Artículo de método

Síntesis y evaluación de un inhibidor de la absorción de calcio mitocondrial basado en rutenio

DOI:

10.3791/56527

⸱

26 de octubre de 2017

 , 
1Department of Chemistry and Chemical Biology, Cornell University

En este artículo

Resumen

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Se presenta un protocolo para la síntesis, purificación y caracterización de un inhibidor basado en rutenio de la absorción de calcio mitocondrial. Un procedimiento para evaluar su eficacia en células de mamífero permeabilized está demostrado.

Resumen

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Detallamos la síntesis y purificación de un inhibidor de la absorción calcio mitocondrial, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(OH2)]5 +. La síntesis optimizada de este compuesto inicia de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 en 1 M NH4OH en un envase cerrado, produciendo una solución verde. Se logra la purificación con cromatografía de intercambio catiónico. Este compuesto es caracterizado y verificada a ser puros por espectroscopia UV-vis e IR. Las propiedades inhibidoras de absorción calcio mitocondrial se evalúan en las células HeLa permeabilized por espectroscopia de fluorescencia.

Introducción

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El calcio mitocondrial es un regulador clave de una serie de procesos que son críticos para la función normal de la célula, incluyendo la apoptosis y la producción de energía. 1 , 2 , 3 el calcio mitocondrial uniporter (MCU), una proteína del transportador de iones que reside en la membrana mitocondrial interna, regula el flujo de iones calcio en las mitocondrias. 4 , 5 , 6 inhibidores químicos de la MCU son herramientas valiosas para continuar los esfuerzos para estudiar la función y funciones celulares de esta proteína de transporte y de calcio mitocondrial. El compuesto [(HCO2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, es uno de los inhibidores selectivos de la conocida sólo para el MCU con un valor informado ded K de 24 μm.7 ,8,9,10 este complejo es una impureza común en formulaciones comerciales de rojo de rutenio (RuRed), un triruthenium di-μ-oxo puente hexacation de la fórmula [(NH3) 5 RU (μ-O) Ru (NH3)4(μ-O) Ru (NH3)5)]6 +, que también se ha utilizado como un inhibidor de la absorción de calcio. Aunque Ru360 está disponible en el mercado, es muy costoso. Por otra parte, la síntesis y el aislamiento de Ru360 es desafiado por purificación difíciles procedimientos y métodos de caracterización ambigua.

Recientemente hemos reportado procedimientos alternativos para acceder a un Ru360 análogo, [(OH2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5. 11 este compuesto inhibe el MCU con alta afinidad, similar a Ru360. En este protocolo, describimos nuestro más eficaz síntesis de este compuesto, que comienza de [Ru (NH3)5Cl] Cl2. Purificación del producto usando resina de intercambio catiónico fuertemente ácida es detallado, junto con errores comunes de este procedimiento. También presentamos los métodos para la caracterización y evaluación de la pureza compuesto y delinear un enfoque simple para probar su eficacia en el bloqueo de la absorción de calcio mitocondrial.

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Protocolo

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Nota: ácidos concentrados y bases se utilizan en esta síntesis. Utilizar todas las prácticas de seguridad apropiadas cuando se realiza la reacción entre el uso de controles de ingeniería (campana extractora) y equipo de protección personal (EPP) incluyendo gafas de seguridad, guantes, bata, pantalón largo y zapatos cerrados.

1. preparación de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru (μ-O) Ru (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5

  1. síntesis de [Ru (NH 3) 5 Cl] Cl 2 12
    1. disolver 1.00 g de RuCl 3 · n H 2 O (40% Ru por peso, 4,1 mmol) en 5 mL de H 2 O. enfríe la solución marrón oscurezca a 0 ° C en un baño de hielo. Agregar 11 mL (0,23 mol) de solución de hidrato de hidracina de 80% en forma de gota a gota. La reacción inicial será vigorosa con el gas de la evolución, lo que resulta en una solución de color marrón. Deje que la solución resultante a agitar a temperatura ambiente durante 16 h; la solución final será rojo oscuro
      PRECAUCIÓN: La hidracina es agudo tóxico y cancerígeno. Además, las formas anhidras de este reactivo son explosivas. Como siempre, usar campanas apropiadas de PPE y humo al manejar. No concentre estas soluciones sequedad.
    2. a esta solución, agregar aproximadamente 5-10 mL de ácido clorhídrico concentrado para ajustar el pH a 2. En este punto, la solución será amarillo-marrón en color.
    3. De calor esta solución a 105 ° C removiendo durante 1-2 h. Precipita un sólido amarillo de la solución. Cuando no más visiblemente precipitan formas, retirar del fuego.
    4. Permite la mezcla de reacción se enfríen a temperatura ambiente y luego colocar en un baño de hielo de 0 ° C por 10 minutos recoge el amarillo sólido por filtración de vacío y lavado con 5 mL de etanol y éter dietílico.
    5. Disolver totalmente el producto crudo en 15-25 mL de agua caliente. Enfriar 10 mL de una solución concentrada de HCl en un matraz de filtración al colocarlo en un baño de hielo. Filtrar la solución amarilla en la solución de ácido clorhídrico fría para inducir la precipitación de un sólido puro amarillo pálido. Este precipitado de filtro y lavar con 5 mL de HCl 0,5 M, etanol y éter.
    6. Caracterizar el compuesto usando espectroscopía de IR. Verificar la pureza de la identificación de frecuencias de estiramientos de 3226 cm -1, 1604 cm -1, cm 1297 -1 y 801 cm -1. Una impureza menor común en 2069 cm -1 se asigna a [5 N Ru (NH 3) 2] Cl 3.
  2. Síntesis de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (μ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
    1. disolver 100 mg (0.34 mmol) [Ru (NH 3) 5 Cl] CL 2 en 50 mL de 1 M NH 4 OH en un recipiente de presión esférico de fondo redondo de pared gruesa de 200 mL. Libremente tapa el matraz con un tapón y la mezcla de reacción a 75 ° C por 6 h. Retire del calor y agitar a temperatura ambiente durante 4 días producir una solución verde oscurezca.
      ¡PRECAUCIÓN! Resultados de un recipiente sellado en una acumulación de la presión de la calefacción. Asegúrese de utilizar material de vidrio de seguridad de presión apropiado. Para esta reacción, el propósito de sellar el recipiente es minimizar la pérdida de gases NH 3. Por lo tanto, poner el tapón sin apretar para permitir la liberación de exceso de presión.
  3. Purificación por cromatografía de intercambio catiónico
    1. en un vaso de precipitados de 25 mL, suspender g 5-resina de intercambio catiónico (p. ej., Dowex 50WX2 200-400 mallas (forma de H +) en 10 mL de 0.1 M HCl.
    2. De carga esta mezcla en una columna de 10 mL (10 mm de diámetro, 15 cm altura) con un depósito de disolvente 50 mL. Lavar la resina con aproximadamente 20-30 mL de 0.1 M HCl, hasta que el efluente quede descolorido.
    3. Volver a la solución de reacción verde aislada en paso 1.2.1. A esta solución, Añadir ácido clorhídrico concentrado para ajustar el pH a 2, momento en el que el color de la solución cambia a marrón.
    4. De carga esta solución acidificada a la columna de resina de intercambio catiónico preparada en el paso 1.3.2 transfiriendo suavemente encima de la resina. Que el efluente completamente drenar y seguir cargando la solución. Repita este proceso hasta que se ha agregado la solución completa. La parte superior de la resina será marrón oscuro/negro. La resina se reducirá en volumen un poco.
    5. Perlas de vidrio de uso para cubrir la parte superior de la resina. Estos evitará la resina ser molestado cuando se agregan nuevas soluciones.
    6. Eluir la columna con 20 mL de 1 M de HCl.
    7. Eluir la columna con una concentración elevada de ácido clorhídrico de 1,5 M (≈ 50 mL). Una solución amarilla comenzará a salir de la columna. Aumentar la concentración de HCl 2 m y continuar liberador hasta que el efluente quede descolorido o un verde muy pálido-amarillo. Será necesario para este proceso un volumen total de 150-200 mL.
    8. Aumentar la concentración de ácido clorhídrico a 2.5 M (20-50 mL). Recoger el eluido como fracciones en tubos de ensayo. Aumentar a 3 M de HCl. El producto se procederá a la elución de la columna como una solución verde marrón. Una fracción de rojo marrón también puede comenzar a venir de la columna. Ya que estas fracciones son las impurezas oxidadas rutenio rojo, no piscina con las fracciones marrón verde.
  4. Caracterización y verificación de pureza de [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (μ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5
    1. probarlas de las fracciones de Paso 1.3.8. por espectroscopía UV-vis. Para realizar esta tarea, añada 100 μl de una fracción dada en 2 mL de 3 M de NH3 y análisis por espectroscopía UV-vis. Fracciones que contiene el producto puro tendrá una banda de gran absorbancia a 360 nm y una menos intensa absorbancia a 600 nm. Absorbancia a 480 o 533 nm es indicativa de rojo oxidado rutenio e impurezas de rutenio rojo, respectivamente.
    2. Fracciones con puro producto de la piscina y evaporar la solución hasta la sequedad por evaporación rotatoria. El producto estará aislado como un sólido verde marrón. Los rendimientos son típicamente del orden de 5-15 mg (10-20% de rendimiento). Monocristales, convenientes para la difracción de rayos x, pueden obtenerse por la difusión de vapor de etanol en soluciones acuosas de los compuestos.
    3. Para verificar pureza, analizar el compuesto por espectroscopía UV-vis en solución salina con tampón fosfato de pH 7,4 (PBS). Pureza puede evaluarse tomando el cociente de la intensidad de los 360 nm y 600 nm picos. Esta relación es de 31, para un compuesto puro. Compuestos impuros, el cociente será menor.
    4. Análisis de la muestra en el estado sólido por espectroscopia IR. Bandas de diagnóstico están en 3234 cm -1 cm 3151 -1, 1618 cm -1, cm 1313 -1 y 815 cm -1. Se observan bandas de impureza común en 1762 cm -1 y 1400 cm -1, característico de NH 4 cl. rutenio rojo puede ser identificado por bandas en 1404 cm -1, 1300 cm -1, 1037 cm -1 y 800 cm -1.
  5. Evaluación de la inhibición de la absorción de calcio mitocondrial por espectroscopia de fluorescencia
    PRECAUCIÓN! Los siguientes procedimientos utilizan células de mamíferos. Trabajo debe ser llevado a cabo en campanas de flujo laminar adecuadas que están certificadas para la seguridad biológica de nivel 2 (BSL2) investigación.
    ​ Nota: [(OH 2) (NH 3) 4 Ru Ru (μ-O) (NH 3) 4 (OH 2)] Cl 5 hará referencia a como [Ru] en esta sección
    1. hacer tamponado que contiene glucosa solución salina (BGSS) como los medios de ensayo. BGSS es una solución que comprende 110 mM KCl 1 m m KH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido ácido (HEPES), succinato de sodio de 5 mM, 30 μm glicol de etileno-bis(β-aminoethyl ether)-N, N , N ', N '-ácido tetraacético (EGTA). Combine todo, excepto el EGTA, ajustar el pH a 7,4. Añade EGTA y vuelva a ajustar pH a 7.4. Para 50 mL de medio de ensayo añada 0,5 mL de glucosa 1 mg/mL.
    2. Cultura HeLa células en cajas Petri de 2 500 cm en Dulbecco ' s medio de Eagle modificado (DMEM) con 10% suero fetal bovino (FBS) en una incubadora humidificada con 5% CO 2 en 37 ° C. amplificar las células HeLa crecen en una placa de Petri de 100 mm por la siembra ellos en un plato de petri 500 cm 2. El volumen total de los medios de comunicación en el plato grande es de 115 mL. Cada plato grande producirá células de 18 millones aproximadamente, suficiente para dos experimentos de espectroscopia de fluorescencia.
      1. Crecer las células hasta llegar a 90-95% confluency. Retire los medios de comunicación y lavar las células con PBS pH 7,4 de 15 mL. Añadir 15 mL de ácido de 1 mM etilendiaminotetracético (EDTA) en PBS e incubar durante 10 minutos separar las células. Transferir las células a 14 mL fondo Halcón tubos redondos
    3. contar las células con un microscopio invertido trypan azul y un hemocitómetro y calcular el número total de células y el volumen de los medios necesarios para llegar a 7,5 millones de células por volumen de 1.8 mL del medio. Centrifugar las células 10 min a 5310 x g. decantar el sobrenadante y agregar el volumen calculado de BGSS. Resuspender suavemente las células.
      1. Para este ensayo, preparación de soluciones stock de digitonin de 40 mM en dimetil sulfóxido (DMSO), 1 mM de calcio verde-5N en H 2 O y 10 mM CaCl 2 en H 2 O. [Ru] soluciones, preparadas en agua pura, puede variar de 1-3 mM.
        ​ Nota: calcio verde-5N es sensible a la luz. Almacenar en la oscuridad y minimizar la exposición a la luz.
    4. Configurar el Fluorímetro para excitar en 506 nm y leer la emisión en 532 nanómetro con el portacubetas controlado a 37 ° C. preparar una cubeta de acrílico con una barra de agitación o rueda, suspensión de la célula de 1,8 mL de 1.5.2 arriba, solución de digitonin μL 1.8, 3.6 y #181; L calcio verde-5N (solución) y 9 μl [Ru] (para solución stock de 1 mM, concentración final de 5 μm). Incube las células durante 15 min en el Fluorímetro.
      1. Lee los datos como la proporción de excitación/emisión en lugar de la absorción de materia prima. Esta práctica minimiza los errores asociados con las fluctuaciones en la intensidad de la fuente de luz.
      2. Llevar a cabo el primer análisis de la muestra en la ausencia de [Ru] para medir el efecto de la adición de CaCl 2 en la respuesta de las células.
      3. Análisis de comenzar en el Fluorímetro con los ajustes descritos en 1.5.4. Espere aproximadamente 2 minutos para establecer una línea base de emisión estable y luego agregar 1.8 μl de CaCl 2 (concentración final de 10 μm). La intensidad de emisión aumentará inmediatamente a la adición de CaCl 2 y luego se desvanecerán en el transcurso de minutos como los iones de calcio entrar en la mitocondria. Espere hasta que haya terminado el decaimiento (≈ 5 min). Añadir bolos de calcio adicional para determinar la respuesta de la absorción de calcio mitocondrial de las células no tratadas con [Ru].
    5. En otra cubeta que contiene 5 μm [Ru], repite el experimento tal como se describe arriba en 1.5.4.3. En presencia de inhibidor de la intensidad de emisión aumentan, pero no decae. Esta observación significa que bloquea la absorción de calcio mitocondrial.

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Resultados

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Este método describe una síntesis del calcio mitocondrial absorción inhibidor [(OH2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 a partir de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, un material de partida conocido de rutenio. [Ru (NH3)5Cl] CL2 se caracteriza por espectroscopia IR, con modos vibracionales en 3200 cm-1, 1608 cm-1, 1298 cm-1y 798 cm...

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Discusión

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Captación mitocondrial de calcio inhibidor [(OH2) (NH3)4Ru Ru (μ-O) (NH3)4(OH2)] Cl5 puede ser sintetizada de [Ru (NH3)5Cl] Cl2, una conocida rutenio a partir de material, como se describe en este procedimiento. La síntesis de [Ru (NH3)5Cl] Cl2 se logra fácilmente con poca dificultad. Después de revolver RuCl3 por 16 h en la hidracina hidrato, el pH de la solución debe ...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar

Agradecimientos

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Esta investigación fue apoyada por la Universidad de Cornell. Este trabajo hizo uso del centro de Cornell para materiales comparten instalaciones de investigación, que son apoyadas a través del programa NSF MRSEC (Grant DMR-1120296). S.R.N. reconoce apoyo de una beca de investigación postgrado en NSF (Grant DGE - 1650441) y el Dr. Dave Holowka para obtener ayuda con los experimentos de calcio. Cualquier opinión, resultados y conclusiones o recomendaciones expresadas en este material son las de los autores (s) y no reflejan necesariamente las opiniones de la National Science Foundation.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Hidrato de tricloruro de rutenioQuímica a presión3750
Ácido clorhídrico concentradoJ.T. Baker9535
Hidróxido de amonio concentradoMallinckrodt Chemical WorksA669C-2 1
Dowex 50 WX2 200-400 MallaAlfa Aesar13945
Verde Calcio 5NInvitrogenC3737
DigitoninAldrich260746
DMSOAldrich 471267
EGTAAldrichE3889
KClUSB20598
KH2PO4AldrichP3786
MgCl2Fisher ScientificM33-500
HEPESFluka54466
Succinato de sodioAlfa Aesar33386
EDTAJ.T. Baker8993-01
GlucosaAldrichG5000
200 Matraz de fondo redondoChemGlassCG-1506-14
Tapón de vidrioChemGlassCG-3000-05
Columna de vidrio de 10 mm x 15 cm con depósitosPersonalizado - similar a las columnas ChemglassSimilar a CG-1203-20
DMEMCorning10-017-CV
FBSGibco10437028
PBSCorning21-040-CV
Tubos Falcon de fondo redondoFisher Scientific14-959-11B 
500 cm2 placas de PetriCorning431110
Azul tripánHemacitómetro ThermoFisher Scientific15250061
Aldrich Z359629
Cubetas acrílicasVWR 58017-875
Espectrómetro UV-VisAgilent Modelo Cary 8454 
EspectrofluorímetroSLM Modelo 8100C
Espectrómetro IRBruker Hyprion FTIR con accesorio
CentrífugaALC Modelo PM140R
Microscopio de luz invertidaVWR 89404-462
ATR

Referencias

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