Describimos un procedimiento histoquímico que revela características zinc laminar y areal manchas patrones en regiones diferentes del cerebro. El patrón de coloración de zinc puede utilizarse en conjunto con otros marcadores anatómicos distinguir confiablemente las capas y regiones en el cerebro en desarrollo y adultos.
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Artículo de método
Uso de Zinc sináptica histoquímica para revelar las diferentes regiones y láminas en el cerebro en desarrollo y adulto
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Resumen
Resumen
Caracterización de la organización anatómica y funcional del cerebro y desarrollo requiere la identificación precisa de circuitos neuronales distintos y regiones en el cerebro inmaduro y adulto. Aquí describimos un procedimiento de tinción histoquímica de cinc que revela las diferencias en los patrones de tinción entre los diferentes estratos y regiones del cerebro. Otros han utilizado este procedimiento no sólo para revelar la distribución de las neuronas que contienen cinc y circuitos en el cerebro, sino también para delinear correctamente límites areal y laminares en el cerebro en desarrollo y adultos en varias especies. Aquí ilustramos esto procedimiento con imágenes del desarrollo de la coloración y los cerebros de adultos ferret. Revelan un patrón de coloración de zinc que sirve como un marcador anatómico de las zonas y capas y puede usarse confiablemente para distinguir áreas visuales corticales en la corteza visual en desarrollo y adultos. El objetivo principal de este protocolo es presentar un método histoquímico que permite la identificación exacta de las capas y regiones en el cerebro en desarrollo y adultos donde otros métodos no lo hacen. En segundo lugar, en combinación con el análisis densitométrico de la imagen, este método permite evaluar la distribución de zinc sináptica para revelar posibles cambios a lo largo de desarrollo. Este protocolo describe en detalle los reactivos, herramientas y pasos necesarios para teñir sucesivamente secciones del cerebro congelado. Aunque este protocolo es descrito usando tejido de cerebro de ferret, fácilmente puede ser adaptado para su uso en roedores, gatos o monos, así como en otras regiones del cerebro.
Introducción
Manchas histológicas se han utilizado tradicionalmente para ayudar en la identificación de áreas corticales en varias especies por revelar las diferencias en características arquitectónicas. El uso combinado de técnicas histoquímicas como gránulos de Nissl, citocromo oxidasa (CO) reactividad o mielina puede resultar fructífero como revelan límites áreas similares en el cerebro adulto. Sin embargo, estas manchas histoquímicas no revelan siempre adecuadamente límites claros entre áreas corticales y las capas del cerebro inmaduro.
En el sistema nervioso central, zinc tiene varias funciones esenciales que incluyen estabilización de la estructur....
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Protocolo
el siguiente protocolo sigue las pautas de cuidado de los animales establecidas por el cuidado Animal institucional y Comité uso (IACUC) en la Universidad de Nueva York, que se ajustan a todos los estado adecuado y las pautas federales. Anestesia es apropiada para hurones y debe modificarse según la especie estudiada.
figura 1: esquematización de los pasos más importantes en las 3 fases de este protocolo de diagrama de flujo y el tiempo requerido para completar cada paso.
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Resultados
Los pasos principales implicados en este protocolo de tinción de secciones del cerebro para zinc sináptica se presentan en un diagrama de flujo en la figura 1. El protocolo puede dividirse en tres fases: 1) perfusión y colección de tejido, preparación de tejido 2) coloración e histoquímica 3) Zinc. Brevemente, durante la primera fase del Protocolo, el animal está anestesiado e inyectado IP con la dosis apropiada de selenito de sodio. Después de un período de .......
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Discusión
El presente estudio emplea una técnica histoquímica basada en una versión modificada de la Danscher (1982) método10, por el que localización sináptica cinc puede ser detectado y visualizado en el cerebro. Esencialmente, este método funciona mediante la inyección el animal con el selenito de sodio quelante cinc (Na2SeO3) (15 mg/kg). Después de la inyección, la selenita viaja al cerebro y se une al zinc libre que se localiza en las vesículas presinápticas de zinc que contienen .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del centro nacional para recursos de investigación (2G12RR03060-26A1); El Instituto Nacional de salud de minorías y disparidades en la salud (8G12MD007603-27) de los institutos nacionales de salud; Profesional personal Universidad de Congreso-ciudad de Nueva York (PSC-CUNY); y Facultad investigación Grant (RFA II) de la Universidad Americana de Sharjah. Agradecemos a Vidyasagar Sriramoju para introducirnos a estos métodos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Euthasol (solución de eutanasia) | Henry Schein | 710101 | |
| Selenito de sodio | Sigma-Aldrich | 214485 | |
| Ketamina (Ketaved) | Henry Schein | 48858 | 100 mg/ml inyectables |
| Xilacina (Anased) | Henry Schein | 33198 | 100 mg/ml inyectables |
| Paraformaldehído | Sigma-Aldrich | F8775 | Diluido hasta 4% |
| Goma arábiga | Sigma-Aldrich | G9752-500G | |
| Ácido cítrico | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Citrato de sodio | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Hidroquinona | Sigma-Aldrich | H9003 | |
| Lactato de plata | Sigma-Aldrich | 85210 | |
| Gelatina de pescado | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Citocromo c | Sigma-Aldrich | C2506 | (Tipo III, de corazón equino) |
| Catalse | Sigma-Aldrich | C10 | |
| Sacarosa | Domino | ||
| Xileno | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| 100% Etanol | Fisher Scientific | A406-20 | Se utiliza para la deshidratación antes del montaje de la corredera |
| Coverslips | Brain Research Laboratories | #3660-1 | |
| Portaobjetos esmerilados sin subcamas | Brain Research Laboratories | #3875-FR | |
| Microtomo | American Optical Company | 860 | |
| Microscope | Olympus | BX-60 | |
| Adope Photoshop | Adobe Systems, San José, CA | Para ensamblar imágenes | |
| el | software ImageJ Free se puede descargar en http://rsb.info.nih.gov/ij/ | Para mediciones densométricas | |
| Bandeja de plástico | Se puede utilizar | para sumergir los portaobjetos en la solución de revelador | |
| Placa calefactora | puede utilizar |
Referencias
- Nakashima, A., Dyck, R. H. Zinc and cortical plasticity. Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).
- Frederickson, C. J. Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons. Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).
- Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M.
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