Visualización de axón talamocorticales ramificación y sinapsis formación en Organotypic Cocultures

Resumen

Este protocolo describe un método para la proyección de imagen simultánea de talamocorticales axon ramas y sinapsis formación en organotypic cocultures del tálamo y corteza cerebral. Axones individuales talamocorticales y sus terminales presinápticos se visualizan mediante una técnica de electroporación unicelular con DsRed y synaptophysin tagged GFP.

Resumen

Formación de ramas y sinapsis axón son procesos cruciales para el establecimiento de circuitos neuronales precisos. Durante el desarrollo, los axones sensoriales talamocorticales (TC) forman ramas y sinapsis en capas específicas de la corteza cerebral. A pesar de la evidente correlación espacial entre formación de ramas y sinapsis axón, se entiende mal la relación causal entre ellos. Para solucionar este problema, recientemente se desarrolló un método para la proyección de imagen simultánea de formación de ramas y sinapsis de axones individuales de TC en organotypic cocultures.

Este protocolo describe un método que consiste en una combinación de un cocultivo organotypic y electroporación. Cocultures Organotypic del tálamo y corteza cerebral facilitan la manipulación de genes y la observación de procesos axonales, preservar estructuras características tales como configuración laminar. Dos distintos plásmidos codifican DsRed y synaptophysin tagged EGFP (SYP-EGFP) fueron co transfected en un pequeño número de neuronas talámicas por una técnica de electroporación. Este método permitió visualizar las morfologías individuales axonales de neuronas del TC y sus sitios presinápticos simultáneamente. El método también permitió la observación a largo plazo que reveló la relación causal entre formación de ramas y sinapsis axón.

Introducción

La proyección talamocorticales (TC) en el cerebro mamífero es un sistema conveniente para investigar la dirección del axon y mecanismos de focalización. Durante el desarrollo, en la placa cortical y ramas de forma y sinapsis preferentemente en capa IV de las áreas sensoriales primarias en la corteza cerebral^1,2crecen axones sensoriales de TC. Incluso después del establecimiento de las conexiones fundamentales, cenadores axonales y terminales sinápticos son remodelados según cambios ambientales^3,4. Sin embargo, cómo dinámicamente se altera la morfología de axon de TC es mal entendida. Una de las principales razones es la falta de una adecuada técnica para observar los cambios estructurales a nivel unicelular. Aunque los acontecimientos recientes en microscopía, tales como microscopia de dos fotones, han permitido la observación directa de las neuronas corticales de vivo en vivo, hay limitaciones todavía técnicas para capturar el total TC trayectorias^{5, 6}. por lo tanto, en vitro métodos para la proyección de imagen viva de axones de TC serían proporcionar herramientas poderosas para el análisis estructurales de la formación de ramas y sinapsis axón.

Nuestro grupo por primera vez estableció un método de cultura estática de la rebanada con membrana permeable⁷. Usando este método, una porción cortical de la rata fue morfología con un bloque sensorial talámico, y conexiones de TC de lámina específica fueron recapituladas en este organotypic cocultures^7,8. Etiquetado escasa con una proteína fluorescente más nos permitió observar crecimiento del axon de TC y rama formación^9,10,11. Recientemente, hemos desarrollado un novedoso método para la proyección de imagen simultánea de ramificación y formación de sinapsis de axones individuales de TC en el organotypic cocultures¹². Para visualizar simultáneamente TC axones y sitios presinápticos, DsRed y synaptophysin tagged EGFP (SYP-EGFP) fueron co transfected en un pequeño número de neuronas talámicas por electroporación de la organotypic cocultivo. El método actual facilita el análisis morfológico de los axones de TC y permite la observación a largo plazo, que puede utilizarse para demostrar la relación causal entre formación de ramas y sinapsis axón.

Protocolo

Todos los experimentos se realizaron según las pautas establecidas por los comités de bienestar animal de la Universidad de Osaka y de la sociedad de Neurociencia de Japón.

1. Organotypic cocultures del tálamo y corteza cerebral

Nota: Para el procedimiento detallado, consulte las publicaciones originales^7,8,13. Todos los procedimientos deben realizarse bajo condiciones estériles. Las ratas de Sprague-Dawley (SD) se utilizan para cultivos neuronales.

1. Preparaciones de reactivos
   Nota: Volúmenes de los reactivos siguientes son para el cerebro de una rata.
   1. Preparación 10 x suplemento modificado de N2 ¹³: insulina (50 μg/mL), progesterona (200 nM), hidrocortisona (200 nM), selenito de sodio (300 nM), transferrina (1 mg/mL), putrescina (1 mM), glucosa (60 mg/mL)
   2. Preparar medio de cultivo que contiene suero (10 mL): 85% DMEM/F12, suplemento de N2 de 10 x modificado de 10%, 5% de suero bovino fetal (FBS)
   3. Preparar medio de cultivo libre de suero (20 mL): 90% DMEM/F12, 10% x 10 modificado N2 suplemento
   4. Preparar la solución de colágeno de cola de rata (0,5 mL). En Resumen, tomar fibras sensibles de una cola de rata bajo condiciones estériles e incubar durante una noche en solución de ácido acético. Después de la centrifugación, el sobrenadante (unos pocos mg/mL) de recoger y almacenar en un refrigerador¹³.
2. Preparación de platos típicos de la cultura
   1. Coloque una membrana en una placa de Petri de 35 mm.
   2. Añadir 40-50 μL de solución de colágeno de cola de rata a la membrana y distribuir la solución de colágeno alrededor del centro.
   3. Secar la membrana totalmente en una mesa de trabajo limpia.
   4. Poner 1.5-2 mL de medio de cultivo que contiene el suero en el plato, para que la membrana se empapa con el medio.
   5. Coloque la placa de cultivo en un incubador (37 ° C, aire humidificado de 95% y 5% CO₂) antes de la galjanoplastia.
3. Preparación de láminas corticales
   1. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos con etanol al 70% durante 10 minutos o más.
   2. Diseccionar el cerebro entero rápidamente de un día postnatal (P) 2 rata bajo anestesia helada (inmersa en pedacitos de hielo por unos minutos).
   3. Lugar del cerebro en un 100 mm plato de Petri que contiene 100 mL de frío Hanks había equilibrada solución de sal.
   4. Saque el asunto de pia el cerebro con pinzas finas y cortar rebanadas corticales (300-400 μm de espesor) de la corteza visual y somatosensorial con tijeras de microcirugía (para detalles, ver figura 1).
      Nota: El espesor de las láminas corticales se estima aproximadamente por la escala de redes bajo un microscopio binocular.
      Nota: Alternativamente, se pueden hacer rebanadas corticales con un vibratome bajo condiciones estériles.
   5. La transferencia de unas láminas corticales en la inserción de la membrana con una pipeta de plástico desechable.
   6. Ajustar las posiciones de las láminas cerca del centro de la cultura de inserción con una pipeta Pasteur fuego pulido (para más detalles, vea^8,13) y quitar exceso medio de la inserción.
      Nota: Ajuste el nivel del medio ligeramente por debajo de la superficie de las rodajas para que las láminas pueden recibir un suministro suficiente del gas y el medio. Esto es crucial para la viabilidad celular.
   7. Mantener las rebanadas en el medio de cultivo que contiene el suero a 37 ° C en un ambiente humidificado 95% aire y 5% CO₂y cultura solo para un día antes de un bloque talámico se toma y se coloca junto a él.
4. Preparación de bloques talámicos
   1. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos con etanol al 70% durante 10 minutos o más.
   2. Anestesiar una rata embarazada (embrionario día 15) por inyección intraperitoneal de pentobarbital (50 mg/kg) que contiene anestésico.
   3. Diseccionar cada embrión de los cuernos uterinos y coloque los embriones en una placa de Petri que contiene 100 mL de solución salina equilibrada fría madejas de 100 mm.
   4. Microscopio binocular, quitar el cerebro de cada embrión y cortar bloques talámicos que contienen principalmente el ventrobasal núcleo articulado lateral y complejo (aproximadamente 0,5 mm x 3)⁷ con unas tijeras de microcirugía (ver figura 1).
5. La cultura y mantener organotypic cocultures
   1. Con una pipeta Pasteur, colocar el bloque talámico junto a la superficie ventricular de la laminar cortical que se ha colocado en el filtro de membrana.
   2. Mantener las cocultures en el medio de cultivo que contiene el suero a 37 ° C en un ambiente de aire humidificado de 95% y 5% CO₂.
   3. La mitad del medio con el medio de cultivo libre de suero de intercambio después de dos días en la cultura. Después de eso, cambiar el medio cada 2-3 días.
      Nota: El nivel del medio debe medirse después del cambio de medio, ya que es importante para la supervivencia de la célula.

2. electroporación

Todos los procedimientos deben realizarse bajo condiciones estériles.

Nota: Realizar electroporación un día después de la preparación de los bloques talámicas para evitar desprendimiento de los bloques.

1. Plásmidos
   1. Hacer una mezcla de plásmidos como sigue: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-EGFP 3.5 μg/μL.
      Nota: Purificar el ambos plásmidos utilizando el kit de Maxiprep libre de endotoxinas y se disuelven en una solución salina equilibrada de Hanks.
2. Instalación de equipos de electroporación
   Los instrumentos eléctricos tales como un estimulador y un aislador deben conectarse como se indica en la figura 2.
   1. Conectar el estimulador para el aislador bifásico.
   2. Conectar un electrodo (un alambre de plata 0,2 mm de diámetro) a la terminal negativa del seccionador.
   3. Un electrodo (un alambre de plata 1 mm de diámetro) se conectan en serie a un resistor Ω 100 y el terminal positivo de su aislador.
   4. Conectar el amplificador al osciloscopio para monitorear si las corrientes eléctricas pasan a través de la resistencia mediante la medición de la tensión con el amplificador.
3. Preparación de pipetas de vidrio
   Nota: Se utilizan dos tipos de pipetas de vidrio para la eyección de la solución de plásmido y la aplicación de pulsos eléctricos.
   1. Hacer las pipetas de Capillares de vidrio de con un tirador de electrodo.
   2. Romper la punta de la pipeta de la eyección (el diámetro de la punta debe ser 20-50 μm).
   3. Moler y para pulir la punta de la pipeta de electrodo con papel de lija seguido fuego pulido (el diámetro interior debe ser de 50-200 μm).
      Nota: La punta del electrodo debe ser plana y lisa, ya que toca directamente el tejido.
4. Procedimiento de la electroporación
   1. Conecte las pipetas de la eyección y el electrodo a los manipuladores.
   2. Inserte un alambre de plata (0,2 mm de diámetro) con la pipeta de electrodo.
   3. Coloque la pipeta de expulsión a una jeringa de 1 mL con un tubo de plástico.
   4. Tomar > 5 μL de solución de plásmido en la pipeta de la eyección por la succión de la jeringa.
   5. Poner el cocultivo en la etapa de electroporación e Inserte el electrodo de diámetro de 1 mm en el medio de cultivo.
   6. Coloque la pipeta de eyección en el explante talámica.
   7. Empujar la jeringa manualmente después de que la punta toque la superficie del bloque talámica.
      Nota: Acerca de 0,5 μL del plásmido solución se utiliza generalmente por un bloque talámico.
   8. Coloque la pipeta del electrodo en el bloque talámico inmediatamente después de la retracción de la pipeta de expulsión.
   9. Entregar pulsos eléctricos (50-400 μA, trenes de 3 a 5 de 200 pulsos cuadrados de 1 ms de duración a 200 Hz). Controlar la amplitud y el número de trenes en el osciloscopio.
      Nota: La amplitud de las corrientes eléctricas depende del diámetro interior de un electrodo pipeta¹³.
   10. Retraiga la pipeta de electrodo y vuelva el plato a la incubadora.
5. Observación microscópica
   1. Poner la placa de cultivo en una etapa microscópica de un microscopio confocal vertical equipado con dos conjuntos de filtro para la EGFP (excitación, 488 nm, emisión, 515 nm) y DsRed (excitación, 514 nm, emisión, 565 nm).
   2. Tomar imágenes de secciones ópticas de 10-25 en tamaños de 1 a 7 μm-paso con un 20 X trabajo larga distancia objetivo. Seleccione individualmente distinguibles etiquetados axones que expresan DsRed y SYP-EGFP.
      Nota: El área observado es aproximadamente de 0,7 x 0,7 mm (correspondiente a 1024 x 1024 píxeles, es decir, 0.68 μm/píxeles).
   3. Capturar imágenes cada 24 h para la proyección de imagen de diario. Completa en 10 min a temperatura ambiente y retomar las culturas de la incubadora. Para la proyección de imagen de lapso corto intervalo de tiempo, conservar el cultivo en un compartimiento de la cultura, que mantiene que el ambiente de humidificado 95% aire y 5% CO₂ a 37 ° C.

Resultados

El experimento descrito aquí tiene como objetivo revelar la relación entre formación de ramas y sinapsis de axones TC. Para visualizar simultáneamente axonales trayectorias y ubicaciones de los sitios presinápticos, sola o algunas células talámicas en organotypic cocultures fueron transfectadas con dos plásmidos codifican SYP-EGFP y DsRed mediante electroporación. Durante la segunda semana de la cultura, axones TC individualmente distinguibles claramente fueron etiquetados por DsRed (

Discusión

El protocolo actual es también una poderosa herramienta para el estudio de aspectos del desarrollo del crecimiento de axones que de la proyección de TC¹¹. Por ejemplo, una combinación de cultura sector cortical y la técnica de electroporación permite visualizar cada morfología axonal de neuronas corticales y larga observación^9,18.

Mediante el protocolo actual, el papel de genes interesantes en la formación de ra...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM/F12	GIBCO	11320-033
Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS)	Nissui	5905
Suero fetal bovino (FBS)	Thermo Scientific	SH30396-03	Hyclone
Insulina	Sigma	I6634
Progesterona	Sigma	P8783
Hidrocortisona	Sigma& nbsp;	H0888
Selenito de sodio	Wako Pure Industrias Químicas	192-10843
Transferrin	Sigma	T1147
Putrescine	Sigma	P5780
Glucosa	Wako Pure Chemical Industries	16806-25
placas de Petri de 35 mm	Inserto Falcon	351008
Millicell-CM	Millipore	PICMORG50
placas de Petri de 100 mm	BIO-BIK	I-90-20	placa de Petri estéril
HiPure Plasmid Maxiprep Kit	Invitrogen
Pipetas de plástico estériles		202-IS	pipetas de transferencia estériles
Capilar de vidrio: OD 1,2 mm	Narishige	G-1,2	diámetro interior, 1,2 mm
Alambre de plata: 0,2 y 1 mm	Nilaco	AG-401265 (diámetro, 0,2 mm), AG-401485 (diámetro, 1,0 mm)
Jeringa de 1 mL	Terumo	SS-01T
Estimulador	A.M.P.I	Master 8
Aislador bifásico	BSI-2		BAK ELECTRONICS
 	modelo 1800		A-M Systems
	Manipulador Hitachi	VC-6723
Micromanipulador	Narishige	SM-15
Micromicroscopio	estereoscópico Narishige	MO-10
	Olympus	SZ40
Soporte universal	Sistema	Olympus SZ-STU2
	Olympus	LG-PS2, LG-DI, HLL301
Extractor de electrodos	Narishige	PC-10
Microscopio confocal	Nikon	Digital eclipse C1 láser
x20 objetivo	Nikon	ELWD 20x/0.45
Cámara de cultivo	Tokai Hit	UK A16-U
Sprague-Dawley (SD) rata	Japón SLC y Nihon-Dobutsu
Tijeras de microcirugía	Natsume	MB-54-1