Caracterización de extensiones de la membrana de la célula y estudiar sus funciones en la dinámica de adherencia celular cáncer

Resumen

Este estudio demuestra la utilidad y la facilidad de la medida de extensión cuantitativa membrana de la célula y su correlación con la capacidad adhesiva de las células. Como un ejemplo, aquí mostramos esa proteína Dickkopf-relacionada 3 (DKK3) promueve la formación mayor lobopodia y adhesividad celular adrenocortical carcinoma de células en vitro.

Resumen

Repertorio de extensión de la membrana celular modula diversos comportamientos malignos de las células cancerosas, incluyendo su potencial adhesivo y migratorias. La capacidad para clasificar y cuantificar extensiones de la célula y medir el efecto sobre la capacidad adhesiva de las células exactamente es fundamental para determinar cómo-señalización celular eventos impacto cáncer célula comportamiento y agresividad. Aquí, describimos el diseño en vitro y el uso de un celular cuantificación método de extensión en conjunto con un análisis de la capacidad de adherencia en un modelo establecido en vitro para carcinoma adrenocortical (ACC). En concreto, ponemos a prueba los efectos de DKK3, un supresor tumoral putativo y un factor de Pro-diferenciación, en el fenotipo de la extensión de la membrana de la línea celular ACC, SW-13. Proponemos estos ensayos para proporcionar relativamente simple, confiable, y métricas fácilmente interpretable para medidas de estas características en diversas condiciones experimentales.

Introducción

Dysregulated WNT de señalización juega un papel crítico en neoplasias adrenocorticales¹. Los métodos utilizados en este estudio investigan si silenciamiento de DKK3, un regulador negativo de la señalización de WNT, representa un acto de diferenciación en la corteza suprarrenal y promueve la formación de un tumor en el contexto de los cambios de repertorio de extensión de la célula. DKK3 es un 38 kDa secretada glicoproteína con un péptido de señal N-terminal y estudios anteriores han demostrado que su expresión forzada dio lugar a la detención del ciclo celular, inhibe el comportamiento maligno agresivo e invertida epitelial-mesenquimal transici....

Protocolo

1. características de la extensión de la célula

1. Mantener 13 SW, SW-Neo y células SW-DKK3 en un estándar incubador humedecido a 37,0 ° C y 5% CO₂ en medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con suero bovino fetal 10% y 10.000 U/mL de penicilina y estreptomicina (señalado como' crecimiento').
   1. Contar las células usando un hemocitómetro y 5.000 células por pozo 13 SW, SW-Neo y líneas de SW-DKK3 de la placa en placas de 6 pozos separadas y crecen durante la noche en medio del crecimiento en cubreobjetos de vidrio estéril.
2. Crecimiento durante la noche, para cada bien, aspirar el medio de crecimiento, lavar las cé....

Resultados

Usando el análisis anteriores, los efectos de la sobreexpresión de DKK3 en células extensión morfología y propiedades de adhesión de célula fueron probados en la línea establecida de células ACC SW-13, en vitro. Se generaron células overexpressing DKK3 estable transfectar las células SW-13 con Myc-DDK tagged pCMV6-entrada/DKK3 plasmid vectores y señalado como SW-DKK3. Del mismo modo, las células transfectadas estable con vector vacío pCMV6-entrada fueron creadas como un control d.......

Discusión

Aquí describimos un método cuantitativo en vitro para caracterizar extensiones de la célula con facilidad, algunas caídas de hoyo y reproducibilidad confiable que puede ser aplicado para diferentes condiciones de prueba. Por otra parte, ensayos de adhesión y motilidad simple, cuantificables pueden realizarse simultáneamente para correlacionar el potencial significación funcional de las alteraciones observadas en las extensiones de la membrana de la célula.

Sin embargo, estos métodos p.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)	ThermoFisher	11965-092	Suplementado con suero fetal bovino y penicllin y estreptomicina
Solución salina tamponada con fosfato de Deulbeco	Sigma-Aldrich	D8537	1X, utilizada directamente
con formaldehído al 3,7%	Sigma-Aldrich	F8775	Solución madre diluida
0,05% violeta cristalino	Harleco	192-12	Solución madre diluida
Agua desionizada NA		NA
NA Microscopio con aumento de 400X	NA	NA	NA Placas
de 6 pocillos	Corning	353046	NA
Solución de disociación celular no enzimática 1X	Sigma-Aldrich	C5914	Solución 1X, utilizada directamente