Nos ilustran un método directo para derivar macrófagos murinos primarios de células de médula ósea y conjuga un método sencillo para preparar ácidos grasos BSA. Entonces demostramos que ácidos grasos saturados puede inducir la muerte celular de macrófago, y tal muerte celular está positivamente asociada con la acumulación celular de los niveles de ceramida.
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Artículo de método
Ácidos grasos saturados inducir muerte celular de macrófago asociado de ceramida
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Resumen
Resumen
Los macrófagos expresan muy epidérmica proteína de unión a ácidos grasos y la proteína de unión a ácidos grasos adiposa. Se activa la absorción saturada y ácidos grasos insaturados, que podría desempeñar un papel crítico en la regulación de sus funciones inmunes. Numerosos estudios han demostrado que diversos ácidos grasos, saturados o insaturados, poseen diferentes efectos sobre el crecimiento celular y la función. Sin embargo, varían los enfoques utilizados para la preparación de ácido graso que puede conducir a resultados no fisiológicos. Albúmina sérica, un portador natural de ácidos grasos en sangre periférica de mamífero, se recomienda para la formación de un conjugado complejo con la sal de sodio de los ácidos grasos para estudiar la función del ácido graso en células de mamífero, minimizando la toxicidad del jabón de ácido graso. Así, una sencilla, relativamente rápida de la calefacción y sonicando método es desarrollada y presentada aquí para la formación del conjugado ácida grasos BSA. Se describe un protocolo de uso de ácidos grasos saturados, especialmente el esteárico ácidos para inducir muerte celular severa en macrófagos derivado de médula ósea de ratón. Demostramos más que la muerte celular inducida por ácidos grasos saturados está positivamente asociada con los niveles de ceramida celulares acumulados. Este método se puede extender para los estudios del impacto de los ácidos grasos en las células de otros mamíferos.
Introducción
Los ácidos grasos juegan un papel crítico en el metabolismo energético y en la síntesis de fosfolípidos de membrana en diferentes tipos de células. Los ácidos grasos tienen una solubilidad acuosa baja. Preparación apropiada de ácidos grasos es de vital importancia para el estudio de las funciones biológicas de los ácidos grasos en las células mamíferas. Cuando los ácidos grasos se preparan con etanol, muchos ácidos grasos pueden mostrar su efecto tóxico jabón (detergente) en la membrana celular, incluso en concentraciones relativamente bajas de1. Como un natural, importante transportador de ácidos grasos libres en el suero, la albúmina sérica se considera un buen portador para ácido graso entrega en vitro para ácidos grasos función ensayos2,3,4. Sin embargo, los detalles de la preparación de ácidos grasos y albúmina de suero conjugado generalmente no están disponibles aunque se han publicado numerosos trabajos de investigación utilizando ácidos grasos.
Los macrófagos expresan muy epidérmica proteína de unión a ácidos grasos y adiposo proteína de unión a ácidos grasos5,6,de7,8. Se activa la absorción saturada y ácidos grasos insaturados que puede regular sus funciones inmunitarias. Para estudiar el impacto de los ácidos grasos en los macrófagos y otras células, diferentes métodos de preparación de ácidos grasos fueron aplicados1,7,9. Utilizando apropiadamente preparado, suero, ácidos grasos conjugados de albúmina para investigar el impacto de los ácidos grasos sobre la función de macrófagos es de vital importancia en la obtención de datos biológicamente significativos. Estudios sobre el impacto de los ácidos grasos sobre la función del macrófago pueden proporcionar conocimientos básicos y potenciales dianas terapéuticas relacionadas con el metabolismo de ácidos grasos en enfermedades implicadas macrófagos.
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Protocolo
el protocolo fue aprobado por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Louisville.
1. macrófagos de derivados de la médula ósea de ratón (BMDMs)
- Euthanize un ratón de tipo salvaje de 6 a 8 semanas de edad, sano con CO 2. Perno hasta un tablero de la espuma y spray con etanol al 70% hasta que se haya empapado. Quitar los huesos tibia/fémur con pinzas y tijeras. Ponerlos en una placa Petri con 5 mL 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS). Realizar todos los procedimientos bajo condiciones estériles.
- Corte ambos extremos del hueso fémur tibia con una tijera en una campana de cultivo estériles para tejidos. Al ras del hueso con una aguja de 25 G con PBS + 2% de suero bovino fetal (FBS) en un tubo de 15 mL.
- Centrifugar las células de médula ósea a 500 x g, 4 ° C por 5 min
- Resuspender el precipitado de células en tampón de lisis de glóbulos rojos de 1 mL a lyse células de sangre rojas (RBC) de menos de 1min diluir inmediatamente con 9 mL 1 x PBS. Centrifugar nuevamente como en el paso 1.3. Decantar el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado de células en 10 mL 1 x PBS, filtrar la suspensión de células a través de una malla de nylon estéril 40 μm en otro tubo de 15 mL para eliminar células residuos/grupos. Centrifugar nuevamente como en 1.3. Decantar el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado de células en el Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 con el 5% medio FBS de 15 mL y 10 μg/mL gentamicina, placa que las células en una placa de cultivo de tejido de 100 mm a 37 o C incubadora para 60 minutos agitar suavemente el plato, sacan el flotante las células y contarlas.
- Placa de 6 x 10 6 células en un plato de 100 mm con macrófagos 12 mL diferenciar los medios de comunicación (RPMI 1640 con 5% FBS y gentamicina 10 μg/mL, mezclado con 30% elución de L929 acondicionado media 10) con macrófagos de ratón recombinante de 10 ng/mL factor estimulante de colonias (M-CSF) durante 2 días.
- Después de cultivo durante 2 días en una incubadora de 37 ° C con 5% CO 2, alimentación cada plato con macrófagos fresco 6 mL diferenciar los medios de comunicación con el M-CSF de 10 ng/mL.
- El día 5, 8 mL de los viejos medios a sin molestar a las células y añadir macrófago fresco 10 mL diferenciar los medios de comunicación con el M-CSF de 10 ng/mL.
- En el día 7, de la cosecha los macrófagos derivados de médula ósea (BMDMs) usando un levantador celular.
Nota: Adjunto los macrófagos también pueden ser disociados con 5 mL de 1 mM de EDTA en PBS 1 x durante 5 a 10 minutos después de quitar las células de flotación y lavado de la placa dos veces con 5 mL 1 x PBS. Centrifugar las células como en el paso 1.3. resuspender en macrófago fresco diferenciar los medios de comunicación y contar con un hemocitómetro.- Confirmar las BMDMs ' fenotipo mediante citometría de flujo como describe en 5. Preparar el ratón derivado macrófagos en cierta concentración para los estudios siguientes.
2. BSA-grasos ácido conjugado preparación
- Prepare 2 mM BSA en PBS estéril. Por ejemplo, pesar 6,65 g BSA, Añadir 30 mL 1 x PBS para disolver, luego agregar más PBS hasta 50 mL, escalamiento componentes para hacer 2 mM BSA en PBS 1 x.
- Prepare 5 mM individuales sodio sal de ácidos grasos en 2 mM BSA. Calentar a 37 ° C o superior, si es necesario y someter a ultrasonidos la mezcla de 2 mM BSA y sal de sodio de los ácidos grasos hasta obtener una solución clara.
Nota: En comparación con ácidos grasos insaturados, ácidos grasos saturados necesitan una temperatura más alta y más tiempo de sonicación para la disolución de. - Filtro de la solución de grasos ácido de BSA a través de un 0.22 μm filtro, alícuota en microcentrífuga estéril 1.5 mL los tubos y almacenarlos a 4 ° C para uso a corto plazo o a-20 ° C para almacenamiento a largo plazo. Ninguna precipitación debe observarse después de almacenamiento a 4 ° C en el refrigerador.
3. Saturado ácidos grasos inducen celular muerte de ratón médula ósea macrófagos derivados de
- placa BMDMs en una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos con 0.4 x 10 6/ml en macrófago diferenciar los medios de comunicación.
- Tratar las células con los 0.4m m de ácido palmítico y ácido esteárico por 16 a 24 h a una incubadora de 37 ° C con 5% CO 2. Utilizar BSA como control negativo.
- Las células con un levantador de células después del tratamiento de la cosecha y desactivación de las células a 500 x g, 4 ° C por 5 min.
- Mancha las células con anexina V-Alexa 488 y aminoactinomycin 7 D (7-AAD) en 100 μL de anexina tampón de Unión V durante 15 min a temperatura ambiente.
- Diluir la muestra con 200 μL de tampón de Unión anexina, mezclar suavemente, y luego guardar las muestras en hielo después de la incubación.
- Analizar las células tan pronto como sea posible por citometría de flujo 5. Annexin V-Alexa 488 se detecta en canal FITC y 7-AAD es en canal PerCP/PerCP-Cy5.5.
4. Tinción intracelular de ceramida
- después del tratamiento de ácido graso, cosechar las células como en el paso 3.3. Luego fijar las células en paraformaldehído al 4% durante 30 minutos
- Lavar la muestra con 1 mL 1 x PBS, girar hacia abajo como en el 3.3 y decantar el sobrenadante.
- Teñir las células con el anticuerpo primario anti-ceramida (dilución 1: 200) en buffer de permeabilización de 1 x μL 100 durante 30 minutos
- Lavado y exprimido por las células otra vez como en el paso 4.2.
- Teñir las células con el anticuerpo secundario de anti-ratón IgM (dilución 1: 500) en buffer de permeabilización de 1 x μL 100 durante 30 minutos
- Lavado y centrifugado hacia las células otra vez como en el paso 4.2. Añadir 250 μL 1 x PBS y analizar las células mediante citometría de flujo 5.
Nota: Vea la lista detallada de reactivos en la tabla de equipos y reactivos.
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Resultados
La obesidad aumenta las concentraciones de ácidos grasos libres en suero. Como fagocitos profesionales, macrófagos activamente toman ácidos grasos para mantener la homeostasis de host. Durante estos procesos, sobrecarga de lípidos pueden inducir muerte celular de macrófago. Para ello, cultiva BMDMs en vitro con obesos niveles de ácidos grasos dietéticos y muerte de las células macrófagos medido utilizando tinción de citometría de flujo. En comparación con el control de la BSA, ác...
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Discusión
La preparación adecuada de solución de ácido graso es de vital importancia para el estudio de la función biológica de los ácidos grasos. La neutralización de los ácidos grasos aumenta su solubilidad en la solución acuosa. Sin embargo, sales de sodio de ácidos grasos, especialmente los ácidos grasos saturados, son todavía de baja solubilidad en agua o PBS como observado. Un método es utilizar el etanol del 95-100% para ayudar a disolver ácidos grasos1. Usando este método, mayor toxicidad para las c...
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Divulgaciones
Los autores declaran no hay conflictos de intereses financieros.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado parcialmente por los fondos de puesta en marcha de la Universidad de Louisville y el Instituto Nacional del cáncer (Bethesda, MD) concede a R01CA177679, R01CA180986.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Baño ultrasónico CPX | Bransonic | Modelo 2800 | |
| Palmitato de sodio (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Estearato de sodio (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Albúmina sérica bovina (BSA), libre de ácidos grasos | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Factor estimulante de colonias de macrófagos de ratón (mM-CSF) | Tecnología de señalización celular, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Anexina V, Alexa Fluor 488 conjugado | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Anticuerpo monoclonal anti-ceramida (IgM de ratón) | Sigma | C8104-50TST | Clon: MID 15B4 |
| Anticuerpo IgM anti-ratón de cabra, y micro; cadena, FITC conjugado | Sigma | AP128F | |
| Tampón de fijación | Biolegend | 420801 | |
| Tampón de permeabilización | Ebioscience | 4307693 | |
| Tampón de lisis de glóbulos rojos | Sigma | ||
| 556454 | Biosciences | ||
| L929 ATCC | CCL-1 | ||
| Corning Elevador de células | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Nota: M.W. es para peso molecular. |
Referencias
- Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774). Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).
- Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis. J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).
- Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity. Shock. , (2017).
- Vusse, G. J. Albumin as fatty acid transporter. Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).
- Zhang, Y., et al. Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production. J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).
- Zhang, Y., et al. Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet. Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).
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- Zhang, Y., et al. Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages. Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).
- Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells. J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. , (2008).
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Reimpresiones y permisos
