Artículo de método

Un método eficiente y Simple para establecer líneas de células T de pacientes con infección crónica activa Virus Epstein - Barr y NK

DOI:

10.3791/56515

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30 de marzo de 2018

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1Genetic Resources Center, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, 2MOE Key Laboratory of Major Diseases in Children, National Key Discipline of Pediatrics, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infection Diseases, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, 3State Key Laboratory of Molecular Developmental Biology, Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences

En este artículo

Resumen

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Un método simple para la obtención de clones de células T y NK de pacientes CAEBV fue desarrollado con eficacia alta, una pequeña cantidad de sangre periférica y una baja dosis de IL-2.

Resumen

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Un número de métodos se ha descrito para establecer líneas de células NK/T de pacientes con linfoma o linfoproliferativo síndrome. Estos métodos emplean células de alimentador, células NK o T purificadas con tanto como 10 mL de sangre o una dosis alta de IL-2. Este estudio presenta un nuevo método con una estrategia potente y simple para establecer líneas de células T y NK por cultivo periférico de la sangre las células mononucleares (PBMC) con la adición de IL-2 humana recombinante (rhIL-2) y utiliza tan poco como 2 mL de sangre entera. Las células pueden proliferar rápidamente en dos semanas y se mantuvo por más de 3 meses. Con este método, se han establecido 7 líneas NK o células T con una alta tasa de éxito. Este método es simple, confiable y aplicable para el establecimiento de líneas celulares de más casos de linfoma CAEBV o NK/T.

Introducción

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Virus de Epstein - Barr (EBV) es ubicuo y se infecta no sólo las células de B, pero también T y células naturales del asesinas (NK), que causa un número de enfermedades linfoproliferativas NK/T EBV-asociado (LPD) y linfoma, leucemia, como hemophagocytic EBV-asociado lymphohistiocytosis, Hidroa vacciniforme-como el linfoma, el linfoma de células NK/T extranodal, tipo nasal y NK agresiva de la célula leucemia1,2,3. Entre éstos es severa active EBV (SCAEBV) enfermedad crónica, que es incidente principalmente en Asia oriental, y que ahora se considera un LPD causada por la expansión clonal de EBV-infectadas T o NK células4,5,6, 7, pero sin la aparente inmunodeficiencia presentes en mononucleosis infecciosa (IM)-como síntomas incluyendo fiebre, hepatoesplenomegalia, linfadenopatía y disfunción del hígado persistente o recurrente, así como alta DNA del VEB de la carga en el sangre periférica de8,9. Los pacientes con CAEBV tienen un pronóstico pobre10,11y su patogénesis y desconoce el papel de la EBV. Por lo tanto, la célula líneas derivadas de las enfermedades lymphoproliferative EBV-asociado NK/T y los linfomas son muy útiles como modelos celulares para clarificar el mecanismo de la EBV indujo proliferación NK o células T y su relación con alta incidencia de leucemia o linfoma.

Hasta la fecha, se han establecido varias líneas celulares con diferentes técnicas12,13,14,15,16. Una línea humana de la célula NK, NK-YS, fue establecida de leucemia/linfoma de células NK, por co-cultivo con una línea de células estromales de ratón como alimentador y en presencia de rhIL-2 en una concentración de 20U por mL15. KAI3 fue otra línea de células NK establecido de pacientes con alergia severa de mosquito o SCAEBV con línea de células limfoblastoides autólogas (LCL), células B transformadas por EBV, como células de alimentador y adición de rhIL-2 100U/mL16. SNK6 y SNT8 se derivan de los tejidos tumorales de pacientes de linfoma de la célula NK/T nasales mediante la adición de altas dosis de rhIL-2 (700U/mL)12. Con técnica similar, la célula de SNK-1 era de pacientes CAEBV, cultivados de PBMC quitando las células de T y adición de 700U/mL de rhIL-213,17. SNT13 y SNT15 fueron establecidos mediante la eliminación de CD4 + y CD8 + células18. Hasta ahora, otras líneas celulares de células T y NK de pacientes LPD EBV-NK/T fueron todos desarrollados con este método19.

Las desventajas de los métodos existentes antes mencionados incluyen el empleo de células de alimentador, el requisito de una alta dosis de IL-2, la utilización de tanto como 10 mL de sangre entera o la purificación de las células NK/T, que es muy difícil en la clínica debido a la necesidad de verificar que tipos de celular latente EBV infecta antes de empezar a la cultura. Como CAEBV ocurre principalmente en niños en Asia, 10 mL de sangre no es fácil de adquirir en todas las regiones. En este estudio, hemos desarrollado un nuevo método simple con un alto índice de éxito para establecer líneas NK y célula de T por cultivo PBMC de pacientes CAEBV usando una dosis baja de rhIL2 y un volumen de 2 mL de sangre sin células de alimentador. Los resultados de este método han demostrado su alta eficiencia y ahorro de tiempo.

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Protocolo

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Este estudio fue aprobado por el Comité de ética del Instituto de genética y Biología del desarrollo, Academia China de Ciencias, y el protocolo sigue los lineamientos institucionales para el bienestar humano.

Nota: Vea la figura 1 para un diagrama esquemático del flujo de trabajo.

1. aislamiento de PBMC de CAEBV pacientes

  1. Purificar primaria PBMC de 2 mL de sangre total de pacientes CAEBV por gradiente (p. ej., placa de Ficoll) centrifugación siguiendo las instrucciones del fabricante. Por otra parte, deshielo cryopreserved PBMC de nitrógeno líquido con Medio RPMI 1640.
  2. Añadir 2 μl de azul tripán (0,4%) a 18 μL célula suspensión, espere 3 minutos para teñir las células, transferir la suspensión a la placa del contador de célula y medir la concentración y viabilidad con un contador de células automatizado de las células.
  3. Preparar la suspensión celular con una densidad de 2-3 x 106 células/mL con medio de cultivo RPMI 1640 completo que contiene 20% de suero humano (inactivado a 56 ° C por calor), 2 mM L-glutamina y antibióticos (estreptomicina 100 de μg/mL, 100 U/mL de penicilina). Sembrar 1 mL de la suspensión PBMC por pozo en placas de cultivo celular de 24 pozos.
  4. Añadir 150 U rhIL-2 por pocillo.
  5. Colocar las placas en una 5% CO2 incubadora a 37 ° C.
  6. En el día 2, observar la morfología de la célula bajo el microscopio (200 aumentos); las células están en buenas condiciones cuando son brillantes y redondos.

2. expansión de las células y las células viables de numeración

  1. Observar la morfología de la célula bajo el microscopio (200 aumentos) y vigilar la condición del crecimiento celular numerando las células antes de cambiar de medio: Añadir 2 μl de azul tripán (0,4%) a 18 μL célula suspensión y calcular la concentración de las células (ver 1.2, Figura 2).
  2. Deseche 500 μl del medio en una placa de 24 pocillos y agregar 500 μl completa cultura medio fresco. Añadir 150U rhIL-2 por pocillo.
  3. Cambiar el medio dos veces a la semana como en el paso 2.2.
  4. Dibujar la curva de crecimiento de la célula (figura 3).
  5. Cuando excede la concentración de células viables/ml6de 5 × 10, se dividen las células en nuevos pozos a una concentración de 1-2 × 106 células/mL en cada pozo. Este proceso toma de 2-4 semanas.

3. célula Phenotyping por citometría de flujo

  1. Cuando las células se han ampliado, recoger 1 × 106 células para determinar los fenotipos de líneas celulares. Centrifugar las células a 240 x g durante 5 min a temperatura ambiente (células de NK/T precipitará en el fondo del tubo).
  2. Eliminar el sobrenadante, lavar la precipitación añadiendo 7 mL de PBS. Centrifugar durante 5 min a 240 x g a temperatura ambiente. Repetir una vez.
  3. Añadir suero humano de 200 μL en cada tubo, mezclar bien e incubar 10 min a temperatura ambiente.
  4. Centrifugar las células a 240 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en el 1 × 106/mL con PBSA frío (PBS+0.2%BSA). Se dividen las células en 5 tubos, cada tubo contiene 2 × 105 células.
  5. Centrifugar las células a 240 x g durante 5 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante y resuspender las células con buffer PBSA o PBSA que contienen 10 μl PE (PE-Cy7) y 10 μl FITC anticuerpos para receptores de las células de las células T o NK en el hielo la mancha como indica la figura 4. Las células suspendidas con tampón PBSA se utilizan como un control negativo.
  6. Incubar las células con anticuerpos para 20-30 min en hielo en la oscuridad.
  7. Lavan las células dos veces con frío PBSA, resuspender las células con 300 μL PBSA frío.
  8. Analizar el fenotipo de la célula con un citómetro de flujo.
    1. Configurar el citómetro de flujo en condiciones de "Crear hoja de trabajo". Configurar la plantilla experimental con una trama de puntos que muestra forward scatter (FSC) versus dispersión lateral (SSC).
    2. Cargar el tubo de control de isotipo para optimizar las tensiones de FSC y SSC y optimizar el valor de umbral FSC para eliminar residuos sin interferir con la población de la célula de interés. Borrar todos los parámetros excepto el FSC y SSC, FITC, PE, PE-Cy7.
    3. Realizar compensación usando el control de isotipo y un solo control positivo en cada grupo de análisis de color de 2.
    4. Cargar las muestras y crear HLA-DR VS CD19, CD4 VS CD8, CD56 VS CD16 y CD3 VS CD16 parcelas punto mostrando diferentes poblaciones de células.
      Nota: PBMC fueron utilizados para realizar la indemnización mediante el control de isotipo de negativo y control positivo solo. inmunofluorescencia de 2 colores con citómetro de flujo se utilizó rutinariamente para analizar la expresión de marcadores de superficie. Se incluyen los siguientes anticuerpos: anti-HLA-DR, anti-CD4, anti-CD16 conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC), anti-CD8 anti-CD56, conjugados con ficoeritrina (PE) CD3 y anti-CD19 conjugado con PE-Cy7.

4. expansión y criopreservación de células NK/T

  1. Cambiar el medio una vez terminado el análisis del fenotipo de la célula. Retirar la mitad del sobrenadante cuidadosamente y evite tocar las células en la parte inferior de la placa. Añadir el mismo volumen de medio de cultivo fresco que contenga 300 U/mL rhIL-2 a las placas de la celda.
  2. Cambiar la mitad del medio cada 3 días (2.2) hasta la celda racimos son claramente visibles bajo el microscopio (figura 2). Por lo general, este proceso tarda 2-3 semanas.
  3. Transferencia de las células de las placas de 24 pocillos para frascos de cultivo T25 después de mezclar diferentes pozos del mismo linaje. Doble del volumen de medio de cultivo resulta amarillo hasta que el volumen del medio se amplía a 10-15 mL. Añadir rhIL-2 con la concentración de 150 U/mL.
  4. Cambio medio 24 h antes de congelar después de 2-3 semanas de crecimiento, cuando la célula masa puede observarse a simple vista. Medir la concentración de células con un contador de células.
  5. Centrifugar la suspensión celular por 5 min a 240 g de x y Resuspenda el sedimento celulares a una densidad de 5-10 x 106 células/mL con la solución congelada que contiene 90% de suero fetal bovino y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Congelación a una velocidad de 1 ° C por minuto hasta-80 ° C y luego se transfieren directamente en nitrógeno líquido.

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Resultados

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Después de 3 días de la cultura durante el establecimiento de líneas celulares, las células polimórficas comienzan a aparecer (figura 2). Después de 7 días, las células crecen rápidamente, mientras que el número y viabilidad de las células se aumentan a una velocidad alta (figura 3). Pequeños grupos de células son claramente visibles después de 10-14 días de crecimiento, cuando la concentración de células puede superar los 3-6 × ...

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Discusión

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En este protocolo, se ha desarrollado una nueva técnica para el establecimiento de líneas de células NK/T de la sangre de los pacientes CAEBV. En comparación con los métodos existentes, la gran ventaja de este método es su simplicidad y su exigencia de sólo un pequeño volumen de sangre, mientras que exhibe un alto índice de éxito y buenas condiciones de la viabilidad celular. Además, las líneas de la célula NK/T pueden establecerse mediante cultivo PBMC sin determinar los tipos de células EBV latente infectado por adelan...

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Divulgaciones

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D.Z., X.Z. y XC son inventores Co en solicitudes de patentes pendientes que cubren posibles usos de este método para el establecimiento de líneas de células NK/T y las líneas celulares establecidas en el presente estudio. D.Z., X.Z. y XC no declaran a intereses financieros que compiten en este trabajo. Los restantes autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

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Este trabajo fue financiado por los proyectos clave de la Academia China de Ciencias (KFZD-SW-205), estratégica biológica recursos tecnología sistema de apoyo de la Academia China de Ciencias (CZBZX-1 y ZSSB-004) y por donaciones de la Fundación Nacional de Ciencias de China ( 81401640) y fondo de Ciencias naturales (14ZR1434800) de Shanghai.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Hu HLA-DR FITCBDanticuerpo para FACS
Hu CD4 FITCBD555346anticuerpo para FACS
Hu/NHP CD8 PEBD557086anticuerpo para FACS
Hu CD3 PEBD555340anticuerpo para FACS
Hu CD16 FITC 3G8BD555406 anticuerpo para FACS
Hu/NHP CD56 PE MY31BD556647anticuerpo para FACS
hu/CD19 PE-Cy7BD560728anticuerpo para FACS
humano IL-2Roche11147528001
suero humanoMRCCCC118-125
incubadora de CO2SANYO
CentrífugaTechcompCT6TMicroscopio de centrifugación
OLYMPUS CKX53CKX53
Contador de células automatizadoCountstarIC 1000Para el recuento de células
24 pocillos clúster de cultivo celularCorning Incorporated3524Placas de poliestireno Matraz de
cultivo celular de 25cm2Nest707001Poliestireno
FBSGibco10270Componente del medio celular
RPMI Medio 1640vida22400089Para medio celular
L-glutaminaAmresco374Componente del medio celular
100 x estreptomicina solución de penicilina BioRoYeeBRY-2309BioRoYeeBRY-2309Componente del medio celular
Ficoll paque plusGE Healthcare17-1440-03Para el aislamiento in vitro de linfocitos
DMSOSigmaD2650Para la congelación de células
citómetro de flujoBDBD FACSAria II
softwareBDBD FACSDiva softwareFACS análisis
560944

Referencias

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