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Artículo de método

Un modelo murino de gastrectomía en manga Vertical

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DOI:

10.3791/56534

⸱

18 de diciembre de 2017

 , 
1Department of Biomedical Sciences, Cornell University

En este artículo

Resumen

A continuación describen los resultados de la gastrectomía en manga vertical en ratones. Se trata de un tipo de cirugía de pérdida de peso que consiste en la extracción de aproximadamente el 70% del estómago.

Resumen

Cirugía bariátrica, como la gastrectomía en manga vertical (VSG), es una cirugía del tracto gastrointestinal que se realiza con el propósito de la pérdida de peso. La cirugía bariátrica es actualmente el tratamiento más efectivo a largo plazo para la obesidad. Además de pérdida de peso, cirugía bariátrica produce beneficios adicionales tales como la remisión de la diabetes tipo 2, la remisión de la hipertensión y disminución del riesgo de desarrollar ciertos tipos de cáncer. Los mecanismos más allá de la pérdida de peso de estos beneficios quedan incompletamente definidos. Por lo tanto, los modelos animales de la cirugía bariátrica están siendo desarrollados y validados para identificar los mecanismos que conducen a estos beneficios, con el objetivo de mejorar la comprensión de la fisiología gastrointestinal y la identificación de nuevas dianas terapéuticas. VSG se ha convertido en el procedimiento bariátrico más utilizado en la clínica en los Estados Unidos ya que es altamente eficaz en producir pérdida de peso y mejoría metabólica y es más sencillo de realizar que otros procedimientos bariátricos. Por lo tanto, hemos desarrollado y validado un modelo murino de VSG. Este modelo murino de VSG recapitula muchos de los efectos de la VSG en los seres humanos, incluyendo la regulación de glucosa y presión arterial mejorada. El método se basa en aislamiento del estómago, ligadura de vasos gástricos y la eliminación del 70% del estómago por transecting a lo largo de la curvatura mayor del estómago. Hemos aplicado con éxito este protocolo quirúrgico a diversas líneas de ratón modificado genéticamente para definir los mecanismos contribuyentes a los beneficios de la VSG. Además, este modelo murino de la VSG se ha combinado con otras técnicas quirúrgicas, para lograr la visión mecanicista más profunda. Por lo tanto, este es un modelo sencillo y versátil para el estudio de la fisiología gastrointestinal y los beneficios de la cirugía bariátrica.

Introducción

La epidemia de obesidad continúa creciendo en todo el mundo la cirugía bariátrica ha ganado popularidad como es el tratamiento más efectivo a largo plazo para la obesidad1. Por desgracia, la pérdida de peso por dieta y ejercicio es difícil de conseguir y relativamente ineficaz sobre el largo plazo2,3. Cirugía bariátrica, como la gastrectomía en manga vertical (VSG), se define como la manipulación del tracto gastrointestinal con el fin de1,de pérdida de peso4. Aunque la pérdida de peso es un resultado importante de la cirugía bariátrica, la cirugía bariátrica ofrece otros beneficios para la salud como la mejora de comorbilidades de la obesidad y extender la vida útil5. Por ejemplo, la cirugía bariátrica resulta en altas tasas de remisión de la diabetes tipo 2, hipertensión y reducciones en el riesgo del desarrollo de ciertos tipos de cáncer1,6,7. De la nota, el efecto de la cirugía bariátrica que causa remisión del tipo 2 diabetes y la hipertensión se observa a menudo pronto después de la cirugía y antes de la pérdida de peso8,9. Esto pone de relieve el concepto de que existen mecanismos independientes del peso corporal, contribuyendo a los beneficios de salud observados después de la cirugía. Modelos animales de la cirugía bariátrica se han desarrollado y se utilizan para estudiar los mecanismos por los cuales estos beneficios para la salud ocurren10,11,12.

Hemos validado un modelo de ratón de la VSG, que hemos aplicado a los varios modelos de ratón modificados genéticamente para estudiar los mecanismos por los cuales la cirugía bariátrica mejora comorbilidades de la obesidad como diabetes tipo 2, hipertensión y cáncer colorrectal10 , 11 , 12. roedores modelos permiten control más experimental y la capacidad para realizar la manipulación genética o la farmacia para definir el papel de genes específicos o vías de señalización de interés. Nos enfocamos principalmente en la VSG porque VSG es el procedimiento bariátrico más utilizado en la clínica en los Estados Unidos13. Además, la VSG es un simple modelo quirúrgico con menos modificaciones anatómicas en comparación con otros procedimientos como la desviación del puente o Biliopancreática gástrico Roux-en-Y.

Nuestro modelo de ratón de VSG recapitula los siguientes efectos de la cirugía bariátrica en los seres humanos: pérdida de peso, ingesta reducida de alimentos, regulación de la glucosa mejora, mejoró la función de los islotes pancreáticos, aumenta la secreción post-prandial glucagon-como peptide-1 (GLP-1), reduce la presión arterial y mayor circulación del ácido de bilis concentraciones10,11,12,13,14,15. Por lo tanto, se trata de un modelo ideal para estudiar el cuerpo peso dependientes e independientes mecanismos por los cuales VSG mejora o resuelve comorbilidades de la obesidad. Además, es un modelo fiable que puede combinarse con otros procedimientos quirúrgicos, lo que permite la investigación del impacto de la VSG en diversas condiciones de la enfermedad con mayor visión mecanicista12.

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Protocolo

Todos los protocolos experimentales han sido aprobados por la Comisión de uso y de Cornell Universidad Animal cuidado institucional.

1. pre-quirúrgica preparación

Nota: Estudio los ratones son típicamente en C57BL inducida por la dieta obesidad antecedentes para realizar estudios de forma relevante a la obesidad humana y resistencia a la insulina. Ratones masculinos y femeninos pueden ser estudiados como se describe en los pasos posteriores.

  1. En una edad de 2 meses, poner ratones en una dieta alta en grasas 45% o 60% por 2 meses (véase Tabla de materiales).
    Nota: Los ratones son alimentados una dieta alta en grasas para crear un fenotipo de obesidad y resistencia a la insulina. Períodos más cortos o más largos de la alimentación con dieta alta en grasas pueden usarse dependiendo de los objetivos del estudio.
  2. Continuar alimentar ratones ad libitum hasta la cirugía. Si se requieren mediciones iniciales, después de 7 semanas de alto grado en grasas de la dieta de alimentación, ayunar a ratones durante 6 h o toda la noche y tomar una muestra de sangre de referencia para la medición de metabolitos de interés (por ejemplo, glucosa).
  3. Continuar ratones en alto grado en grasas de la dieta y permiten a ratones una semana para recuperarse después de muestras de sangre antes de la cirugía ficticia o VSG. Lugar de ratones en un líquido (véase Tabla de materiales) de la dieta durante 4 días antes de la cirugía.
    Nota: Ratones se mantienen en una dieta de líquidos antes y después de la cirugía para limpiar el tracto digestivo de partículas que pueden afectar la respuesta curativa.
  4. Esterilizar los siguientes elementos antes de la cirugía: papel de aluminio, gasa, algodón con punta aplicadores (CTA) y los instrumentos quirúrgicos (pinza, tijera, tijera de iris, pinza de dumont, de funcionamiento dentada pinza Brown-Adson, aguja de la sonda, controlador de microneedle, tijera primavera ).

2 procedimientos de farsa y gastrectomía en manga vertical

  1. En el día de la cirugía pesar ratones para obtener una medida de peso de la línea de base.
  2. Equipar la sala quirúrgica con un cojín de calefacción, sistema de anestesia y baño de agua caliente. Ajuste el baño de agua a 37 ° C y usar caliente solución salina 0,9% para irrigación. Limpio el campo quirúrgico con etanol al 70% y utilizar técnica estéril para abrir herramientas y paquete esterilizado de cirugía.
    Nota: La almohadilla de la calefacción se utiliza para mantener el animal caliente durante la cirugía y la recuperación de la anestesia.
  3. Utilizando una cámara de inducción, anestesiar el ratón con isoflurano 5% y tasa de flujo de2 O de 1 L/min., confirme que el ratón está en el plano adecuado de anestesia realizando una pizca del dedo del pie. Mantener el ratón con isoflurano 1-3% y una tasa de flujo de O2 de 0,6 L/min una vez que se ha logrado un plano consistente de la anestesia.
  4. Una vez que el ratón está anestesiado, colocar ungüento oftálmico (véase tabla de materiales) en los ojos para mantenerlos húmedos durante la cirugía. En este momento también administrar un analgésico, como el meloxicam (2 mg/kg por vía subcutánea). Recorte el pelo del ombligo a la axila manteniendo suavemente la piel para proporcionar tensión.
    1. Como la piel del ratón es fino y delicado, tenga cuidado de no causar lesiones de piel cuando recorte el pelo. Limpiar la piel con povidona yodada y alcohol.
    2. Ponerse guantes estériles y preparar el campo quirúrgico estéril e instrumentos. Realizar el resto del procedimiento utilizando una técnica estéril. Preparar el campo quirúrgico estéril colocando cortinas quirúrgicas estériles en ambos lados del ratón. Utilice papel aluminio esterilizado para crear un paño quirúrgico para el ratón.
    3. Corte un pequeño agujero en la hoja de lata para permitir el acceso al abdomen del ratón.
  5. Hacer una incisión de la piel de la parte central del abdomen (ombligo) hasta el nivel del cartílago de xiphoid utilizando una tijera de iris. Identificar la linea iris alba y uso de las tijeras para cortar a través de la pared del cuerpo a lo largo de la linea alba. Utilice CTA para elevar suavemente el estómago en el abdomen y luego diseccionar sin rodeos el epiplón mayor de la curvatura mayor del estómago.
  6. Ligar la arteria gástrica corto que discurre entre el fundus del estómago y el bazo colocando dos ligaduras con sutura absorbible de monofilamento de 7-0. Utilice tijeras de primavera para cortar entre las dos ligaduras. Una vez que la arteria es transversalmente, exteriorizar completamente el estómago de la cavidad abdominal. Coloque la gasa en el estómago y mojado con una solución salina para mantener el tejido húmedo.
  7. Procedimiento simulado
    1. Para el procedimiento simulado, coloque un patrón continuo simple suelto de la sutura con sutura absorbible de monofilamento 6-0 con una aguja cónica. Comienzan 2 mm a la derecha (a la derecha del cirujano) del esófago. Coloque la línea de sutura a lo largo de la pared gástrica ventral y luego continuar a lo largo de la pared gástrica dorsal.
      Nota: Para todas las manipulaciones gástricas, use solamente la sutura absorbible monofilamento para disminuir el riesgo de infección. Además, usar sólo la sutura con una aguja cónica para todas las manipulaciones gástricas, como el uso de una aguja de corte aumenta el riesgo de sutura "tirar-por" conduce al daño de tejido gástrico y dehiscencia de la herida.
    2. Pase la aguja completamente a través de una pared gástrica colocando la sutura. Asegúrese de que la sutura es acostado, pero no restringe el estómago. Suavemente atar la sutura de uso 3-4 tiros y vaya al paso 2.9.
    3. Para el procedimiento VSG omitir paso 2.7 y continúe con el paso de 2.8.
  8. Procedimiento VSG
    1. Para el procedimiento de la VSG, ligar las ramas prominentes de la gástrica de la arteria y la vena con 7-0 Sutura absorbible monofilamento con aguja ahusada con 3 tiros para cada nudo. Colocar las ligaduras justo debajo (es decir, hacia la curvatura menor del estómago) la línea pretendida de transección.
      Nota: La línea pretendida de transección comienza a ~ 2 mm anterior (es decir hacia la curvatura mayor del estómago) la muesca cardiaca del estómago y por lo menos 2 mm por debajo de la pilcatus de margo y se extiende hasta el extremo proximal del lóbulo derecho del páncreas. Por lo general, hay 4 recipientes por la pared gástrica que se unen; sin embargo, esto puede variar entre ratones.
    2. Para evitar derrames del contenido gástrico durante la gastrectomía, colocar una simple línea continua de sutura pasa a través de ambas paredes gástricas justo debajo de la línea pretendida de transección usando Sutura absorbible de monofilamento 6-0 con una aguja cónica. Comenzar la línea de sutura a la derecha del cirujano, del esófago y por debajo de la pilcatus de margo y al final justo por encima del páncreas.
    3. Colocar pinzas hemostáticas con punta fina por encima de la línea de sutura y utilice tijeras de primavera para cortar entre la línea de sutura y pinzas hemostáticas. Retire el tejido gástrico seccionado el campo quirúrgico estéril.
Utilice CTA para limpiar sangre y contenido de estómago.
  • Reforzar la aposición de las paredes gástricas con sutura absorbible de monofilamento 6-0 con una aguja cónica con un simple patrón discontinuo.
    Nota: Un patrón de sutura discontinua simple se recomienda ya que esto proporciona un cierre más seguro que el patrón de sutura continua simple.
  • Eliminar el remanente gástrico con solución salina durante todo el procedimiento para mantener el tejido húmedo y limpio. Utilice una aguja de 20G por sonda nasogástrica conectada a una jeringa de 20 mL para realizar lavado gástrico con solución salina. Utilizar este tamaño para asegurar una presión adecuada se proporciona sin arriesgar daño tisular gástrica debido a una presión excesiva o daño accidental de tejido gástrico por el uso de una aguja punta normal.
  • Utilizar un mínimo de 20 nudos para cerrar bien el estómago; prestar atención al cierre a lo largo del esófago, como este lado es más difícil acceder y por lo tanto es a menudo un sitio de la dehiscencia.
  • Asegurarse que no hay fugas presionando suavemente sobre el estómago con CTAs. Si se identifican fugas, colocar nudos discontinuas simple adicionales en las áreas de fugas y fugas luego prueba otra vez. Prueba de fugas hasta que no se detecta ninguna fuga.
  • Hacer un lavado minucioso final del estómago con al menos 60 mL de solución salina para asegurar que no hay partículas infecciosas ha quedado atrás.
  • Coloque el estómago en la cavidad abdominal en el hígado mediante una CTA. Coloque la CTA a lo largo de la cara dorsal de la cavidad abdominal para absorber todo el líquido sobrante. Usando una aguja 18G embotada, inyectar solución de Ringer entibiada (LRS) con o sin antibióticos (0,5 mL LRS +/-20 mg/kg de enrofloxacina) directamente en la cavidad abdominal, justo antes de que cierre.
    Nota: Esto reemplaza experimentados durante la cirugía la pérdida de líquidos y proporciona un método para la aplicación directa de los antibióticos al sitio quirúrgico ayudar con la recuperación.
  • Cerrar la capa de músculo abdominal con una aguja cónica en forma discontinua simple con sutura absorbible de monofilamento 6-0. Cerrar la capa de la piel con sutura absorbible de monofilamento 6-0 en un patrón continuo simple.
  • Coloque el adhesivo tisular en la piel y doblar la piel sobre la línea de sutura a enterrar la sutura para que el ratón no puede interrumpir el cierre de la herida postoperatoriamente.
  • Apague el isoflurano y deje el ratón recuperar en el cojín de calentamiento de 10-15 minbefore regresar a su jaula casera. No descuide el animal hasta que recuperó la conciencia y es capaz de moverse.
  • Mantener animales alojados individualmente hasta que se recuperó completamente de la cirugía.
    Nota: Si precisa alimentos toma medidas son obtenidos a lo largo del estudio, ratones sigan alojados individualmente a lo largo del estudio. Existe un riesgo de obstrucción de cuerpo extraño de comer cama jaula casera. Animales deben ser ubicados en jaulas sin ropa de cama excepto material para proporcionar enriquecimiento de anidación (véase Tabla de materiales).

    • 3. medidas y cuidados ratón postoperatorio

    1. Retomar el ratón de su jaula casera y poner la jaula en una almohadilla de calefacción. Mantener los ratones en una dieta líquida durante al menos 7 días después de la cirugía. Administrar un analgésico, como el meloxicam (2 mg/kg por vía subcutánea), durante 2 días después de la cirugía.
      Nota: Puede administrarse un antibiótico, como la enrofloxacina (20 mg/kg), hasta 7 días después de la cirugía. Los antibióticos se dan para minimizar el riesgo de infección de la intervención quirúrgica y pueden o pueden no ser necesarios dependiendo del nivel de esterilidad que se mantuvo durante todo el procedimiento. Sin embargo, si se utilizan antibióticos, se debe administrar a todos los ratones en el mismo estudio para mantener la coherencia.
    2. Durante el período postoperatorio evaluar el peso corporal, alimentación, defecación, nivel de actividad y disposición al menos diariamente para asegurar la correcta cicatrización y recuperación. Realizar seguimiento postoperatorio durante 14 días después de la cirugía.
      Nota: Fracaso quirúrgico es considerado típicamente inmediatamente después de la cirugía o dentro de tres días posterior al operativo. Animales que no están comiendo o bebiendo en el segundo día después de la cirugía deben vigilarse de cerca para complicaciones quirúrgicas.
    3. Después de completar con éxito el período postoperatorio, medida cuerpo peso e ingesta de alimentos con regularidad a lo largo de estudio para garantizar el mantenimiento del fenotipo correspondiente.
    4. Realizar una prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT) para evaluar la tolerancia a la glucosa, la secreción de insulina estimulada por glucosa y la secreción de hormonas de la tripa.
      1. Realizar la OGTT en ratones después de un ayuno por 6 h y, a continuación, ratones de la sonda con solución dextrosa al 50% en una dosis de 1 g/kg.
      2. Recoger muestras de sangre de la cola en 0, 2.5, 5, 15, 30, 60 y 120 minutos después de la sonda. Medir la glucemia con un glucómetro en estos momentos. Recoger las muestras de suero en cada momento para la medición de varias hormonas, como insulina y GLP-1.
      3. Ratones rápidos para 6 h antes de la eutanasia. Realizar una medición de muestra y de la glucosa de sangre final. Comparar la medición de glucosa final a la medida de línea de base. Eutanasia a ratones con una inyección intraperitoneal de pentobarbital en dosis de 200 mg/kg.
      4. Utilice la línea de base y las muestras de suero final para medir analitos adicionales y comparar valores quirúrgicos previos y posoperatorios.

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    Resultados

    El impostor y los procedimientos VSG son representados en la figura 1. Figura 1A se muestra en la línea de sutura se coloca a lo largo de las paredes gástricas durante el procedimiento simulado. Esta misma zona es donde se corta el estómago durante la cirugía de la VSG. Figura 1B muestra el remanente tubular del estómago izquierda después de la realización de la VSG.

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    Discusión

    La cirugía bariátrica es el tratamiento más efectivo a largo plazo para la obesidad y resulta en beneficios para la salud tales como altas tasas de tipo 2 diabetes y la hipertensión remisión1,9,15. Modelos murinos de la cirugía bariátrica proporcionan una potente herramienta con la que identificar los mecanismos por los cuales la cirugía bariátrica causa mejoras rápidas y pronunciadas en comorbilidades de la obesidad. Además, mo...

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    Divulgaciones

    Los autores no declaran conflictos de interés, salvo el Dr. Cummings recibió fondos de Eli Lilly and Company.

    Agradecimientos

    Esta investigación fue apoyada por NIH/NCI R21CA195002-01A1, Consejo del Presidente de mujeres de Cornell y la beca postgrado de diversidad de SUNY. Laboratorio de Dr. Cummings recibida también financiación durante el período del proyecto de la Cornell comparativo cáncer biología programa de capacitación y Eli Lilly and Company.

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    Materiales

    Lista de materiales utilizados en este artículo
    NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
    45% dieta alta en grasasDietas de investigaciónD12451
    60% dieta alta en grasasDietas de investigaciónD12492
    BoostNestlé160-67538rico sabor a chocolate
    6-0 SuturaEthiconZ432monofilamento absorbible/cónico
    7-0 SuturaCovidien8866127-01monofilamento absorbible/cónico
    Bastoncillos de algodónFisherbrand23-400-118pequeños
    Bastoncillos de algodónFisherbrand233-400-101gasa grande
    Varios4x4 4 capas y 2x2 4 capas
    Papel de aluminioVarios
    paños de cirugíaVarios
    Solución salina al 0,9%Varios
    LRSHospira170RX
    BetadineVarios
    AlcoholVarios
    Pomada OcularParalube® Pomada Veterinaria17033-211-38
    Adhesivo para tejidosVetbond1469SB
    Meloxicam (Metacam)Boehringer Ingelheim141-2135 mg/ml
    EnrofloxacinaBaytril08713254-18659922,7 mg/ml
    Hemostáticos de punta finaFine Science Tools13021-12
    Tijera MetzenbaumFine Science Tools14018-18
    Tijeras de irisHerramientas de ciencia fina14058-09
    Pinza DumontHerramientas de ciencia fina11251-20
    Pinza dentadaHerramientas de ciencia fina11020-12
    Aguja de sonda nasogástricaHerramientas de ciencia fina18060-20
    Controlador de microagujasHerramientas de ciencia fina12075-14
    Tijera de resorteFine Science Tools15396-00
    Jeringa de insulinaVarios
    Jeringa de 1 mlVarios
    Jeringa de 20 mlVarios
    Glucómetro (un toque ultra mini)Lifescan70021208
    Multiplex Insulina y GLP-1 Descubrimiento aescala mesométricaK15171C-1
    GraphPad Prisma 6.00GraphPad Software
    NestletsAncare NES3600

    Referencias

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