Buscando vías de controlador de adquirir resistencia a la terapia dirigida: sensibilidad restaurar por Gene Knock-down y generación Subclone resistente a los medicamentos

Resumen

Se trata de un protocolo de tiempo y costo efectiva en vitro investigando los mecanismos de resistencia adquirida a agentes terapéuticos dirigidos, que es una gran necesidad médica en el manejo del cáncer.

Resumen

Las últimas dos décadas han visto un cambio de fármacos citotóxicos a terapia dirigida en oncología médica. Aunque agentes terapéuticos dirigidos han demostrado eficacia clínica más impresionante y minimizado los efectos adversos de los tratamientos tradicionales, resistencia a las drogas se ha convertido en la principal limitación para sus beneficios. Han desarrollado varios modelos preclínicos/in vitro/in vivo de resistencia adquirida a agentes dirigidos en la práctica clínica principalmente mediante el uso de dos estrategias: i) genética manipulación para el modelado de genotipos de resistencia adquirida y ii) en vitro / vivo en selección de modelos resistentes. En el presente trabajo, proponemos un marco unificador para la investigación de los mecanismos subyacentes responsables de la resistencia adquirida a agentes terapéuticos dirigidos, a partir de la generación de subclones celulares resistente a los medicamentos a la descripción de procedimientos utilizados para restaurar la sensibilidad a los inhibidores de silenciamiento. Este tiempo y costo efectiva enfoque simple es ampliamente aplicable y podría ampliarse fácilmente para investigar mecanismos de resistencia a otras drogas terapéuticas específicas en diferentes tumor histotypes.

Introducción

Después de los cruciales descubrimientos en biología molecular y celular, se han desarrollado una serie de novela sintetizadas moléculas contra el cáncer para atacar selectivamente las vías de señalización oncogénicas en una amplia gama de tipos de tumores. En particular, compuestos de químicos sintéticos es decir, de dos categorías de agentes terapéuticos dirigidos con propiedades únicas en oncología, y anticuerpos monoclonales recombinantes, se sabe que han logrado éxitos clínicos y atención del cáncer dramáticamente alterada en las últimas décadas^1,2,3.

Protocolo

Nota: Este protocolo ha sido ajustada específicamente para el análisis de los mecanismos subyacentes de resistencia adquirida a trastuzumab de líneas de células de cáncer gástrico HER positivo. Todos los instrumentos de laboratorio necesitados son informados en la Tabla de materiales.

1. generación de Subclones resistentes a terapia específicas

Nota: Este es el más crítico y difícil de estandarizar el paso en el protocolo debido a que diferentes líneas celulares pueden exhibir diferentes sensibilidades para el inhibidor de la terapéutico dirigido independientemente de su concentración de tumor hist....

Resultados

Figura 1 describe el marco del procedimiento experimental. Tres cáncer gástrico-líneas celulares expresan un alto nivel de HER2 y sensible al trastuzumab (IC₅₀ < nivel del plasma del pico del gráfico izquierdo drogas, figura 2A,) fueron cultivadas en medio de cultivo que contiene el agente terapéutico específico. Una dosis 10 veces menor que la concentración máxima del plasma de trastuzumab (10 μg/mL) como dosis ini.......

Discusión

Personalizado y dirigido terapias han suscitado entusiasmo creciente, estas supuestas terapias 'inteligentes' enfrentan el mismo obstáculo importante como drogas de la quimioterapia tradicional, es decir, la adquisición rápida e impredecible de la farmacorresistencia. Para mejorar los resultados de la terapia dirigida, deben resolverse problemas de resistencia a los fármacos a través de una mejor comprensión de los mecanismos que las causan. Aquí, presentamos una metodología ampliamente accesible en vitro

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivo Trizol	Invitrogen	15596026	El reactivo TRIzol es un reactivo para aislar ARN total de alta calidad o aislar simultáneamente ARN, ADN y proteínas de una variedad de muestras biológicas KIT DE SÍNTESIS DE
ADN CD ISCRIPT	Bio-Rad	1708891	El kit de síntesis de ADNc iScript es un kit de síntesis de ADNc de primera cadena sensible y fácil de usar para el análisis de la expresión génica mediante qPCR en tiempo real.
Ensayo de expresión génica TaqMan	Life Technologies	4331182	Los ensayos de expresión génica TaqMan consisten en un par de cebadores de PCR sin marcar y una sonda TaqMan con una etiqueta de colorante FAM o VIC de Applied Biosystems en el extremo 5' y un aglutinante de ranura menor (MGB) y un extintor no fluorescente (NFQ) en el extremo 3'.
Reactivo de extracción de proteínas de mamíferos M-PER	Thermo Scientific	78501	El reactivo de extracción de proteínas de mamíferos M-PER de Thermo Scientific está diseñado para proporcionar una extracción de proteínas solubles totales altamente eficiente a partir de células de mamíferos cultivadas.
Cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa Halt (100X)	Thermo Scientific	78440	Thermo Scientific Cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa Halt (100X) ofrece la comodidad de una solución única con protección completa de muestras de proteínas para lisados de células y tejidos.
Kit de ensayo de proteínas Pierce BCA	Thermo Scientific	23225	El kit de ensayo de proteínas Pierce BCA de Thermo Scientific es un reactivo de ensayo de dos componentes, de alta precisión y compatible con detergentes que mide la concentración total de proteínas (A562 nm) en comparación con un estándar de proteínas.
4x Tampón de muestra Laemmli	Bio-Rad	1610747	Utilice 4x Tampón de muestra Laemmli para la preparación de muestras para SDS PAGE. Para la reducción de muestras, agregue un agente reductor como 2-mercaptoetanol al tampón antes de mezclarlo con la muestra.
4– 20% Mini-PROTEAN TGX Geles de proteínas prefabricadas	Bio-Rad	456-1094	Los geles TGX (Tris-Glycine eXtended) de larga duración tienen una formulación novedosa y se pueden utilizar tanto para separaciones de proteínas desnaturalizantes estándar como para electroforesis nativa.
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards	Bio-Rad	1610376	Precision Plus Protein Prestained Standards están disponibles en formatos Dual Color, All Blue, Kaleidoscope y Dual Xtra. Los cuatro tienen los mismos patrones de migración de gel, con 3 bandas de referencia de alta intensidad (25, 50 y 75 kD).
10x Tris/Glycine/SDS	Bio-Rad	1610732	10x Tris/glycine/SDS es un tampón premezclado para separar muestras de proteínas mediante SDS-PAGE.
Paquetes de transferencia Trans-Blot Turbo Mini PVDF	Bio-Rad	1704156	Trans-Blot Turbo Mini Paquetes de transferencia de PVDF para una transferencia rápida y eficiente de proteínas de mini geles utilizando el sistema de transferencia Trans-Blot Turbo. Cada paquete de transferencia sellado al vacío y listo para usar contiene dos pilas de depósito de iones saturados con tampón y una membrana de PVDF prehumedecida.
Conjugado Precision Protein StrepTactin-HRP	Bio-Rad	1610381	StrepTactin-Horseradish Peroxidasa (HRP) para la detección quimioluminiscente o colorimétrica de los patrones de proteínas no teñidos de Precision Plus Protein o los patrones de proteínas WesternC de Precision Plus Protein en Western blots.
Solución Immun-Star WesternC	Bio-Rad	5572	La solución Immun-Star WesternC, un método de detección de proteínas, detecta cantidades de proteínas en femtogramos.
universal de control negativo	de Invitrogen	12935300	Negative Control no tiene una similitud de secuencia significativa con las secuencias de genes de ratón, rata o humano. El control también se ha probado en cribados celulares y se ha demostrado que no tiene un efecto significativo sobre la proliferación, la viabilidad o la morfología de las células.
opti-MEM Glutamax Medium	Thermo Fisher Scientific	51985026	Opti-MEM Medium es un Medio Esencial Mínimo (MEM) mejorado que permite una reducción de la suplementación con suero fetal bovino en al menos un 50% sin cambios en la tasa de crecimiento o la morfología.
Silenciador Seleccione Pre-Diseñado & El siRNA	Ambion	validado 4390824	ARN de interferencia (ARNi) es la mejor manera de reducir eficazmente la expresión génica para estudiar la función de las proteínas en una amplia gama de tipos de células.
Reactivo de transfección Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen 13778075		Reactivo de transfección Lipofectamine RNAiMAX ofrece una solución avanzada y eficiente para la administración de siRNA. Ningún otro reactivo de transfección específico de siRNA proporciona una administración de siRNA tan fácil y eficiente en una amplia variedad de líneas celulares, incluidos los tipos de células comunes, las células madre y las células primarias, así como los tipos de células tradicionalmente difíciles de transfectar.
Ratón anti-IQGAP1	Invitrigen	33-8900	concentración de trabajo: 1:400 en solución de leche al 5%
anti-ratón de cabra IgG-HRP: sc-2005	Santa Cruz	sc-2005	concentración de trabajo: 1:10000 en solución de leche al 5%
PMSF	Sigma Aldrich	P 7626	este es un inhibidor de las serina proteasas y la acetilcolinesterasa
Termociclador para RT-PCR	MJ Research	MJ Research Termociclador PTC-200	permite homogeneidad de temperatura y una velocidad de rampa de hasta 3° C/seg. El protocolo también se puede realizar con otros termocicladores
Instrumento de RT-PCR en tiempo real	RT-PCR 7500	Applied Biosystems	Se trata de una plataforma de cinco colores que utiliza reactivos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basados en fluorescencia para proporcionar una cuantificación relativa utilizando el tipo de ensayo comparativo CT. El protocolo también se puede realizar con otros termocicladores
Espectrofotómetros de microvolumen	Thermo Scientific	Nanodrop	Proporciona una medición precisa y rápida de nucleidos ácidos utilizando poco volumen de muestra
Sistema de transferencia	Bio-Rad	Trans-Blot Sistema Turbo	Realiza una transferencia semiseca en pocos minutos Sistema de
adquisición de imágenes y documentación de gel	Imagen Bio-Rad	Chemidoc sistema	Es fácil de usar para la detección quimioluminiscente

El siRNA Sistema de