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Bioengineering

एक केशिका सरणी में एकाधिक न्यूक्लिक एसिड का दृश्य का पता लगाने

Published: November 15, 2017 doi: 10.3791/56597
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, *4, 4, 1,2,3, 4,5, 1,2,3, 6, 6, 4, 1,2,3
1Key Laboratory of Systems Biomedicine (Ministry of Education), Shanghai Center for Systems Biomedicine, Shanghai Jiao Tong University, 2State Key Laboratory of Oncogenes and Related Genes, 3School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University, 4Collaborative Innovation Center for Biosafety of GMOs, National Center for the Molecular Characterization of Genetically Modified Organisms, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, 5Key Laboratory of Crop Marker-Assisted Breeding of Huaian Municipality, Jiangsu Collaborative Innovation Center of Regional Modern Agriculture and Environmental Protection, 6Department of Biomedical Engineering, Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, School of Medicine, Tsinghua University
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक छोटे, तैयार करने के लिए उपयोग कैसेट है कि एक एकल, परीक्षण है कि आसान काम है में एकाधिक न्यूक्लिक एसिड के दृश्य का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता है का निर्माण । इस दृष्टिकोण में, एक केशिका सरणी मल्टीप्लेक्स और GMO लक्ष्यों का अत्यधिक कुशल पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

Abstract

बहु लक्ष्य, कम समय, और एक एकल में एकाधिक न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के लिए संसाधन सस्ती के तरीके, परीक्षण संचालित करने के लिए आसान रोग निदान, माइक्रोबियल निगरानी, आनुवंशिक रूप से संशोधित जीव (GMO) का पता लगाने में तत्काल जरूरत है, और फोरेंसिक विश्लेषण । हम पहले से कहा जाता है मंच शांत (सीapillary एकrray आधारित एलoop-मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन के लिए ultiplex एसिड की एमन्यूक्लिक दृश्य का पता लगाने) । इस के साथ साथ, हम इस मंच के लिए बेहतर निर्माण और प्रदर्शन प्रक्रियाओं का वर्णन । यहां, हम न्यूक्लिक एसिड के मल्टीप्लेक्स दृश्य का पता लगाने के लिए केशिका सरणी द्वारा इकट्ठे एक छोटे, तैयार उपयोग कैसेट लागू होते हैं । केशिका सरणी केशिकाओं में पाश मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन (लैंप) प्राइमर सेट फिक्सिंग से पहले एक hydrophobic और हाइड्रोफिलिक पैटर्न में पूर्व इलाज किया है । लोड हो रहा है अनुकूलक के विधानसभा के बाद, दीपक प्रतिक्रिया मिश्रण भरी हुई है और प्रत्येक केशिका में अलग, एक एकल pipetting कदम से केशिका शक्ति के कारण. दीपक प्रतिक्रियाओं केशिकाओं में समानांतर में प्रदर्शन कर रहे हैं । परिणाम नेत्रहीन एक हाथ से आयोजित यूवी टॉर्च के साथ रोशनी से बाहर पढ़ रहे हैं । इस मंच का प्रयोग, हम 8 अक्सर दिखने तत्वों और उच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता के साथ GMO नमूनों में जीन की निगरानी का प्रदर्शन । संक्षेप में, यहां वर्णित मंच के लिए एकाधिक न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने की सुविधा का इरादा है । हमारा मानना है कि यह व्यापक रूप से क्षेत्रों में लागू होगा जहां उच्च प्रवाह न्यूक्लिक एसिड विश्लेषण की आवश्यकता है ।

Introduction

कम लागत, जल्दी, और एकाधिक न्यूक्लिक एसिड का एक साथ पता लगाने के लिए प्रणालियों का उपयोग करने के लिए आसानी से खेतों की एक विस्तृत श्रृंखला में तत्काल जरूरत है, जैसे नैदानिक निदान1,2,3, GMO डिटेक्शन4, 5,6, माइक्रोबियल निगरानी7,8,9, फोरेंसिक विश्लेषण10,11, और विशेष रूप से बिंदु की देखभाल परीक्षण (POCTs), जहां संसाधन आम तौर पर12,13,14सीमित हैं ।

पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर), इसके व्युत्पन्न तरीकों रीयल-टाइम पीसीआर और मल्टीप्लेक्स पीसीआर सहित, इन क्षेत्रों में पता लगाने के लिए सबसे व्यापक रूप से लागू की गई तकनीक है । हालांकि, इन तरीकों से आम तौर पर केवल एक ही लक्ष्य का पता लगाने में एक परीक्षण15 और वे बिजली और परिष्कृत व्यावसायिक उपकरणों की आवश्यकता होती है ।

न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के लिए एक और आशाजनक प्रौद्योगिकी पाश-मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन (चिराग) है, जो पहले २०००16में वर्णित किया गया था । दीपक एक उच्च दक्षता डीएनए जांच पद्धति है । सैद्धांतिक रूप से, यह एक घंटे के भीतर amplicons की 109 प्रतियां के लिए 1 प्रति से बढ़ाना, सभी एक स्थिर तापमान पर प्रदर्शन कर सकते हैं, (यानी, के बीच ६०-६५ डिग्री सेल्सियस) । सफल प्रवर्धन अघुलनशील शोधकार्य pyrophosphate की एक बड़ी राशि का उत्पादन होगा और मैलापन में परिवर्तन के कारण17, जो सीधे नग्न आंखों से मनाया जा सकता है । एक रंग परिवर्तन भी धातु आयनों या ऐसे Calcein के रूप में फ्लोरोसेंट रंजक के अलावा द्वारा देखा जा सकता है18, न्यूक्लिक एसिड डाई19, और हाइड्रॉक्सिल naphthol ब्लू20। उच्च संवेदनशीलता और आपरेशन की सुविधा के फायदे के कारण, दीपक व्यापक रूप से न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने में लागू किया जा रहा है ।

वर्तमान में, मल्टीप्लेक्स लैंप परख के लिए मुख्य रूप से दो रणनीतियों रहे हैं । एक एक ट्यूब21,22,23में एकाधिक लैंप प्राइमर सेट होने से कई दीपक परख प्रदर्शन है । हालांकि, बहुलता और प्रवर्धन क्षमता आंतरिक हस्तक्षेप और अलग प्राइमर सेट के बीच प्रतिस्पर्धा द्वारा सीमित हो जाएगा । इसके अलावा, यह एक ही प्रतिक्रिया में अलग दीपक उत्पादों की पहचान करने के लिए मुश्किल हो सकता है । एक और रणनीति शारीरिक अलगाव पर आधारित है । अलग प्राइमर सेट व्यक्तिगत लघुकृत डिब्बों में अलग कर रहे थे, और कई दीपक प्रतिक्रियाओं तो एक साथ24,25प्रदर्शन कर रहे हैं । इन तरीकों, जो आम तौर पर microfluidic चिप्स के आधार पर कर रहे हैं, उच्च प्रवाह लैंप प्रतिक्रियाओं के लिए एक संभावित समाधान प्रदान करते हैं । हालांकि, चिप्स का निर्माण और प्राइमरी सेट्स की मल्टीप्लेक्स प्री-कोटिंग जटिल है, जिससे लागत में वृद्धि और reproducibility घट सकती है.

हाल ही में, कुछ अध्ययनों से microfluidic चिप्स के जटिल निर्माण बाईपास और कम लागत का पता लगाने के26,27प्राप्त किया है केशिकाओं में प्रदर्शन दीपक प्रतिक्रियाओं का वर्णन किया है । हालांकि, उच्च प्रवाह विश्लेषण करने के लिए संबंध है, इन केशिकाओं पीसीआर स्ट्रिप ट्यूबों के लघु संस्करणों के समान हैं, क्योंकि नमूनों और प्रतिक्रिया रिएजेंट (अलग प्राइमर सेट सहित) व्यक्तिगत रूप से तैयार किया जाना चाहिए और अलग करने के लिए दिया केशिकाओं के भीतर प्रतिक्रिया इकाइयों । समानांतर और मल्टीप्लेक्स विश्लेषण प्राप्त करने के लिए, अतिरिक्त उपकरण, उदाहरण के लिए एक मल्टीचैनल सिरिंज पंप, नमूनों या रिएजेंट के समानांतर लदान के लिए आवश्यक है.

न्यूक्लिक एसिड के मल्टीप्लेक्स का पता लगाने के लिए मौजूदा तरीकों से जुड़ी सीमाओं को दूर करने के लिए हमने एक लघुकृत मंच विकसित किया है जो दृश्य लैंप तकनीक को केशिका सरणी के साथ जोड़ती है । इस मंच बहु लक्ष्य है, आकार में कॉंपैक्ट, कम लागत, और28संचालित करने के लिए आसान है । इस के साथ साथ, हम कैसे केशिका सरणी बनाना और सरणी में दीपक प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन के विवरण का वर्णन । यहां वर्णित प्रोटोकॉल आनुवंशिक रूप से संशोधित जीव (GMO) एक मॉडल के रूप में पता लगाने का उपयोग मानकीकृत किया गया है । महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल भी अंय न्यूक्लिक एसिड लक्ष्यों का उच्च प्रवाह का पता लगाने में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > नोट: इस प्रोटोकॉल मानता है कि स्टेनलेस स्टील मोल्ड वांछित सूक्ष्म चैनलों और लोडिंग अनुकूलक के लिए आकार असर पहले से ही किया गया है (3 डी फ़ाइलें पूरक फ़ाइलों के रूप में प्रदान की जाती हैं 1 और 2 ). यह प्रोटोकॉल भी मान लिया गया है कि संयंत्र डीएनए अलगाव पहले से ही किया गया है ।

< p class = "jove_title" > 1. केशिका सरणी के निर्माण-आधारित तैयार करने के लिए उपयोग कैसेट्स

  1. स्टेनलेस स्टील मोल्ड साफ ।
    1. डिटर्जेंट, इथेनॉल द्वारा स्टेनलेस स्टील मोल्ड धोने, और पानी के लिए संभावित दूषित पदार्थों को दूर । मोल्ड को नाइट्रोजन के द्वारा सुखा लें.
  2. साफ केशिकाओं
    1. पहनें सुरक्षा चश्में, लैब & #160; वर्दी, और रासायनिक सुरक्षात्मक दस्ताने.
    2. एक चोंच में जगह केशिकाओं । कार्बनिक पदार्थ को दूर करने के लिए 5 मिनट के लिए 30 मिलीलीटर एसीटोन के साथ केशिकाओं को साफ करें, और उसके बाद केशिकाओं को पानी से धो लें ।
      चेतावनी: एक धुएं डाकू में एसीटोन संभाल ।
    3. डालो 10 मिलि के ज 2 ओ 2 को चोंच में & #160; और फिर उसमे 30 एमएल की एच 2 तो 4 में ज 2 हे 2 के साथ धीमी झटकों से overheating को रोकने के लिए । सुनिश्चित करें कि समाधान (पिरांहा समाधान) पूरी तरह से कम से 30 min.
      के लिए केशिकाओं को शामिल किया गया सावधानी: संभालते समय बरतें सावधानी पिरांहा समाधान (H 2 सू 4 /H 2 O 2 = 3:1, v/v) . यदि पिरांहा समाधान गिरा है, पानी की एक बड़ी राशि के साथ जल्दी से समाधान धोने और कागज तौलिए से सतह पोंछ ।
      नोट: केशिकाओं की पूरी तरह से सफाई दीपक प्रतिक्रिया की सफलता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण बिंदुओं में से एक है । यह केशिकाओं में बुलबुले को दूर करने के लिए सफाई की प्रक्रिया के दौरान एसिड सिलेंडर मिलाने के लिए आवश्यक है, और स्वच्छ समय भी जब आवश्यक बढ़ाया जा सकता है ।
    4. पानी की एक बड़ी मात्रा के साथ पिरांहा समाधान दूर धोने । 5 मिनट प्रत्येक के लिए इथेनॉल और पानी के साथ धो केशिकाओं । एक सुखाने ओवन में केशिकाओं सूखी ।
  3. नमुने polydimethylsiloxane (PDMS)
    1. वेट आउट PDMS बेस और इलाज रिएजेंट एक ५० एमएल ट्यूब में 1:1 के अनुपात के साथ । आम तौर पर, 5 जी को elastomer बेस के 5 ग्राम elastomer इलाज एजेंट के मिश्रण.
    2. मिश्रण एक गिलास रॉड के साथ के बारे में 5 मिनट के लिए अच्छी तरह से हलचल । de-बक.
      3. के लिए 30 मिनट के लिए एक वैक्यूम बेल जार में PDMS के साथ ट्यूब प्लेस
    3. स्टेनलेस स्टील मोल्ड के सिलेंडर में PDMS धीरे डालो । PDMS को एक सुखाने ओवन में 3 ज के लिए इलाज करने की अनुमति ६० & #176; ग
      नोट: PDMS डालने के समय हवा के बुलबुले से बचने के लिए सावधान रहें । PDMS डालने के बाद, यह PDMS.
      4. से बाहर बुलबुले के प्राकृतिक हटाने के लिए 5 मिनट के लिए खड़े होने की अनुमति
  4. मोल्ड को PDMS
    1. से निकाल कर PDMS के इलाज के बाद, मोल्ड को बेलन के साथ बाहर खींच कर निकाल दें । एक स्केलपेल के साथ मोल्ड के मार्जिन में कटौती करके सिलेंडर से PDMS निकालें ।
    2. धो PDMS तीन बार इथेनॉल और पानी के साथ । PDMS समर्थन को नाइट्रोजन के साथ सुखाएं ।
  5. को PDMS समर्थन की निचली सतह को hydrophobic मानते हैं. 1 एस के लिए एक सुपर hydrophobic कोट में PDMS समर्थन सोख यह कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सूखी ।
  6. PDMS समर्थन
      में केशिका डालें
    1. PDMS समर्थन के छिद्रों में जरुर 4 मिमी केशिकाओं डालें और PDMS समर्थन की शीर्ष सतह के बाहर केशिकाओं के ०.५ मिमी छोड़ दें । सुनिश्चित करें कि केशिकाओं के सिरों एक ही स्तर पर हैं ।
  7. की केशिकाओं की बाहरी सतह और PDMS समर्थन की शीर्ष सतह hydrophobic ।
    1. Add 15 & #181; एल सुपर-hydrophobic कोट PDMS समर्थन की शीर्ष सतह पर । ध्यान दें कि कोटिंग तुरंत सभी शीर्ष सतह (PDMS समर्थन और केशिकाओं के उजागर हिस्से की बाहरी सतहों के शीर्ष सतह सहित) केशिका बल से फैलता है ।
    2. एयर शुष्क सुपर-hydrophobic संशोधित केशिका सरणी.
  8. ठीक प्राइमर केशिका सरणी में
    1. प्राइमर समाधान तैयार करते हैं । वजन से ०.६५ g chitosan (आण्विक सूत्र: (C 6 H 11 NO 4 ) n ) और यह ५० मिलीलीटर में भंग पानी 4.5-5.5 के लिए पीएच को समायोजित करके एसिटिक एसिड के साथ १.३% की एक chitosan एकाग्रता प्राप्त करने के लिए । तालिका 1 के अनुसार प्राइमर अवयव मिश्रण तैयार करें । देखें अनुपूरक तालिका 1 के लिए प्राइमर
    2. जोड़ें १.६ & #181; एक पूर्व डिजाइन आदेश के अनुसार केशिका सरणी के एक इसी केशिका भरने के लिए प्राइमरों के एक सेट के मिश्रण के एल.
      नोट: शेष दो रिक्त केशिकाओं नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेट किए गए थे ।
    3. लंगर सरणी में एक पारदर्शी अच्छी तरह से एक मानक फ्लैट नीचे ९६-अच्छी तरह से प्लेट और शुष्क सरणी पर ६० & #176; C के लिए कम से 2 h.
< सारणी सीमा = "1" फो: साथ-साथ रखें । भीतर पृष्ठ = "1" के लिए: रखने के साथ अगले । के भीतर-पृष्ठ = "हमेशा" > दीपक प्राइमर मिक्स घटक फिक्सिंग (प्रारंभिक एकाग्रता) Volume (& #956; L) ddH 2 O १७.० Chitosan (१.३%) १.० FIP/बिप प्राइमरी (20 & #956; m) 2.0/2.0 LoopF/LoopB प्राइमर (20 & #956; M) < टीडी > 1.0/1.0 F3/B3 प्राइमरी (20 & #956; M) 0.5/0.5 कुल मात्रा २५.० < p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर रहो । भीतर-पृष्ठ = "1" > तालिका 1: लैंप के अवयव प्राइमर फिक्सिंग रिएजेंट्स. दीपक प्राइमर मिश्रण के घटक तालिका के बाएँ स्तंभ में सूचीबद्ध हैं, और प्रत्येक घटक की मात्रा दाएँ स्तंभ में सूचीबद्ध है.

< राजभाषा प्रारंभ = "9" >
  • के रूप में इस प्रकार के कैसेट को इकट्ठा करें । लंगर सरणी के शीर्ष पर एक लोडिंग अनुकूलक रखो । सुनिश्चित करें कि एडेप्टर के पकवान सिर्फ सभी दस केशिकाओं के उजागर भागों को शामिल किया गया है (देखें < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 ).
    • < p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर । भीतर-पृष्ठ = "1" > < img alt = "चित्रा 1" class = "xfigimg" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56597/56597fig1.jpg"/>
    चित्रा 1: कैसेट निर्माण और विधानसभा. ( एक ) स्टेनलेस मोल्ड और PDMS समर्थन करते हैं । मोल्ड 3 भागों के होते हैं: सिलेंडर, बांध बोर्ड, और स्तंभ प्लेट । ( बी ) PDMS समर्थन निर्माण और केशिका कैसेट के विधानसभा की योजनाबद्ध । पूरी प्रक्रिया में 5 कदम होते हैं: 1. PDMS डालना, 2. मोल्ड निकालना, 3. केशिका डालने और सतह कोटिंग, 4. प्राइमर फिक्सिंग और 5. कैसेट एंकरिंग की । 1. मोल्ड के सिलेंडर में PDMS डालो; 2. बांध बोर्ड बाहर पुश PDMS समर्थन से मोल्ड को दूर करने के लिए; 3. कोट PDMS समर्थन के नीचे की सतह और फिर PDMS समर्थन में केशिकाओं डालें, अंत में PDMS समर्थन और उजागर केशिकाओं की ऊपरी सतह कोट । मोटी नीली रेखा सुपर-hydrophobic कोट को इंगित करती है; 4. लोड प्राइमर व्यक्तिगत केशिकाओं में सेट; 5. एक एकल ९६-अच्छी तरह से थाली में केशिका सरणी लंगर और उस पर एक नमूना लोड करने वाले अनुकूलक स्थापित करें । विवरण प्रोटोकॉल चरण १.१-१.९ में वर्णन किया गया है । < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56597/56597fig1large.jpg" target = "blank" > इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

    < p class = "jove_title" > 2. केशिका सरणी में दीपक प्रतिक्रिया का प्रदर्शन

    1. रिएक्शन मिक्स
      1. दीपक रिएक्शन मिक्स को तैयार कर के अनुसार टी 2 .
      2. चुना क्रम के अनुसार मिश्रण करने के लिए रिएजेंट जोड़ने के लिए, के रूप में तालिका 2 में, और भंवर 5 calcein जोड़ने के बाद एस के लिए रिएक्शन मिश्रण । में धीरेट्यूब को वर्ट के बाद 20 बार Bst पोलीमरेज़ जोड़ा जाता है ।
    < तालिका बॉर्डर = "1" फो: साथ-साथ रखें । भीतर-पृष्ठ = "1" के लिए फो: रख-साथ-साथ अगला । भीतर-पृष्ठ = "हमेशा" > लैंप अवयव & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; & #160; (प्रारंभिक एकाग्रता) मात्रा (& #956; L) ddH 2 O ११.६ MgSO 4 (१०० mm) २.० dNTPs (25 मि.) 1.4 Betaine (5 मी.) ४.० बफर (10x) २.५ Calcein (१.२५ मि.) ०.५ MnCl 2 (25 मि.) ०.५ Bst < /em > पोलीमरेज़ (8 U/& #956; L) १.५ पादप डीएनए (10 एनजी/& #956; L) १.० कुल मात्रा २५.० < p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर । भीतर-पृष्ठ = "1" > तालिका 2: केशिका सरणी की प्रतिक्रिया प्रणाली-दीपक । केशिका सरणी लैंप घटकों की प्रतिक्रिया प्रणाली के घटकों को बाएँ स्तंभ में सूचीबद्ध हैं, और प्रत्येक घटक की मात्रा दाएँ स्तंभ में सूचीबद्ध है ।

    < राजभाषा प्रारंभ = "2" >
  • लोड रिएजेंट और सील कैसेट
    1. पिपेट 20 & #181; l दीपक रिएक्शन मिक्सचर विथ a स्टैंडर्ड १०० & #181; एल टिप. लोड हो रहा है अनुकूलक के प्रवेश में टिप डालने के लिए यह ताला । धीरे अनुकूलक के पकवान में प्रतिक्रिया मिश्रण सुई; प्रतिक्रिया मिश्रण जल्दी पकवान भर जाएगा और फिर केशिका बल के माध्यम से स्वचालित रूप से केशिकाओं लोड ।
    2. बंद टिप के साथ अनुकूलक को हटा दें और एक पीसीआर-संगत पारदर्शी सील फिल्म द्वारा अच्छी तरह से सील ।
      नोट: केवल हाइड्रोफिलिक डिश में रिएक्शन मिक्सचर को छूने वाली केशिकाओं को भरा जा सकता है । तो यह सुनिश्चित कर लें की सभी केशिकाओं के ऊपर की ओर एक ही ऊँचाई के हैं (< मज़बूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 ) देखें.
    • < p class = "jove_content" फो: साथ-साथ रखें । भीतर-पृष्ठ = "1" > < img alt = "figure 2" class = "xfigimg" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56597/56597fig2.jpg"/>
    चित्रा 2: लोड अनुकूलक का उपयोग कर नमूना लोड करने का आरेख. चित्र लोडिंग प्रक्रिया एक उदाहरण के रूप में नीले समाधान को रोजगार से पता चलता है । प्रवेश में टिप डालें और अनुकूलक में नमूना धीरे से सुई, और फिर बंद टिप के साथ अनुकूलक को हटा दें । < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56597/56597fig2large.jpg" target = "blank" > इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

    < राजभाषा प्रारंभ = "3" >
  • में एक मशीन में केशिका सरणी ६३ & #176; ग के लिए 1 ज.
    • < p class = "jove_title" > 3. परिणाम Readout और डेटा विश्लेषण

    1. प्रतिदीप्ति उत्सर्जन की छवियां मोल ।
      1. दृश्य प्रकाश फिल्टर करने के लिए एक छोटे हाथ से आयोजित यूवी एलईडी टॉर्च की शीर्ष सतह पर एक यूवी फिल्टर को ठीक करें ।
      2. असंबद्ध calcein को उत्तेजित करने के लिए यूवी टॉर्च के साथ प्रतिदीप्ति उत्सर्जन । या तो एक डिजिटल कैमरा या एक smartphone द्वारा केशिका सरणी के शीर्ष से छवियों पर कब्जा.
      3. जब एक छवि ले रही है, यह सुनिश्चित करें कि कैमरा केशिकाओं के क्षेत्र पर उच्च गुणवत्ता, स्पष्ट छवियों को पाने के लिए जितना संभव हो ज़ूम में है ।
    2. विश्लेषण परिणाम
      1. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा छवि खोलने के लिए और फिर चयन & #34; इमेज & #62; मोल्ड & #62; ग्रेस्केल & #62; यस & #34; र & #34; image & #62; मोल्ड & #62; 16bit & #62; यस & #34;. Select & #34; फाइल & #62; सेव के रूप में & #62; format & #62; TIFF & #34; छवि को 16-bit TIFF स्वरूप में कनवर्ट करने के लिए ।
      2. प्रतिदीप्ति तीव्रता का मान निकालें
        1. microarray विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें । 16-bit TIFF स्वरूप छवि को सॉफ़्टवेयर के इंटरफ़ेस में खींचें और तब & #34 के तरंग दैर्ध्य का चयन करें; ५३२ nm & #34; र क रंग & #34; हरित & #34; छवि प्रदर्शित करने के लिए.
        2. केशिकाओं से प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाने के लिए एक नया ब्लॉक बनाएं । Select & #34; tools & #62; New blocks & #34; और इनपुट कॉलम और पंक्तियों की संख्या के रूप में & #34; 1; 1 & #34; व & #34; 2; 5 & #34; म & #39; त ब्लाक & #39; व & #39; फीचर्स & #39; इंटरफेस अलग.
        3. दायां क्लिक करें और select & #34; फीचर्स & #34; मॉडल और फिर केशिकाओं के प्रतिदीप्ति क्षेत्र फिट करने के लिए स्थान और व्यास समायोजित । Select & #34; श्लेष & #34; प्रतिदीप्ति तीव्रता के मान को निकालने के लिए ।
        4. select & #34; फाइल & #62; सेटिंग्स सहेजें के रूप में & #34; ब्लॉक दस्तावेज़ों को सहेजने के लिए और & #34 का चयन करें; file & #62; परिणाम सहेजें & #34 के रूप में प्रतिदीप्ति तीव्रता परिणाम को बचाने के लिए; । दीपक सफलतापूर्वक केशिकाओं में प्रदर्शन किया है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए SNR की गणना ।
          नोट: केशिकाओं के संकेत धब्बे और शोर अनुपात के लिए संकेत के ग्रे मूल्यों की रिकॉर्डिंग द्वारा प्राप्त किए गए थे (SNRs) लक्ष्यों के अग्रभूमि संकेतों का मतलब मूल्यों के अनुपात के रूप में परिभाषित किया गया दो नकारात्मक के अग्रभूमि संकेतों का औसत मतलब मूल्यों नियंत्रण. सकारात्मक संकेतों के निर्धारण के लिए कटऑफ के रूप में निर्धारित किया गया था SNR & #62; 2.

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    Representative Results

    इस विधि में, यह नमूना लदान के दौरान विभिन्न केशिकाओं के बीच पार संक्रमण को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है । इस प्रयोजन के लिए, chitosan शुरू की गई थी, जो व्यक्तिगत केशिकाओं में प्राइमरों को बरकरार रख सकती है । परीक्षण करने के लिए कि यह काम किया है या नहीं, हम पूर्व तय ADH1 (मक्का के अंतर्जात संदर्भ जीन) प्राइमर के पैटर्न के साथ केशिका कैसेट में सेट "टी" और "यू", के रूप में चित्रा 3ए में सचित्र । उम्मीद के रूप में, केवल केशिकाओं शामिल प्राइमरी सेट सकारात्मक संकेतों ( चित्र बी) दिखा ।

    Figure 3
    चित्र 3: केशिका परिणाम के उदाहरण. (क) केशिका सरणी के लेआउट । हरे धब्बे आढ-1 प्राइमर सेट केशिकाओं में पूर्व निर्धारित कर रहे हैं कि संकेत मिलता है । (ख) दीपक के बाद दो केशिका arrays के फ्लोरोसेंट तस्वीरें । हरे रंग सकारात्मक दीपक प्रवर्धन प्रस्तुत किया । परीक्षा में नकल का प्रदर्शन किया गया । सफल प्रवर्धन केवल प्राइमर-फिक्स्ड केशिकाओं और रिक्त केशिकाओं के बीच संक्रमण के बिना में प्रस्तुत किया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    आगे GMO की निगरानी करने की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, हम सात अक्सर इस्तेमाल किया ट्रांसजेनिक तत्वों जो वाणिज्यिक GMO घटनाओं के ~ ७५% कवर (यानी, पी-CaMV35S, बार, cp4 epsps, पी FMV35S, पैट, टी-नग और nptII) (चित्रा 4, लेआउट) जो केशिकाओं संख्या 1-7 के अनुरूप है, और मक्का (ADH1) के लिए एक अंतर्जात संदर्भ जीन । इस विधि की विशिष्टता को दिखाने के लिए, तीन ग्राम घटनाओं (MON863, MON89034, और ५९१२२) का चयन किया गया था और शांत करने के लिए लागू होता है । परिणामों का विश्लेषण करने के लिए, प्रतिदीप्ति छवियों कैमरे द्वारा लिया गया था और प्रोटोकॉल चरणों में वर्णित के रूप में विश्लेषण । सभी परीक्षणों के लिए अपेक्षित परिणाम प्राप्त किए गए (आरेख 4) । उदाहरण के लिए, जीएम मक्का MON863 के लिए, केशिकाओं 1, 6, 7 और 8 के लिए सकारात्मक संकेत प्राप्त किए गए थे, जो लक्ष्य के अनुरूप P-CaMV35S, T-नग, nptII, और अंतर्जात संदर्भ जीन ADH1, क्रमशः ।

    Figure 4
    चित्रा 4: जीएमओ निगरानी के लिए विशिष्टता । विभिन्न डीएनए नमूनों का पता लगाने, अर्थात, MON863, MON89034, ५९१२२, उपरोक्त सभी तीन ग्राम घटनाओं (GMO मिश्रण), गैर-जीएम मक्का और शुद्ध पानी (कोई टेम्पलेट नियंत्रण, एनटीसी) का मिश्रण. 1-8 : पी-CaMV35S, बार, cp4 epsps, पी-FMV35S, पैट, टी-नग, nptII, और आढ-1, व्यक्तिगत रूप से दीपक प्राइमरी सेट के साथ केशिकाएं पूर्व निर्धारित । 9-10, दो नहीं, प्राइमर नियंत्रण । परीक्षा में नकल का प्रदर्शन किया गया और हमने पाया कि सभी परिणाम अपेक्षाओं के अनुरूप थे. डेटा विश्लेषण के लिए अनुपूरक तालिका 2 देखें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

    एक असली दुनिया आवेदन में हमारे विधि के प्रदर्शन का परीक्षण करने के लिए, दो व्यावहारिक मक्का नमूनों शांत द्वारा विश्लेषण के लिए चयन किया गया । तो परिणाम है कि वास्तविक समय पीसीआर की तुलना में थे और परिणाम के अनुरूप थे (चित्रा 5, अनुपूरक तालिका 2)

    Figure 5
    चित्रा 5: दो मक्का नमूनों के परीक्षण के परिणाम । 1-8: केशिकाओं पूर्व फिक्स्ड लैंप प्राइमर सेट के साथ पी-CaMV35S, बार, cp4 epsps, पी-FMV35S, पैट, टी नग, nptII, और आढ-1, व्यक्तिगत रूप से । 9-10, दो नहीं, प्राइमर नियंत्रण । परीक्षण नकल में प्रदर्शन किया गया था और फिर परिणाम है कि वास्तविक समय पीसीआर की तुलना में थे और परिणाम के अनुरूप थे । तुलना परिणामों के लिए अनुपूरक तालिका 3 देखें । डेटा विश्लेषण के लिए अनुपूरक तालिका 2 देखें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

    अनुपूरक तालिका 1: दीपक प्राइमरी दृश्यों की सूची । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

    अनुपूरक तालिका 2: लैंप सरणी प्रयोगों के डेटा विश्लेषण. तालिका में हरा रंग कोडेड कक्ष सकारात्मक परिणाम का संकेत देते हैं । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

    अनुपूरक तालिका 3: रीयल-टाइम पीसीआर परिणाम रिपोर्टिंग फ़ॉर्म. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

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    Discussion

    शांत मंच यहां का प्रदर्शन किया, जो एक केशिका सरणी के साथ चिराग प्रौद्योगिकी को जोड़ती है, एक एकल, अत्यधिक प्रभावी और परीक्षण संचालित करने के लिए आसान में एकाधिक GMO से संबंधित जीन लक्ष्यों का एक साथ पता लगाने में सक्षम बनाता है ।

    कैसेट में मल्टीप्लेक्स लैंप प्रतिक्रियाओं को सफलतापूर्वक निष्पादित करने के लिए तीन महत्वपूर्ण बिंदुओं पर गौर करने की आवश्यकता है. सबसे पहले, केशिकाओं के ऊपरी हिस्से के लिए एक ही ऊंचाई प्राप्त करने और केशिका सरणी के हाइड्रोफिलिक और hydrophobic पैटर्न सभी केशिकाओं में एक साथ लदान के लिए महत्वपूर्ण हैं । केशिकाओं एक थाली के द्वारा गठबंधन किया जाना चाहिए PDMS समर्थन में डालने के बाद उन सभी को यह सुनिश्चित करने के लिए लोड हो रहा है अनुकूलक की डिश में भरी हुई प्रतिक्रिया मिश्रण को छू सकते हैं । जब सुपर hydrophobic कोट के साथ केशिका सरणी के इलाज, कोट केशिकाओं की भीतरी सतह में भिगोने के लिए अनुमति नहीं है । सिर्फ शीर्ष PDMS समर्थन की ऊपरी सतह पर कोट लदान द्वारा केशिकाओं की बाहरी सतह का इलाज, कोटिंग केशिकाओं के ऊपरी भागों की बाहरी सतहों में फैल करने के लिए अनुमति देता है । यह कभी-कभार होता है कि सभी केशिकाओं के साथ नहीं भरा जाता है, यह एक विशिष्ट केशिका में सीधे एजेंट लोड करने के लिए विवेकपूर्ण हो सकता है ।

    दूसरा, दीपक रिएजेंट की तैयारी से सावधान रहें । पूरी प्रक्रिया धीरे और जल्दी से बर्फ पर किया जाना चाहिए, दीपक के अपेक्षाकृत कम प्रतिक्रिया तापमान और Bst पोलीमरेज़ की कमजोरी के कारण । यह दीपक मिश्रण के साथ प्रतिक्रिया ट्यूब मिलाने के बजाय हिंसक Bst पोलीमरेज़ जोड़ने के बाद धीरे ट्यूब भंवर की सलाह दी जाती है । कोई अनुपयुक्त हैंडलिंग प्रतिक्रिया की विफलता का कारण हो सकता है । इस प्रयोग में, ADH1 (मक्का के अंतर्जात संदर्भ जीन) सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेट किया गया है और प्राइमरों के बिना दो केशिकाओं रिक्त नियंत्रण के रूप में सेट कर रहे हैं । तो, अगर दीपक मिश्रण सही ढंग से संचालित है, सकारात्मक नियंत्रण हरी दिखाने के लिए और रिक्त नियंत्रण होगा अपरिवर्तित परीक्षण के बाद किया जाता है ।

    तीसरे, दीपक प्रतिक्रिया की उच्च दक्षता के कारण, झूठी सकारात्मक या स् संदूषण हो सकता है अगर वहां पर्यावरण में डीएनए amplicon का पता लगाने की राशि है । इसलिए, हमेशा ध्यान में रखना है कि पूर्व प्रतिक्रिया और बाद की प्रतिक्रिया के संचालन प्रक्रियाओं सख्ती से अलग क्षेत्रों में अलग किया जाना चाहिए और लैंप उत्पादों कसकर बंद किया जाना चाहिए और विश्लेषण के बाद छोड़ दिया । इसके अलावा, एक खाली नियंत्रण दीपक के एक पर्याप्त प्रदर्शन का संकेत के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए ।

    आंतरिक रूप से, शांत एक सार्वभौमिक बहु लक्ष्य अच्छा लचीलापन और विस्तार के साथ न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने की विधि है । दीपक केशिकाओं में किया प्रतिक्रियाओं को आसानी से इज़ोटेर्माल प्रवर्धन तरीकों के अंय प्रकार के द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है, जैसे रोलिंग सर्कल प्रवर्धन (आरसीए)29, और recombinase पोलीमरेज़ प्रवर्धन (RPA)30। इसे अन्य पहचान फ़ील्ड्स में भी लागू किया जा सकता है, जैसे कि रोगज़नक़ डिटेक्शन27 और रोग निदान31.

    इस विधि के वर्तमान रूप में, हालांकि प्राइमर सेट पूर्व chitosan के साथ तय कर रहे हैं, दीपक मिश्रण तैयारी की प्रक्रिया अभी भी जरूरत है जब परीक्षण किया है, जो विधि की सादगी कम करती है । इस को संबोधित करने के लिए हम दीपक के सभी रिएजेंटों को केशिकाओं में प्रीलोड की कोशिश करेंगे और उसके बाद पिपेट के नमूने को कैसेट में लगाएंगे । हमारी विधि के लिए एक और सीमा न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण की कमी हो सकती है, लेकिन अब हम एक मोबाइल आधारित मशीन है जो न्यूक्लिक एसिड, स्वत: छवि लेने के निष्कर्षण गठबंधन है, और डेटा विश्लेषण के लिए एक असली नमूना प्राप्त करने और परिणाम में विकसित होता है-बाहर विधि.

    संक्षेप में, हम एक केशिका सरणी के साथ मल्टीप्लेक्स लैंप एकीकृत द्वारा शांत मंच विकसित किया है । एक सामांय न्यूक्लिक एसिड जांच विधि के रूप में, शांत भी अंय न्यूक्लिक एसिड विश्लेषण अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में संभावित हो सकता है ।

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    Disclosures

    लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

    Acknowledgments

    इस अध्ययन के भाग में राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया चीन अनुदान (३१३७०८१३, ३१४७६७०, ३१६७०८३१ और ३१६००६७२,), राष्ट्रीय ट्रांसजेनिक संयंत्र विशेष कोष (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), नई सदी में उत्कृष्ट प्रतिभाओं के लिए कार्यक्रम विश्वविद्यालय, चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास परियोजना (2016YFA0500601) और चीन Postdoctoral विज्ञान फाउंडेशन (2016M591667) ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    UltraEverDry(super-hydrophobic coat) UltraTech 4001 supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD.
    PDMS Dow Corning 8332557
    Bst polymerase New England BioLabs M0275L
    betain Sigma-Aldrich B0300-1VL
    calcein Sigma-Aldrich C0875-5G
    MnCl2 Sigma-Aldrich MKBP0495V
    MgSO4 New England BioLabs B1003S
    dNTPs Shanghai Sangon B804BA0022
    chitosan Shanghai Sangon LJ0805S309J
    Photoshop 7.0 software Adobe Systems Inc., CA, USA Image analysis
    GenePix Pro 6.1 Molecular Devices, CA, USA microarray analysis software
    AutoCAD Adobe Systems Inc. 3D construction software
    UV filter (ZWB2) YXSensing supplier : taobao

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    References

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