Summary
I detta protokoll visar vi tillämpningen av följetong-avsnitt elektron datortomografi att belysa mitokondriell struktur i Drosophila indirekta flyg muskel.
Abstract
Mitokondrierna är cellernas kraftcentrumen som producerar ATP, lipider och metaboliter, samt reglera kalcium homeostasen och cell död. Den unika cristae-rika dubbla membran ultrastruktur av denna organell arrangeras elegant att utföra flera funktioner genom partitionering biomolekyler. Mitokondriell ultrastruktur är intimt knuten med olika funktioner; fina detaljer av dessa struktur-funktionssamband är dock bara början ska beskrivas. Här visar vi tillämpningen av följetong-avsnitt elektron datortomografi att belysa mitokondriell struktur i Drosophila indirekta flyg muskel. Följetong-avsnitt elektron tomografi kan anpassas att studera någon cellulära struktur i tre dimensioner.
Introduction
Elektronmikroskopi är ett värdefullt verktyg att studera strukturella ramen för subcellulär församlingar och organeller som utför cellulära processer. Metoder har utvecklats för att bevara ultrastruktur av vävnader eller celler antingen genom kemiska fixering med aldehydes eller av högt tryck frysning (HPF) följt av frysa substitution (FS)1,2. De inbäddade Preparatsegment får sedan vara sektioneras, målat och observerade med ett transmissionselektronmikroskop (TEM). HPF preparatet kunde också bearbetas cryo-villkor, såsom cryo-snittning eller genom fokuserad ion beam (FIB) fräsning och observeras av cryo-EM3,4.
Tunn-avsnitt EM ger informativa morfologiska insikter, kan de resulterande 2D-bilderna endast avslöja ultrastruktur med en viss tvärsnitt. Hur ultrastruktur är organiserad i en 3D-volym fortfarande skyms. För att visualisera cellulära ultrastruktur i tre dimensioner, utvecklades en elektron tomografi metoden där serie tilt bilder var förvärvat och tillbaka beräknas generera en tomografiska återuppbyggnad5 (figur 1). En dubbel tilt-serien kan samlas in genom roterande provet 90° och skaffa en andra tilt-serien. Detta minimerar saknas-wedge artefakter som leder från begränsad provtagning vinklar och förbättrad upplösning av tomogram.
Här, beskriver vi tillämpningen av följetong-avsnitt elektron datortomografi att studera mitokondriell ultrastruktur Drosophila indirekta flyg muskel (IFM)6,7,8,9 . För att få 3D rekonstruktioner som täcker hela mitokondrier (cirka 2,5 µm tjock), erhölls seriell avsnitt från Drosophila IFM vävnad block. Tomograms av varje avsnitt samlades individuellt med automatisk data insamling programvara. Tomografiska rekonstruktioner genererades och seriell tomograms förenades med IMOD paketet att erhålla en rekonstruerad volym av en hela mitokondrie. De förenade tomograms analyserades av 3D-program. Tätheterna av mitokondriella cristae segmenterades för att generera en segmenteringsmodell som avslöjade organisationen i tre dimensioner.
Protocol
1. avsnitt Drosophila vävnader med hjälp av en vibrerande blad mikrotom
- Söva Drosophila på isen och doppa varje enskild fluga i 1 mL 4% låg smälttemperatur agaros i fosfatbuffert. Tillåta agaros att stelna på is. Normalt bearbetades 4-6 flugor.
- Använd en vibrerande blad mikrotom avsnitt agarosgel inbäddade Drosophila in skivor med 100 µm tjocklek och fördjupa i fixativ lösning innehållande 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffert.
Obs: Vibratome snittning är att föredra eftersom vävnaden arkitekturen är mer intakt jämfört med andra metoder. Alternativt, dissekera pincett kan användas att dissekera IFM in fixativ lösningen innehållande 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffert.
2. Förbered EM exemplar av högtrycks frysning och frysa substitutionsmetoden (HPF/FS)
- Tvätta vävnadssnitt i 3 droppar (~ 150 µL) fosfatbuffert, följt av 2 droppar (~ 100 µL) fosfatbuffert med 20% BSA. Placera sedan sektioner i guld bärare för HPF fylld med buffert och 20% BSA.
- Fyll provet som innehåller bärare till en högtrycks frys enligt bruksanvisningen.
- Efter frysning, släppa bärare från innehavaren under flytande kväve och överföra till en freeze-substitution enhet kyls till-140 ° C.
- Utföra protokollet frysa-substitution som visas i tabell 1, med FS cocktail som innehåller 2% glutaraldehyd, 2% osmium vanligtvis och 0,1% uranyl acetat i aceton.
- Försiktigt bort exemplaren från transportörer med en nål och bädda in exemplar i harts vid rumstemperatur. Polymerisera kådan på 65 ° C i 16 h.
Obs: FS protokoll bör ändras för att förbereda andra typer av prover. HPF/FS föredras att bevara ultrastruktur och minimera förlusten av cellulära innehållet.- Alternativt, använda en kemisk fixering protokoll. Fixa exemplar med 2,5% glutaraldehyd över natten, tvätta med buffertar och sedan fixa med 1% osmium vanligtvis för 2 h. Tvätta och torka med stigande koncentrationer av etanol och sedan infiltrera och bädda in exemplar i Spurrs kåda innan polymeriserande vid 65 ° C för 16 h.
3. Förbered Serial-sektioner av exemplar för elektron tomografi
- Putsa preparatet block för att exponera önskade block ansiktet som innehåller vävnad.
- Förbehandla guldpartiklar (10 nm i diameter) med 1% BSA för 30 min. Tvätta och suspendera guldpartiklar i PBS-bufferten. Överlagra guldpartiklar på koppar slot rutnät belagd med carbon film att skapa relaterat markörer.
- Kolla under TEM ha tillräcklig relaterat markörer (minst 5-10 markörer) i synfältet av tomografi förvärv.
- Skär seriell avsnitt, 200-250 nm i tjocklek, med hjälp av en ultramicrotome.
- Samla in seriell avsnitt på slot rutnät med en perfekt slinga för tunnslip.
- Fläcken avsnitten med Reynolds bly citrat i 10 min.
- Överlagra ett andra lager av relaterat guldpartiklar på toppen av avsnitten.
4. samla dubbel-tilt Electron tomografi
- Ladda rutnätet på en två-axlad tomografi hållare och infoga i den transmissionselektronmikroskop på 200 kV.
- Rikta in mikroskopet på eucentric focus.
- Ställa in automatisk data collection programvaran. Justera och anpassa elektronen strålar på flerskalig imaging inställning. Se bruksanvisning för drift detalj10 (figur 2).
- Förvärva kamera mörka och ljusa referenser i ett tomt område utan kolfilm under inställningen tomografi samling.
- Samla en grid atlas i låg förstoring. Välj mitokondrier på seriell sektioner som mål för tomografi samling.
- Förvärva en tilt-serien från-60 ° till + 60 ° med 2 ° steg på axis-en för varje mål.
Obs: Lutningsvinklar kommer att mekaniskt begränsas av utformningen av preparathållaren. Innehavaren kommer att blockera balken på hög lutningsvinklar. - Samla in den andra tilt-serien, rotera preparathållaren 90°. Förvärva en ny atlas. Välj motsvarande positioner och förvärva tilt serien på axis-B för varje mål.
Obs: Andra mjukvarupaket, såsom SerialEM och Xplore3D, är tillgängliga för automatisk datainsamling.
5. rekonstruera 3D Tomograms och Segment sub-volymer med hjälp av programvara
- Rekonstruera tomograms två-axlad tilt avbildningar med IMOD programvara11.
- Se bruksanvisning för drift detalj.
- Justera de individuella tilt serierna av positionerna för guld relaterat markörer. Rekonstruera tomograms antingen genom metoden tillbaka projektion eller genom den samtidiga iterativ rekonstruktion teknik (SIRT) metoden för både Axel-A och axis-B, respektive (figur 3).
- Kombinera tomograms av Axel-A och axis-B för att generera en dubbel-tilt tomogram med minskad saknas kil artefakt.
- Gå samman dubbel-tilt tomograms seriell avsnitt att erhålla rekonstruktioner som täcker hela mitokondrien volym. Modell klyftorna mellan seriell avsnitt av programmet IMOD.
- Trimma Förenade tomograms och bin till önskad storlek för volym segmentering.
- Analysera gick följetong tomograms med 3D programvara.
- Se bruksanvisning för drift detalj.
- Filtrera på tomograms med en Gaussisk filter (eller annan önskad metod) för att förbättra kontrasten av funktioner och minska bakgrund tätheter.
- Segmentera ultrastruktur av mitokondrier antingen manuellt eller automatiskt.
- Visa segmentering modeller för att möjliggöra kontroll i 3D.
- Skapa filmer med hjälp av verktygen i 3D.
Representative Results
Vi tillämpat seriell-avsnitt elektron datortomografi för att analysera strukturella drag hos mitokondrisk crista som återspeglar dess energiska staten och åldrande. Vi visade att mitokondrier Drosophila IFM bildar en integrerad cristae och matrix nätverket i 3D (figur 4)7. Dessutom ackumuleras muterade flugor med mitokondrie DNA-replikering defekt och ett påskyndat åldrande fenotyp mitokondrier som innehöll underavsnitt av lök-liknande virvlande core (figur 5)7.
Figur 1: Illustration av elektron tomografisk rekonstruktion från en tilt serie. I experimentet leds en elektronstråle genom ett 3D-objekt när objektet lutas i olika grad. För varje tilt villkor, en 2D projektion genereras och tagits med en kamera. 2D prognoserna väntas sedan tillbaka rekonstruera 3D-objektet baserat på centrala slice sats. I bild visas samma process för en ursprungliga 2D-bild som projiceras in i en enda dimension under olika lutningsvinklar. 1D prognoserna används sedan för att rekonstruera den 2D-bilden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: automatisk datainsamling. En image viewer uppvisning av programvara visar atlas av ett slot rutnät som innehåller seriell avsnitt, flerskalig inriktning av mitokondrier och förvärvade luta bilder. Skalstapeln = 500 µm (vänster övre panelen), 100 µm (nedre vänstra panelen), 1 µm (höger panel). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Serial-avsnitt elektron tomografi av en enda mitokondrie i Drosophila indirekta flyg muskel. (A) 2D micrographs och (B) 3D tomograms från seriell sektioner som täcker hela volymen av en mitokondrie. (C), gick följetong-avsnittet tomograms beräknas skapa ett längdsnitt, med z-axeln visas vertikalt. Särskilt, ledde vävnad snittning till förlust av material, lämnar luckor mellan Förenade tomograms. Skalstapeln = 500 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: integrerad matrix nätverket avslöjade i 3D och intra-mitokondrierna cristae. (A) skivor mitokondriell elektron tomografiska rekonstruktioner visar växlar mellan lamellär membran genom z-axeln. (B) illustrationer av observerade cristae byta mönster av just högerhänta eller vänsterhänta spiraler. (C) tomografiska segmentering som illustrerar en vänsterhänt spiral i 3D (D) Cristae byta mönster var analyseras och färg-återges på segmenteringsmodell (E, F). Tomografiska segment visar laterala matrix konfluens (mörka tätheter, märkt röd) över cristae membran (vit tätheter). (G) segmentering modell av den tomogram i (E) visar laterala matrix konfluens (i rött) och representativa cristae (i grått). Skalstapeln = 50 nm (A), 200 nm (C), och 300 nm (D, E, F, G). Siffran var nytryck från Jiang et al. 7 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: mitokondrier med lök-liknande virvlande kärnor ackumuleras i flugor med mitokondrie DNA-replikering defekter under åldrande. Representativa tomografiska skivor och motsvarande segmentering (rätt panelerna) visar en tvärsnittsvyn (överst) och längdsnitt utsikt (nederst) av en virvlande kärna. Volym segmentering indikeras av godtyckliga färgåtergivning att belysa virvlande kärnan. Skalstapeln: 200 nm. Siffran var nytryck från Jiang et al. 7 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Steg | Temp | Tid | Lösning | |||
| 1 | -140 ° C till-9 0 ° C | 30 min | Flytande kväve | |||
| 2 | -90 ° C | 96 Tim | FS cocktail | |||
| 3 | -90 ° C till-60 ° C | 6 tim (5 ° C/timme) | FS cocktail | |||
| 4 | -60 ° C | 12 tim | FS cocktail | |||
| 5 | -60 ° C till-25 ° C | 7 hr (5 ° C/timme) | FS cocktail | |||
| 6 | -25 ° C | 12 tim | FS cocktail | |||
| 7 | -25 ° C till 0 ° C | 5 hr (5 ° C/timme) | FS cocktail | |||
| 8 | 0 ° C | 1 hr x 3 gånger | Aceton | |||
| 9 | Rumstemp | Harts infiltration | ||||
Tabell 1: Freeze-substitution protokoll.
Discussion
I detta protokoll beskriver vi ett optimerat arbetsflöde för att tillämpa seriell-avsnitt elektron datortomografi för att studera 3D mitokondriell ultrastruktur Drosophila indirekta flyg muskler. Bevarandet av ultrastruktur i provet är den primära tekniska utmaningen för denna typ av analys. För att bäst bevara ultrastruktur två metodologiska ingick steg. Först, vävnad samplades av snittning med vibrerande blad mikrotomen för att upprätthålla den vävnad arkitekturen så mycket som möjligt. För det andra var ett HPF/FS protokoll optimerad för att bevara organell ultrastruktur under utarbetandet av inbäddade preparatsegment. Proverna frystes under högt tryck, som sänker fryspunkten för vatten och minskar bildandet av iskristaller som skada ultrastruktur1. Prover så tjock som 0,1 mm kan vara förglasad omedelbart, och sedan genomgå för att frysa substitution för att generera preparatsegment för EM analys. Förbättrad bevarandet av ultrastruktur av HPF/FS noterades, jämfört med kemisk fixering metoder. Med denna serie av steg för provberedning, förbättrades bevarandet av mitokondriell dubbla membran och cristae membran dramatiskt.
Erhålla seriell avsnitt av preparatet är det mest utmanande steget i metoden. Som elektronstrålen har begränsad penetration makt, tjockleken på avsnittet är begränsade till antingen 250 nm eller 500 nm med en TEM på 200 kV eller 300 kV, respektive. Eftersom tjockleken av en mitokondrie kan vara mer än 2 µm, krävs seriell avsnitt för att få full volym rekonstruktioner. Men är att återställa ett tillräckligt antal seriella sektioner att spänna en hela organell en teknisk utmaning. Trimma block ansiktet för att vara så platt som möjligt mellan baserna av trapezoiden kan tillåta ett slot-rutnät för att rymma fler sektioner och därmed täcka större volymer. Dessutom ökar använder en perfekt slinga för tunnslip andelen framgångsrika överföra seriell avsnitten till rutnätet.
Följetong-avsnitt elektron tomografi kan åstadkommas med EM core standardutrustning. Metoden har dock vissa oundvikliga begränsningar som uppstår från tekniska begränsningar. En är att materialet är oundvikligen förlorade mellan seriell avsnitt, lämnar luckor i Förenade återuppbyggnaden. Andra är saknas kil artefakt, som uppstår på grund av de begränsade lutningsvinklar som kan uppnås. Denna begränsning beror på preparathållaren inte kan stängas i ett helt varv utan att blockera elektronstrålen. Trots dessa begränsningar ger följetong-avsnitt elektron tomografi tillräcklig upplösning att avslöja mobilnät och organell ultrastruktur i 3D.
För mindre skala imaging är cryo-elektron datortomografi en ny teknik som kan användas för att få strukturen av makromolekylära komplex och församlingar i situ nm eller sub Ångström upplösning i kombination med sub-tomografiska återuppbyggnad3. I det här programmet är celler tunnas genom snittning eller fokuserad ion beam fräsning under flytande kväve. Tomograms samlas cryo-villkor där molekylära strukturer bevaras nära infödda staten utan kemiska fixeringen, uttorkning eller inbäddning. I andra änden av skalan, för att analysera stora vävnad volymer på bekostnad av upplösning, är seriell block-face skanning elektronmikroskopi en tilltalande modalitet även om det kräver en särskild rättsakt4.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Studierna utfördes i EM kärnan vid Institutet på cellnivå och organismnivå biologi och cryo-EM kärnan i Academia Sinica, Taipei, Taiwan. Arbetet stöds av Academia Sinica och mest.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | Tissue sectioning |
| high-pressure freezer | Leica | EM HPM100 | Specimen preparation |
| freeze-substitution device | Leica | EM AFS2 | Specimen preparation |
| ultramicrotome | Leica | EM UC7 | Ultra-thin sectioning |
| dual-axis tomography holder | Fischione | Model 2040 | tomography collection |
| transmission electron microscope | FEI | Tecnai F20 | tomography collection |
| CCD | Gatan | UltraScan 1000 | tomography collection |
| Leginon | NRAMM/AMI | tomography collection | |
| IMOD | Boulder Laboratory for 3-D Electron Microscopy of Cells | Tomography reconstruction | |
| Avizo 3D | FEI | Tomography analysis |
References
- Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure: theory and practice. J Electron Microsc Tech. 13 (3), 165-174 (1989).
- Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
- Rigort, A., et al. Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography. J Struct Biol. 172 (2), 169-179 (2010).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2 (11), e329 (2004).
- Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. Structural studies by electron tomography: from cells to molecules. Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).
- Soto, G. E., et al. Serial section electron tomography: a method for three-dimensional reconstruction of large structures. Neuroimage. 1 (3), 230-243 (1994).
- Jiang, Y. F., et al. Electron tomographic analysis reveals ultrastructural features of mitochondrial cristae architecture which reflect energetic state and aging. SciRep. 7, 45474 (2017).
- Cogliati, S., Enriquez, J. A., Scorrano, L. Mitochondrial Cristae: Where Beauty Meets Functionality. TrendsBiochemSci. 41 (3), 261-273 (2016).
- Friedman, J. R., Nunnari, J. Mitochondrial form and function. Nature. 505 (7483), 335-343 (2014).
- Suloway, C., et al. Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon. J Struct Biol. 167 (1), 11-18 (2009).
- Mastronarde, D. N., Held, S. R. Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD. J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).
