Method Article

In Vitro Medición de la enzima a prueba chaperonas farmacológicas respuesta de Fabry y la enfermedad de Pompe

DOI:

10.3791/56550

⸱

December 20th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Albrecht-Kossel-Institute, University Rostock Medical Center, 2Department of Biology, University Federico II, 3Centogene AG

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Existe una demanda para hacer clínico pruebas de una nueva clase de fármacos "huérfanos" llamadas chaperonas farmacológicas reproducible, rápida y eficiente. Desarrollamos un análisis basado en la cultura de célula simple, altamente estandarizados y versátil a pantalla para pacientes elegibles así como chaperonas farmacológicas novela drogas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El uso de la medicina personalizada para tratar enfermedades monogénicas raras como trastornos de depósito lisosomal (LSDs) es desafiado por diseños de ensayos clínicos, altos costos y bajo número de pacientes. Cientos de alelos del mutante están implicados en la mayoría de los LSDs. Las enfermedades se clasifican típicamente en 2 a 3 diferentes tipos clínicos según la gravedad. Por otra parte, la caracterización molecular del genotipo puede ayudar a predecir los resultados clínicos e informar a la atención de los pacientes. Por lo tanto, hemos desarrollado un ensayo de cultivo de célula simple basado en HEK293H las células con heterologously sobreexpresión las mutaciones identificadas en la enfermedad de Fabry y Pompe. Un análisis similar se ha introducido recientemente como prueba preclínica para identificar mutaciones susceptibles de terapia farmacológica de acompañante (PCT) en la enfermedad de Fabry. Este manuscrito describe un ensayo de cultivo de células modificadas que permiten una rápida evaluación fenotípica de variantes alélicas en la enfermedad de Fabry y Pompe a identificar a los pacientes elegibles para el PCT y puede ayudar en el desarrollo de nuevos pharmacochaperones.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hay más de una docena trastornos de lysosomal del almacenaje (LSDs) relacionados con la disfunción glucosidasa como resultado de mutaciones en el gen primario. Fabry (OMIM #301500) y la enfermedad de Pompe (OMIM #232300), más de 500 y 200 mutaciones sin sentido ha informado de1,2,3 , respectivamente, que corresponde a cerca del 60% de la cuenta total mutación. Numerosas nuevas variantes de genes todavía están siendo identificadas, muchos de los cuales tienen desconocido significado. Estudios bioquímicos revelaron que ciertos genotipos no conducen a una pérdida de función comp....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. preparación del mutante pcDNA3.1/GLA y pcDNA3.1/GAA construcciones

Nota: Las estrategias de clonación de GLA y GAA codificación secuencias (cds) han sido reportados de15,anterior18.

  1. Mutagénesis sitio-dirigida mediante mutagénesis sitio-dirigida
    1. Uso la referencia de las secuencias NM_000169.2 y NM_000152.4 como plantillas para la mutagénesis de los genes GLA y GAA , respectivamente. Tienen un conjunto de sal iniciadores libres de alta pureza (25-37-mers) sintetizada por un proveedor comercial, con iniciad....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El procedimiento de mutagénesis
Para evaluar la eficiencia de mutagénesis GLA gen, las mutaciones se clasificaron en una de las siguientes categorías. Este enfoque para generar mutaciones reveló que cerca de 66,5% de las mutaciones de GLA se obtuvieron en el primer intento. Un 25% podría obtenerse después de un PCR de segunda ligeramente modificada.

Categoría 1: La mutagénesis PCR fue efecti.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo descrito en el presente documento ofrece resultados robustos para la evaluación de daños de la enzima en enfermedades lisosomales hereditarias del metabolismo. Este manuscrito es que una enmienda al protocolo publicado anterior15. Las modificaciones más importantes implican rigor (es decir, en el proceso de preparación de construcción de vector mutante), normalización del Protocolo de la cultura de célula (es decir, las condiciones de mantenimiento y transfección de .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Acknowledgements

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Los autores desean reconocer la Loebert Mandy y Tina Czajka excelente soporte técnico. Agradecemos Flora Luo (Harvard Medical School, Boston, MA, USA) lengua ayuda de edición.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Material
QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit Stratagene, La Jolla, CA, USA#200522
Primer GLA[R301Q]-frw: 5&agudo;- CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3&agudo;MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanian.a.Primer
GLA[R301Q]-rev: 5&agudo;- GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3&agudo;MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanian.a.Primer
GLA[A156V]-frw: 5&agudo;-CTA CGA CAT TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3&agudo;MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanian.a.Primer
GLA[A156V]-rev: 5´-CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3´MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanian.a.Primer
GLA[A156V]-frw: 5&agudo;-GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3&agudo;MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanian.a.Primer
GLA[A143T]-rev: 5´-TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3&agudo;MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanian.a.Primer
GAA[F455Y]-frw: 5&agudo;-CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3&agudo;MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanian.a.Primer
GAA[F455Y]-rev: 5´-TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3´MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanian.a.Primer
GAA[P545L]-frw: 5´-CAC CCT ACG TGC TTG GGG TGG TTG G-3´MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanian.a.Primer
GAA[P545L]-rev: 5&agudo;-CCA ACC ACC AGC ACG TAG GGT G-3&agudo;MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanian.a.Primer
GAA[L552P]-frw: 5&agudo;-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3&agudo;MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanian.a.Primer
GAA[P545L]-rev: 5&agudo;-GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3&agudo;MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanian.a.Primer
T7: 5&agudo;-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3&agudo;MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanian.a.Primer
BGHrev: 5´-TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3´MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Alemanian.a.Triptona
Carl Roth, Karlsruhe, Alemania8952.1
Extracto de levaduraMerck, Darmstadt, Alemania103.753
Cloruro de sodioMerck, Darmstadt, Alemania1.064.041.000
Cloruro de potasioMerck, Darmstadt, Alemania1.049.360.500
MgCl2 x 6H2OMerck, Darmstadt, Alemania1.058.330.250
D (+)-Glucosa monohidratoMerck, Darmstadt, Alemania1.083.422.500
Hidróxido de sodioMerck, Darmstadt, Alemania1.064.980.500
GlicinaCarl Roth, Karlsruhe, Alemania3908.2
Ácido cítricoCarl Roth, Karlsruhe, AlemaniaX863.3
Hidrogenofosfato disódicoMerck, Darmstadt, Alemania1.065.860.500
Acetato de sodioMerck, Darmstadt, Alemania1.062.640.050
Ácido acético glacialSigma Aldrich, Múnich, AlemaniaA6283
LB AgarCarl Roth, Karlsruhe, AlemaniaX969.2
LB MedioCarl Roth, Karlsruhe, AlemaniaX968.2
Kit de minipreparación de plásmidoZyppy ZymoResearch, Friburgo, AlemaniaD4020
QIAfilter Kit midi de plásmidoQiagen, Hilden, Alemania12245
línea celular de HEK293HInvitrogen, Karlsruhe, Alemania11631-017 
Dulbecco&agudo; s Águila Modificada Medium Invitrogen, Karlsruhe, Alemania31966-047
HyClone suero fetal bovino GE Healthcare, South Logan, Utah, EE. UU.SV30160.03
Penicilina/estreptomicinaInvitrogen, Karlsruhe, Alemania15140-122
Matraces de cultivo celular estándar CELLSTAR, Greiner Bio OneVWR International GmbH, Hannover, Alemania82050-854
Placas de cultivo celular (24 pocillos)Sarstedt, Nü mbrecht, Alemania831.836
Placa de 96 pocillos CellstarGreiner bio one, Frickenhausen, Alemania655185
tubos de reacción SafeSeal, 1,5 mL Sarstedt, Nü mbrecht, Alemania72,706
Lipofectamine 2000Invitrogen, Karlsruhe, Alemania11668-019
Clorhidrato de 1-desoxigalactonojirimicina Sigma Aldrich, Múnich, AlemaniaD9641
Clorhidrato de 1-desoxigalactonojirimicina Toronto Research Chemicals, Toronto, CanadáD236500
1-Desoxinojirimicina Sigma Aldrich, Múnich, AlemaniaD9305
PBS Dulbecco sin calcio, sin magnesioBiochrom, Berlín, AlemaniaL 1825
Tripsina-EDTA (0,05%), rojo de fenolThermo Scientific, Braunschweig, Alemania25300054
Kit de ensayo de proteínas Pierce BCAThermo Scientific, Braunschweig, Alemania23225
4-metilobelifelonaSigma Aldrich, Múnich, AlemaniaM1381
4-Metilumbeliferilo &alfa;-D-galactopiranósidoSigma Aldrich, Múnich, AlemaniaM7633
4-Metilumbeliferol &alfa;-D-glucopiranósidoSigma Aldrich, Múnich, AlemaniaM9766
NombreCompanyNúmero de catálogo Comentarios
Equipment
incubadora tipo T6Heraeus Instruments, Hanau, Alemanian.a.Placa
luminosa Gr. 2 ECarl Roth, Karlsruhe, AlemaniaP265.1
3130 xl Analizador genético Applied Biosystems, Darmstadt, Alemanian.a.GFL-3032
agitador bacterianoGFL, Burgwedel, Alemania n.a.Centrífuga
Avanti J-25Beckman/Coulter, Krefeld, Alemanian.a.Ultraspec
3100 pro EspectrofotómetroAmersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unidon.a.incubadora
con camisa de agua Binder, Tuttlingen, Alemanian.a.Mezclador
táctil Vortex Genie 1Scientific Industries, Bohemia, NY, EE. UUN.A.Z
233 MK-2 centrífuga microtubular refrigeradaHermle, Tuttlingen, Alemania n.a.LaboStar
dispositivo de agua ultrapuraSiemens, Berlín, Alemanian.a.Thermo
Shaker PST-60HL-4 agitador orbitalBiosan, Riga, Letonian.a.Tecan
GENios ReaderTecan, Mä nnedorf, Suizan.a.HI
223 Medidor de pH con microprocesadorHANNA Instruments, Arvore, Portugaln.a.CASY
br/> Sistema de Contador de Células + Analizador
Modelo TT		Innovatis AG, Cham/Zug, Suiza
NombreCompanyNúmero de catálogoComentarios
Software
Magellan software de análisis de datos v6.6Tecan, Mä nnedorf, Suizan.a.GraphPad
Prism 5.04GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA; EE.UU. n.a.Microsoft
Office 2010Microsoft Corporation, Redmond, WA, EE.UU. n.a.BioEdit
Alignment Editor, V7.0.1http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.htmln.a.<
strong>Abreviaturas
frw = adelante; rev = reverso
n.a. = no aplicable
. <

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cardiff University. , http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index. (2017).
  2. Meiji Pharmaceutical University. , http://fabry-database.org (2017).
  3. Erasmus Medical Center. Mutations In Human Acid Alpha-Glucosidase. , http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en (2017).
  4. Ishii, S., et al.

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Fabry DiseasePompe DiseasePharmacological Chaperone TherapyEnzyme Activity MeasurementSite Directed MutagenesisHEK293H CellsAlpha Galactosidase AAcid Alpha GlucosidaseBCA AssayFluorescence Reader

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