Este protocolo describe un método para la proyección de imagen simultánea de talamocorticales axon ramas y sinapsis formación en organotypic cocultures del tálamo y corteza cerebral. Axones individuales talamocorticales y sus terminales presinápticos se visualizan mediante una técnica de electroporación unicelular con DsRed y synaptophysin tagged GFP.
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Artículo de método
Visualización de axón talamocorticales ramificación y sinapsis formación en Organotypic Cocultures
En este artículo
Resumen
Resumen
Formación de ramas y sinapsis axón son procesos cruciales para el establecimiento de circuitos neuronales precisos. Durante el desarrollo, los axones sensoriales talamocorticales (TC) forman ramas y sinapsis en capas específicas de la corteza cerebral. A pesar de la evidente correlación espacial entre formación de ramas y sinapsis axón, se entiende mal la relación causal entre ellos. Para solucionar este problema, recientemente se desarrolló un método para la proyección de imagen simultánea de formación de ramas y sinapsis de axones individuales de TC en organotypic cocultures.
Este protocolo describe un método que consiste en una combinación de un cocultivo organotypic y electroporación. Cocultures Organotypic del tálamo y corteza cerebral facilitan la manipulación de genes y la observación de procesos axonales, preservar estructuras características tales como configuración laminar. Dos distintos plásmidos codifican DsRed y synaptophysin tagged EGFP (SYP-EGFP) fueron co transfected en un pequeño número de neuronas talámicas por una técnica de electroporación. Este método permitió visualizar las morfologías individuales axonales de neuronas del TC y sus sitios presinápticos simultáneamente. El método también permitió la observación a largo plazo que reveló la relación causal entre formación de ramas y sinapsis axón.
Introducción
La proyección talamocorticales (TC) en el cerebro mamífero es un sistema conveniente para investigar la dirección del axon y mecanismos de focalización. Durante el desarrollo, en la placa cortical y ramas de forma y sinapsis preferentemente en capa IV de las áreas sensoriales primarias en la corteza cerebral1,2crecen axones sensoriales de TC. Incluso después del establecimiento de las conexiones fundamentales, cenadores axonales y terminales sinápticos son remodelados según cambios ambientales3,4. Sin embargo, cómo dinámicamente se altera la morfología....
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Protocolo
Todos los experimentos se realizaron según las pautas establecidas por los comités de bienestar animal de la Universidad de Osaka y de la sociedad de Neurociencia de Japón.
1. Organotypic cocultures del tálamo y corteza cerebral
Nota: Para el procedimiento detallado, consulte las publicaciones originales7,8,13. Todos los procedimientos deben realizarse bajo condiciones estériles. Las ratas de Sprague-Dawley (SD) se utilizan para cultivos neuronales.
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Preparaciones de reactivos
Nota:<....
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Resultados
El experimento descrito aquí tiene como objetivo revelar la relación entre formación de ramas y sinapsis de axones TC. Para visualizar simultáneamente axonales trayectorias y ubicaciones de los sitios presinápticos, sola o algunas células talámicas en organotypic cocultures fueron transfectadas con dos plásmidos codifican SYP-EGFP y DsRed mediante electroporación. Durante la segunda semana de la cultura, axones TC individualmente distinguibles claramente fueron etiquetados por DsRed (
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Discusión
El protocolo actual es también una poderosa herramienta para el estudio de aspectos del desarrollo del crecimiento de axones que de la proyección de TC11. Por ejemplo, una combinación de cultura sector cortical y la técnica de electroporación permite visualizar cada morfología axonal de neuronas corticales y larga observación9,18.
Mediante el protocolo actual, el papel de genes interesantes en la formación de ra.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
También agradecemos a Gabriel Hand para lectura crítica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | GIBCO | 11320-033 | |
| Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) | Nissui | 5905 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Thermo Scientific | SH30396-03 | Hyclone |
| Insulina | Sigma | I6634 | |
| Progesterona | Sigma | P8783 | |
| Hidrocortisona | Sigma& nbsp; | H0888 | |
| Selenito de sodio | Wako Pure Industrias Químicas | 192-10843 | |
| Transferrin | Sigma | T1147 | |
| Putrescine | Sigma | P5780 | |
| Glucosa | Wako Pure Chemical Industries | 16806-25 | |
| placas de Petri de 35 mm | Inserto Falcon | 351008 | |
| Millicell-CM | Millipore | PICMORG50 | |
| placas de Petri de 100 mm | BIO-BIK | I-90-20 | placa de Petri estéril |
| HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | ||
| Pipetas de plástico estériles | 202-IS | pipetas de transferencia estériles | |
| Capilar de vidrio: OD 1,2 mm | Narishige | G-1,2 | diámetro interior, 1,2 mm |
| Alambre de plata: 0,2 y 1 mm | Nilaco | AG-401265 (diámetro, 0,2 mm), AG-401485 (diámetro, 1,0 mm) | |
| Jeringa de 1 mL | Terumo | SS-01T | |
| Estimulador | A.M.P.I | Master 8 | |
| Aislador bifásico | BSI-2 | BAK ELECTRONICS | |
| &NBSP; | modelo 1800 | A-M Systems | |
| Manipulador Hitachi | VC-6723 | ||
| Micromanipulador | Narishige | SM-15 | |
| Micromicroscopio | estereoscópico Narishige | MO-10 | |
| Olympus | SZ40 | ||
| Soporte universal | Sistema | Olympus SZ-STU2 | |
| Olympus | LG-PS2, LG-DI, HLL301 | ||
| Extractor de electrodos | Narishige | PC-10 | |
| Microscopio confocal | Nikon | Digital eclipse C1 láser | |
| x20 objetivo | Nikon | ELWD 20x/0.45 | |
| Cámara de cultivo | Tokai Hit | UK A16-U | |
| Sprague-Dawley (SD) rata | Japón SLC y Nihon-Dobutsu | ||
| Tijeras de microcirugía | Natsume | MB-54-1 |
Referencias
- Kageyama, G. H., Robertson, R. T. Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis. J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).
- Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. Thalamocortical ....
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Reimpresiones y permisos
