Method Article

Un protocolo para Decellularizing ratón cócleas para ingeniería de tejidos del oído interno

DOI:

10.3791/56523

⸱

January 1st, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology, University of Kansas Medical Center, 2Stephenson School of Biomedical Engineering, University of Oklahoma, 3Department of Plastic Surgery, University of Kansas Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El objetivo de este protocolo es un método eficaz para decellularize y descalcificar cócleas de ratón para utilización como andamios para aplicaciones de ingeniería de tejidos.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En los mamíferos, las células de pelo de mechanosensory que facilitan la falta de audiencia la capacidad de regenerar, que ha limitado los tratamientos para la pérdida auditiva. Estrategias actuales de la medicina regenerativa se han centrado en el trasplante de células madre o la manipulación genética de células de apoyo en el oído interno para estimular la sustitución de células dañadas para corregir la pérdida de la audición de alrededor. Sin embargo, la matriz extracelular (ECM) puede jugar un papel vital en inducir y mantener la función de las células de pelo y no ha sido bien investigada. Usando el coclear ECM como un andamio para cultivar células madre adultas puede proporcionar perspectivas únicas en cómo la composición y la arquitectura del entorno extracelular ayuda a las células en el mantenimiento de la función auditiva. Aquí presentamos un método para aislar y decellularizing cócleas de ratones para usar como andamios aceptar perfusión células madre adultas. En el actual protocolo, cócleas son aislados de ratones eutanasia, decellularized y descalcificada. Después, celdas de jalea de Wharton humana (hWJCs) que fueron aisladas de cordón umbilical fueron perfundidas con cuidado en cada cóclea. Las cócleas fueron utilizados como Biorreactores, y las células fueron cultivadas durante 30 días antes de someterse a tratamiento para el análisis. Decellularized cócleas conservan estructuras extracelulares identificables, pero no reveló la presencia de células o notables fragmentos de ADN. Perfundidos en la cóclea las células invadieron la mayor parte del interior y el exterior de la cóclea y crecieron sin incidentes con una duración de 30 días. Así, el método actual que puede utilizarse para estudiar cómo coclear ECM afecta desarrollo de las células y comportamiento.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cóclea es una estructura intrincada espiral encontrada en el hueso temporal. Se compone de un exterior laberinto óseo y laberinto membranoso concéntricos, interior1. El laberinto membranoso consta de tres espacios fluidos: vestibuli de Scala, Scala tympani de Scala1y medios. Los medios del scala alberga el epitelio sensorial, que se compone de una multitud de tipos celulares, pero las células de pelo sensoriales (HC), que transduce la energía mecánica de las ondas sonoras a impulsos nerviosos2, son de particular interés. Exposición a trauma acústico3,4,5, medicamento6, enfermedad7,8y9 de envejecimiento puede resultar en deterioro de la función auditivo por medio de la muerte HC. Pérdida de células ciliadas en los mamíferos es permanente, a diferencia de HCs aviares, que pueden regenerar después de lesión10.

Una variedad de esfuerzos de investigación han intentado restablecer perdidos HCs, aunque varían los enfoques experimentales específicos. Manipulación de expresión génica en el epitelio sensorial y la implantación de células diferenciadas fuera del cuerpo son los enfoques dominantes en el campo, aunque han sido métodos de inducción que buscan diferenciar células madre en organoides coclear trató de11,12,13. Cada uno de estos enfoques es dependiente directamente de las células madre o las claves del desarrollo utilizadas por las células de vástago; sin embargo, un segundo compartido y potencialmente crítico, elemento es el ECM de la cóclea se14,15.

El ECM no sólo proporciona soporte físico para las células y tejidos, que incluye una superficie para la adhesión celular, proliferación, supervivencia y migración, pero también juega un papel crítico en el desarrollo de HCs y la espiral del ganglio15,16 ,17. Naturalmente ECM que ofrece señales inductivas que pueden guiar la determinación de fenotipo celular o de adhesión, proliferación y supervivencia de la célula18. En consecuencia, el uso de la cóclea decellularized en combinación con hWJCs cultivadas ofrecen una oportunidad única para explorar el papel de la regeneración de ECM y HC. HWJCs son un tipo de disponible, no controvertida de la célula aislado de humanos los cordones umbilicales que se comportan como células madre mesenquimales19. HWJCs han demostrado la capacidad de diferenciarse hacia abajo célula neurosensorial linajes20,21. Así, el protocolo actual detalla el aislamiento, la descelularización y perfusión de cócleas de canales de ratón C57BL con hWJCs para ingeniería de tejidos del oído interno.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se realizaron todos los procedimientos, incluyendo la eutanasia animal, según el (ACUP #2014-2234) protocolo aprobado institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en la Universidad de Kansas Medical Center (KUMC).

Nota: HWJCs fueron aislados de humanos los cordones umbilicales que fueron donados por los pacientes que el consentimiento informado y se utilizaron muestras según los protocolos aprobados por el Comité de temas humanos de Universidad de Kansas (KU-IRB #15402).

1. hueso Temporal cosecha y aislamiento de la cóclea

  1. Decapitar un ratón apropiadamente eutanasia, 15 semanas de edad por el corte entre el cráneo y primera vértebra cervical con un fuerte par de tijeras quirúrgicas, luego rocíe abajo de la cabeza con etanol al 70% para desinfectar (figura 1A).
  2. Atraviesan el cráneo en un plano sagital, utilizando el mismo par de afilado de tijeras quirúrgicas (figura 1B-C, las líneas punteadas).
  3. Retire el tejido cerebral del cráneo con un par de fórceps (figura 1, flecha).
  4. Identificar el hueso temporal a través de la presencia del auditorio y las raíces del nervio vestibular (Figura 1E-F, puntas de flecha) en el interior del cráneo y el conducto auditivo externo desde el exterior (Figura 1F, flecha). Corte cuidadosamente a través del cráneo para aislar el hueso temporal del resto del cráneo (figura 1).
    Nota: En algunos casos, puede ser posible para delicadamente los huesos circundantes del cráneo del hueso temporal sin necesidad de corte.
  5. Inserte el fórceps fino en la abertura del conducto auditivo aproximadamente 5 mm (figura 1 H), por lo que las puntas no hay riesgo de punción de la cóclea. Con cuidado romper el hueso de la ampolla (figura 1 H, área sombreada roja superior) para fracturas (figura 1I, rojo punteado de línea).
    Nota: Si es necesario, un microscopio de disección puede ayudar en este proceso para asegurar la exacta ubicación y manipulación de instrumentos.
  6. Con unas pinzas finas, haga palanca, el resto de la ampolla del hueso temporal, exponiendo el laberinto óseo de la cóclea (Figura 1J, soportes de rojo).
  7. Colocar una placa de Petri lo suficientemente grande como para sostener el hueso temporal (por ejemplo, 30 mm o mayor) por debajo de la disección alcance campo de visión y llenarlo con suficiente fosfato tampón salino (PBS) para cubrir el hueso temporal (p. ej., 0,5 a 1 mL).
  8. Sumergir el hueso temporal con la bulla en el PBS con las ventanas redondeos y ovales de la cóclea hacia arriba.
    Nota: El retiro del sistema vestibular de la cóclea no es necesario, como el sistema vestibular sirve bien como un mango para manipular y orientar las funciones de la cóclea (figura 1I y figura 2B).
  9. Con un ultra fino par de pinzas, quite la arteria stapedial, que pasa a través del estribo.
  10. Inserte una punta de las pinzas ultra finas por el arco del estribo donde la arteria pasa a través y delicadamente Levante el estribo. El estribo desarticulado debe levantar fuera de la ventana oval.
  11. Usando una punta de las pinzas ultra finas, el óvalo de la puntura y alrededor de windows.
  12. Usando un PBS 1 x relleno 28,5 calibre jeringa con un tubo (diámetro interno 0,28 mm, diámetro externo mm 0,61) Unido, coloque el tubo sobre la ventana oval (figura 2A -B).
    Nota: La apertura del tubo puede ser manipulada usando fórceps ultra fina, ayudando a garantizar una colocación exacta.
    1. Utilice una nueva jeringa y tubo para cada cóclea.
  13. Perfusión 2 mL de antibiótico-antimicótico (anti-anti) 10% y 10% penicilina-estreptomicina (pen-strep) en PBS a través de la cóclea más 5 minutos para quitar la perilinfa. Inunda demasiado rápido con demasiada presión puede dañar las estructuras finas dentro de la cóclea.
    Nota: Conducción manualmente de la jeringa con la mano para inundar el líquido a través de la cóclea es eficaz, aunque una bomba de perfusión podría utilizarse como alternativa.
    1. Si inunda manualmente, utilice un par de multa, cierre pinza estabilizar la cóclea (figura 2A) durante la perfusión agarrando la porción vestibular del hueso temporal.
      Nota: Aunque no es necesario, esto deja ambas manos libres manejar los instrumentos; una mano puede conducir a la jeringa (figura 2A) mientras que el otro puede colocar el tubo correctamente (figura 2B).
    2. De este paso adelante, tenga cuidado para evitar exponer la cóclea innecesariamente al aire. Introducir burbujas de aire en los espacios líquidos bloqueará la circulación del líquido, y secar más dañará las bellas estructuras dentro de la cóclea.
  14. Retire y deseche cualquier restantes fragmentos de tejido y hueso músculo con unas pinzas finas.
  15. Si es necesario, almacenar cócleas aislados a 4 ° C en anti-anti 10% y 10% solución de pen-strep en PBS durante siete días con cambios regulares de solución de antibiótico cada 48 h.

2. coclear procesamiento

  1. Descelularización
    1. Para cada cóclea, llenar una cubeta de centelleo de vidrio de 20 mL con un 1% sodio dodecil sulfato en solución (SDS) en agua desionizada de (DI), que se utiliza para decellularize la cóclea.
    2. Cortar la punta de una plástico 7 mL pipeta usando una cuchilla de afeitar para que la abertura es suficientemente grande para que una cóclea pasar a través.
    3. Usando la pipeta de transferencia, suavemente elaborar la cóclea con la pipeta por lo que sólo pasa el borde de corte por unos milímetros.
    4. Expulsar a la cóclea en el vial de centelleo lleno de solución 1% SDS.
    5. Circular 2 mL de SDS 1% en agua desionizada (DI) a través de la cóclea en el vial de centelleo con una pipeta de transferencia.
    6. Coloque el frasco centelleo en un rotor y deje que el frasco centelleo girar a 10 rpm durante 72 h a temperatura ambiente.
      1. Cambiar solución SDS al 1% cada 24 h durante un periodo de 72 h. Tenga cuidado cuando cambie de SDS para nunca exponer la cóclea al aire.
    7. Lave la cóclea tres tiempos de 30 min con agua desionizada.
Realizar los lavados en el mismo vial de centelleo usado para los cargos de SDS; en esta etapa, la cóclea es decellularized.
  • Descalcificación
    1. Quite el agua restante de la DI desde el vial de centelleo, dejando sólo lo suficiente para mantener la cóclea sumergido.
    2. Para empezar la descalcificación, añadir 5 mL de 10% de ácido etilendiaminotetracético (EDTA) (0.02 M) en agua desionizada para el vial de centelleo con la cóclea.
    3. Circular 2 mL de EDTA de 10% en agua desionizada a través de la cóclea en el vial de centelleo con una pipeta de transferencia.
    4. Vuelva a colocar el vial de centelleo en el rotor y deje que el frasco centelleo girar a 10 rpm durante 72 h a temperatura ambiente. Cambiar la solución de EDTA de 10% cada 24 h durante un periodo de 72 h. Tenga cuidado cuando cambie las soluciones para que la cóclea no está expuesta al aire.
    5. Enjuague la cóclea 3 veces durante 2 h cada uno con PBS 1 x; en esta etapa, la cóclea es descalcificada.
  • Almacenamiento de información
    1. Almacenar las cócleas hasta 72 h en una solución 10% anti-anti, 10% pen-strep en PBS a 4 ° C.
      Nota: Períodos más largos de almacenamiento pueden ser posibles con cambios regulares de solución de antibiótico; sin embargo, almacenaje extendido de cócleas procesados no ha sido validado en el presente Protocolo.

    • 3. adquisición y ampliación de hWJCs

    1. HWJCs aislante según protocolos previamente publicados22. Brevemente, segmento de cordón umbilical en secciones de 3 cm.
    2. Cuidadosamente hacer una incisión superficial con un bisturí a lo largo de cada segmento de cordón umbilical para desenrollar y exponer la gelatina de Wharton del cordón umbilical. Use pinzas para sacar los vasos sanguíneos.
    3. Lave los segmentos cordón umbilical dos veces con suficiente PBS (p. ej., 40 mL en una placa de Petri de 60 mm) para sumergir el tejido. Pique finamente segmentos de tejido con un bisturí. Digerir el tejido en una placa de Petri con 50 mL de medio de digestión de 100 mm (colagenasa tipo 2 de 0.2%, 1% de penicilina-estreptomicina, baja glucosa en medio (DMEM modificado Eagle de Dulbecco)).
    4. Coloque el tejido en digerir medio en un agitador orbital a 50 rpm durante la noche en un 5% CO2, incubadora de 37 ° C. Al día siguiente, diluya medio de digestión en una proporción de 1:16 en el 2% antibiótico-antimicótico en PBS y de la pelotilla de las células por centrifugación a 500 x g a temperatura ambiente (~ 27 ° C) por 10 minutos descartar sobrenadante.
    5. Resuspender el pellet en células madre mesenquimales crecimiento medio (MSCGM) y combinar celdas. Las células de la placa a una densidad de 7 x 103 células/cm2 en cultivo de tejidos tratan frascos de T-75. HWJCs en MSCGM de la cultura y ampliar al paso 5 para experimentos.
      Nota: HWJCs puede cultivarse el en T-frascos más grandes (e.g., T-150, T-300) cuando pases para aumentar la producción de hWJCs para los experimentos.

    4. infusión de hWJCs en cócleas Decellularized

    1. Preparar cócleas decellularized
      1. Utilizando una técnica aséptica, lavar cócleas almacenados en PBS 1 x tres veces para 30 minutos.
      2. Transferencia de cócleas en pocillos distintos de una placa de 24 pocillos y agregar 1 mL de 37 º C previamente calentado MSCGM.
      3. Incubar cócleas en un 5% CO2, incubadora de cultura celular de 37 ° C durante un mínimo de 1 h antes de la infusión de células.
    2. Se disocian hWJCs y resuspender
      1. HWJCs de lavado con 37 º C previamente había calentado 1 x PBS dos veces.
      2. Añadir suficiente 37 º C previamente calentado tripsina con EDTA 0.5% para cubrir la superficie de la célula recipiente.
      3. Incubar hWJCs para hasta 5 min en un 5% CO2, incubadora de 37 ° C de la célula cultura.
        1. Verificar que el 90% de las células han separado de la superficie de cultivo celular mediante la visualización de las células bajo un microscopio invertido.
          Nota: Las células que se mueven cuando la nave de cultura es golpeada suavemente, han destacado. Las células que permanecen inmóviles, no han separado.
        2. Golpee ligeramente los lados del frasco para desalojar más células adjuntas.
      4. Utilizando una técnica aséptica, transferencia hWJCs del recipiente de cultivo a un tubo cónico de 50 mL que contiene un volumen equivalente de MSCGM en el volumen de la tripsina se utiliza para disociar las células.
      5. El hWJCs de pellets por centrifugación a 500 x g a temperatura ambiente (~ 27 ° C) durante 5 minutos.
      6. Aspirar el sobrenadante y resuspender el hWJCs en MSCGM en una concentración de 500.000 células/mL.
    3. Perfusión de cócleas
      1. Cócleas de transferencia a una nueva placa de 24 pocillos usando una pipeta de transferencia.
      2. Añadir una gota de MSCGM a cada cóclea para prevenir cualquier cóclea de la desecación.
      3. Oriente con delicadeza la cóclea usando fórceps ultra fina para que las ventanas ovales y redondeos son hacia arriba.
        Nota: Tenga mucho cuidado al manipular directamente cada cóclea como la cóclea se daña fácilmente.
      4. Utilizando una jeringa de insulina estéril de calibre 28,5 con tubería conectada, elaborar hWJCs 0,2 mL suspendida (100.000 células).
      5. Con unas pinzas finas esterilizadas, posición de la tubería sobre la ventana oval.
      6. Con delicadeza y lentamente perfusión la cóclea con 0.2 mL de hWJCs resuspendido utilizando una jeringa de insulina de 28,5 calibre conectada a la tubería de polietileno (diámetro externo: 0,61 mm, diámetro interior: mm 0,28) durante aproximadamente 5 minutos.
      7. Después de la perfusión, agregar 0,8 mL de 37 º C previamente calentado MSCGM a bien que contiene la cóclea para llevar el volumen total en el pozo a 1 mL.
      8. Repita los pasos 4.3.3-4.3.7 para cada cóclea, utilizando una jeringa nueva y cada vez que la tubería.
      9. Lugar de cócleas inundadas en un 5% CO2, incubadora de 37 ° C de la célula cultura y cambiar los medios de comunicación tres veces por semana.

    5. conservación y cosecha cóclea

    Nota: Cócleas pueden ser cultivados y cosechan en cualquier momento perfusión posterior de hasta 30 días.

    1. Para conservar cócleas, fijar en paraformaldehído al 4% en PBS 1 x durante la noche a 4 ° C en una plataforma oscilante.
    2. Después de la fijación, lavado cócleas con PBS 1 x tres veces por 5 minutos cada uno.
    3. Poco a poco deshidratar cóclea con etanol y claro con un solvente hidrocarburo alifático antes de inclusión en parafina.
    4. Sección muestras a un grosor de 10 μm utilizando un micrótomo y montar en portaobjetos de vidrio.
      Nota: Las muestras están ahora listas para histológica o immunohistochemical usando protocolos estándar.

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    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Utilizando los métodos presentados aquí, éxito descelularización de cócleas se evaluó mediante el examen de la presencia o ausencia de ADN a través de 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) tinción. Cócleas eran considerados totalmente decellularized si ADN no fue identificado dentro de la cóclea decellularized. Una cóclea nativa de un experimento anterior que no experimentaron descelularización o descalcificación se utilizó como control positivo para ilustrar las estructuras y células que...

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    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Con éxito hemos demostrado que las células cocleares nativas pueden extraerse de la cóclea a través de un proceso de descelularización, que permite el uso de la cóclea como un andamio de tejido intrincado, tridimensional. Santi et al. 15 desarrolló el método inicial para cócleas decellularizing y con precisión se han estimado los volúmenes de muchas estructuras cocleares a través con la ayuda de microscopia de luz hoja23. Estos primeros trabajos sirvieron de base f...

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    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Los autores no tienen nada que revelar.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    El proyecto fue financiado por la Universidad de Kansas Prueba de concepto de fondo. Nos gustaría agradecer al personal de enfermería en el KUMC (Kansas City, KS) para asistirnos en la obtención de cordones umbilicales humanos y David Jorgensen para ayudar con las culturas de cócleas.

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    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Centrífuga Allegra X-14RBeckman-CoulterB08861
    Tubo semirrígido intramedicBecton Dickinson427401
    New Brunswick Innova 2000 Shaler orbitalEppendorfM1190-0002
    Tijeras quirúrgicasFine Science Tools14060-10
    Pinzas finasFine Science Tools11370-40
    Pinzas ultrafinasFine Science Tools18155-13
    Tubos cónicos de 50 mlFisher Scientific12565271
    Placa de PetriFisher ScientificFB087579B
    Jeringa de insulina U-100Fisher Scientific14-829-1B
    Vial de centelleoFisher Scientific03-341-73
    RotadorFisher Scientific88-861-049
    Pipeta de transferenciaFisher Scientific22-170-404
    Hoja de afeitarFisher Scientific12-640
    Antibiótico-AntimicóticoFisher Scientific15-240-062
    Penicilina-estreptomicinaFisher Scientific15-140-122
    Placade 24 pocillosFisher Scientific07-200-84
    SuperFrost PLUS Portaobjetos de microscopio de vidrioFisher Scientific12-550-15
    Pipeta de transferenciaFisher Scientific22-170-404
    ProLong Gold Antidecolorante con DAPIFisher ScientificP36935
    Clear-Rite 3Fisher Scientific22-046341
    Thermo Scientific Forma Series II 3110 Incubadora de CO2Fisher Scientific13-998-078
    Medio de crecimiento de células madre mesenquimalesLonzaPT-3001
    Tripsina-EDTALonzaCC-3232
    TPP T-75 Matraz de cultivoMidSciTP90076
    TPP T-150 Matraz de cultivoMidSciTP90151
    TPP T-300 Matraz de cultivoMidSciMicroscopio de
    Nikon InstrumentsSMZ800
    Microscopio invertido Nikon Eclipse Ts2R-FLNikon InstrumentsMFA51010
    NuAire Clase II, Tipo A2 Cabina de bioseguridadNuAireNU-425-600
    1X PBSSigma-AldrichP5368-10PAK
    1% SDS SoluciónSigma-Aldrich436143-100G
    10% EDTASigma-AldrichE9884-100G
    disección TP90301

    References

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