
Nota: Debido al exceso de la glándula circundante adiposa, considerar retirar 100-200 μm del tejido antes de corte y coloración.
2. Tinción de tejidos
- inmunohistoquímica
- Coloque los portaobjetos teñido en el bloque de calor situado a 58 ° c por 1 h derretir parafina.
PRECAUCIÓN: Derretir la cera de parafina puede funcionar apagado. Vigilar de cerca o lugar para limpiar bajo diapositiva capturar cera escurrimiento.
Nota: Este paso no es esencial y puede omitirse. Si los resultados no son como esperaba, añadiendo este paso atrás puede mejorar los resultados. - Incubar los portaobjetos en una diapositiva de la jarra que contiene xileno 100% durante 30 minutos asegura la inmersión completa. Repetir una vez.
Nota: en este punto, la inspección visual debe realizarse para asegurar que las secciones de tejido libres de tejido adiposo y parafina. Si el tejido adiposo adicional o cera es evidente, la diapositiva debe volver a sumergir en xileno. Tenga cuidado para minimizar la exposición agregada a xileno como esto puede causar la contracción del tejido. - Rehidratar los tejidos en un tarro de la diapositiva que contiene etanol al 100% durante 10 minutos repetición una vez.
- Mover diapositivas a un frasco de la diapositiva que contiene etanol al 95% durante 10 minutos repetición una vez.
- Mover diapositivas una diapositiva tarro que contiene 75% de etanol por 5 min
- Mover diapositivas una diapositiva tarro contiene 50% de etanol por 5 min
- Solución de citrato de sodio 10 mM (pH 6.0) en una placa caliente o un microondas y verter en la jarra de Coplin.
PRECAUCIÓN: Cuidadosamente monitorear la solución mientras que calefacción y evite hervir sobre. Recipiente estará muy caliente. Use protección para evitar quemaduras. - Lentamente Coloque las muestras en recipiente jar, asegurar la inmersión completa e incuban a 100 ° C durante 10 minutos recuperar epitopos. Retire y seque cuidadosamente diapositivas.
- Dibujar una barrera alrededor de tejido con un marcador hidrofóbico. Añadir suficiente bloqueador de la enzima endógena (peróxido de hidrógeno y de azida de sodio, disponible comercialmente) para cubrir el tejido e incubar durante 10 minutos
- Sumerja los portaobjetos en fosfato x 1 tampón salino (PBS) durante 10 minutos
- Añadir suficiente suero de burro de 10% en PBS 1 x para cubrir el tejido e incubar 1 h a temperatura ambiente en una cámara humidificada.
Nota: El experimento puede hacer una pausa aquí por guardar las diapositivas en la cámara humidificada a 4 ° C durante la noche. Mientras que burro suero fue encontrado para obtener óptimos resultados de tinción, el investigador puede desear probar diferentes sueros como albúmina de suero bovino (BSA), suero de cabra o caballo suero para determinar resultados óptimos. Si utiliza BSA, el investigador debe preparar esta fresca antes del uso. - Decantar el exceso bloqueador de diapositivas y añadir anticuerpo primario correctamente diluido en 1% de suero directamente a asegurar que el tejido está cubierto uniformemente en la solución de las diapositivas. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente en una cámara humidificada.
Nota: Este paso puede continuarse durante períodos de tiempo más largo con cámara húmeda almacenada a 4 ° C. Asegúrese de incluir diapositivas de adecuado control negativo (p. ej. una diapositiva con ningún anticuerpo primario conocido tejido antígeno negativo, etc.) en este paso. - Cuidadosamente lavar portaobjetos por fluir aproximadamente 1 mL de diH 2 O sobre tejido e incubar en 1 cambio de 1 x PBS por 5 min
- PBS exceso de decantar y añadir suficiente etiqueta de peroxidasa de rábano picante para cubrir el tejido e incubar por 30 min en una cámara humidificada.
Nota: En este paso, el investigador puede proceder a la tinción utilizando anticuerpos secundarios conjugados fluorescencia fluorescente. Si esto se desea, los siguientes pasos se describe deben modificarse en consecuencia. - Cuidadosamente lavar portaobjetos por fluir aproximadamente 1 mL de diH 2 O sobre tejido e incubar en 1 cambio de 1 x PBS por 5 min
- Diaminobenzidina (DAB) más solución de cromógeno según la proporción sugerida del fabricante y mezclar por vortex.
Nota: Muchos kits preparados están comercialmente disponibles aparte de la que se utiliza en el presente Protocolo. - Decantar exceso de búfer de diapositivas y añadir 2-3 gotas (10-50 μL) de cromógeno mancha directamente a los tejidos y Incubar por 5 min en cámara húmeda. Lavar cuidadosamente las diapositivas por que fluye alrededor de 1 mL diH 2 O sobre tejido.
PRECAUCIÓN: Cromógeno DAB es altamente tóxico. Evitar el contacto directo de mancha con piel y recoge el flujo apagado en residuos peligrosos.
- Coloque los portaobjetos teñido en el bloque de calor situado a 58 ° c por 1 h derretir parafina.
- Hematoxilina y eosina (H & E)
- después de enjuague final después de la incubación del cromógeno, sumerja los portaobjetos en hematoxilina de Harris para diapositivas de 2-2.5 minutos enjuague suavemente con agua del grifo durante 1-2 minutos
Nota: tenga cuidado para evitar el chorro directo de agua en los tejidos. - Sumerja las diapositivas para 2-3 s en diferenciación solución 0,25 mL de ácido clorhídrico en 100 mL de etanol al 70%. Enjuague los portaobjetos suavemente con agua del grifo durante unos 1-2 minutos
- Sumergir diapositivas en agente azul (4.5 mg carbonato de calcio en 100 mL de agua, pH ajustado a 9.4) para 60 portaobjetos enjuague s. en etanol al 95% para 30 s.
- Sumerja los portaobjetos en eosina alcohólica Y para 2-3 min.
- Deshidratar el tejido en 2 cambios de etanol al 95% durante 1 minuto.
- Tejido de deshidratar en 1 cambio de etanol al 100% durante 1 minuto
- Diapositivas secas cuidadosamente con una toallita libre de pelusas. Aplicar 1 gota (aproximadamente 100-200 μL) sintéticas, no-acuosas, medios y aplicar cubreobjetos de montaje a base de resina.
Nota: Si se eligió un método de tinción diferente, un medio de montaje diferentes puede ser necesario. Por ejemplo, si el investigador eligió un anticuerpo secundario conjugado fluorescente, un montaje acuoso sería lo más ideal. - Permite diapositivas fijar un día para otro a temperatura ambiente.
- después de enjuague final después de la incubación del cromógeno, sumerja los portaobjetos en hematoxilina de Harris para diapositivas de 2-2.5 minutos enjuague suavemente con agua del grifo durante 1-2 minutos
- Rojo Picrosirio (PSR) tinción
- seleccionar las diapositivas a mancharse y seguir protocolo de inmunohistoquímica hasta el paso 6 (baño de etanol al 50%).
- Sumerja los portaobjetos en PSR manchan por 1 h.
- Sumergir las muestras en ácido acético al 0.5% para 1-2 s, dos veces para diferenciar mancha.
- Deshidratar los tejidos en 2 cambios de etanol al 95% durante 1 minuto.
- Deshidratar los tejidos en 1 cambio de etanol al 100% durante 1 minuto
- Claro diapositivas sumergiendo brevemente en xileno 100% de sobre 3-4 s.
- Diapositivas secas cuidadosamente con una toallita libre de pelusas. Aplicar 1 gota (aproximadamente 100-200 μL) sintéticas, no-acuosas, medios y aplicar cubreobjetos de montaje a base de resina.
3. Análisis de la muestra
- Análisis Ductal
- seleccionar diapositivas mancharon para α-SMA. Utilizando un microscopio de luz con un objetivo montado en cámara, recoger imágenes representativas con 20 aumentos.
- Utilizar ImageJ (NIH), distinguir y contar los conductos en cada imagen. Estos se pueden enumerar manualmente o se puede asignar una puntuación numérica a conductos individuales. Para asignar una calificación numérica, abra ImageJ y seleccione Plugins. A continuación seleccione Analyze y elija celda contador en el menú desplegable. Haga clic en inicializar luego resalte tipo 1 para conductos de etiquetado. Cuando haya terminado, seleccione resultados para ver la cuenta ductal.
Nota: tenga cuidado para verificar las estructuras ductales y vascular no. - En ' medida establecer ' opciones, compruebe ' perímetro ' y ' área de ".
- Usando la herramienta de polígono a mano alzada, dibujar una línea alrededor de cada tubo en el compartimento mioepiteliales (visibilidad ayudado por la mancha de α-SMA). Seleccione ' medida ' y registrar el perímetro y área.
- Otra vez con la herramienta de polígono a mano alzada, dibujar una línea a lo largo de la parte apical del epitelio ductal en el interior del lumen. Seleccione ' medida ' y registrar el perímetro y área.
- Restar del perímetro del compartimiento luminal del perímetro del compartimiento mioepiteliales para obtener la circunferencia del epitelio ductal. Restar el área del compartimiento luminal de la zona del compartimiento del mioepiteliales para obtener el área del epitelio ductal de.
- Análisis de inmunohistoquímica
- subir imágenes trasmitida a un software de análisis, como el ImageJ o FIJI Suite.
Nota: Este protocolo describe los pasos para la tinción de análisis con ImageJ y el plugin de herramientas de IHC. - Abrir la caja de herramientas de la IHC en el menú del Plugin. En el " seleccionar modelo " desplegable que se abre, seleccione mancha apropiada (es decir, H-DAB, PSR, etc.). Seleccione la " Color " opción para aislar la mancha. Se abrirá una ventana de resultados.
Nota: Este método es apropiado si una proteína de interés se encuentra en los espacios extracelulares o citosólicas, o está ligada a la membrana plasmática. Si la proteína de interés es nuclear, seleccionar " núcleos " pedirá el plugin para analizar la imagen de núcleos teñidos positivamente. - Utilizar el deslice el selector de Color para asegurar el aislamiento adecuado de la mancha sin fondo inclusión o exclusión de tinción excesiva.
Nota: Si el modo automático es incapaz de detectar el tinte o no produce imágenes aceptables, dibujar un cuadrado de región de interés (ROI) más identificada manchado región. En la ventana Toolbox de IHC, seleccione " tren " para dirigir el plugin en el destino correspondiente. - Convertir la imagen a 16 bits. Ir a imagen → tipo → 16 bit.
- Umbral de la imagen. Ir a imagen → ajuste → Auto umbral.
- Establecer la escala de medición de la imagen dibujando una línea de retorno de la inversión directamente sobre la barra de escala en la imagen entonces asignar la longitud. Para establecer la barra de escala, vaya a análisis → escala conjunto. El número de píxeles por la unidad de longitud (por ejemplo 120 píxeles por 50 μm) deseada de entrada.
- Medir el área resultante y valor de gris medio. Ir a la analizar → establecer medidas y recoger la medición haciendo clic en analizar → medida.
- subir imágenes trasmitida a un software de análisis, como el ImageJ o FIJI Suite.
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Resultados
Ratones hembras tienen 5 pares de glándulas mamarias. En concreto, hay un par de glándulas cervicales (#1), dos pares de glándulas torácicas (#2 y #3), un par de glándulas abdominales (#4) y 1 par de glándulas inguinales (#5) (figura 1A). Aquí, se aislaron las glándulas #4 ya que son fácilmente identificables. En algunas circunstancias, las glándulas #4 y #5 se aislaron juntos como distinción entre los dos fue difícil. Para aislar intacto #4 ...
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Discusión
En el papel, hemos descrito una técnica para aislar las glándulas mamarias de ratón intacto para análisis histológicos aguas abajo de ECM expresión y morfología ductal. Con respecto al análisis de la morfología ductal, esta metodología permite la rápida investigación de arquitectura ductal con sede fuera de las secciones histológicas teñidas. Otros métodos de análisis ductales dependen de inyecciones de colorantes para permitir la visualización del árbol ductal, métodos que pueden ser técnicamente difícil y desperdiciado...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean reconocer engaños abril y Dr. Roger Broderson de asistencia con animal necropsia y aislamiento de la glándula, respectivamente. Fondos para este trabajo fue apoyado por los centros de la Philadelphia College of Osteopathic Medicine para trastornos crónicos del envejecimiento.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microscopio óptico | Olympus | BX43 | |
| Cámara microscópica | Olympus | DP73 | |
| Software de análisis de imágenes | Olympus | cellSens Software | |
| NIH | ImageJ | ||
| 3.5x-R Micro lupas quirúrgicas | Rose Micro Solutions | Aumento a elección del investigador | |
| Mayo Tijeras | Medline | DYND04035 | |
| Estante de tinción | Fisher Scientific | 121 | |
| Plato de tinción | Fisher Scientific | 112 | |
| Frascos Coplin | Fisher Scientific | 19-4 | |
| Cubreobjetos de vidrio | Fisher Scientific | 12-550-15 | Tamaño apropiado para el tejido |
| IHC EnVision+ Kit (HRP, Mouse, DAB+) | Dako | K400611-2 | |
| Picrosirius Red Kit | Abcam | AB150681 | |
| Eosin Y, alcohólico | Sigma-Aldrich | HT110132 | |
| Harris Hematoxilina | Sigma-Aldrich | HHS16 | |
| Suero de burro | EMD Millipore | S30 | |
| 10% Formalina tamponada neutra | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Xilenos, grado reactivo | Sigma-Aldrich | 214736 | |
| etanol, 200 grados | Sigma-Aldrich | 792780 | adecuado para biología molecular |
| solución salina tamponada con fosfato, 1x | Gibco | 10010023 | |
| Citrato de sodio | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Carbonato de calcio | Sigma-Aldrich | 202932 | |
| permanente Medio de montaje | Dako | S1964 | |
| Eukitt Medio de montaje | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| Anticuerpo de fibronectina | Abcam | AB23750 | |
| Anticuerpo de tenascina-C | Abcam AB108930 | ||
| Alpha Músculo liso Anticuerpo de actina | Abcam AB124964 | ||
| Dako Envision Sistema de doble enlace HRP | Dako | K4065 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
