Microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1 para analizar la formación y la reparación de roturas de doble cadena de DNA

Resumen

Este manuscrito ofrece un protocolo para el análisis de roturas de doble cadena de DNA por microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1.

Resumen

Roturas de DNA doble cadena (DSB) son graves lesiones de ADN. Análisis de la formación y reparación de DSB es relevante en un amplio espectro de áreas de investigación incluyendo la integridad del genoma, genotoxicidad, Radiobiología, envejecimiento, cáncer y desarrollo de medicamentos. En respuesta a OSD, la histona H2AX es fosforilada en serina 139 en una región de varios pares de megabase formando discretos focos nucleares detectables por microscopia de la inmunofluorescencia. Además, 53BP1 (proteína 1 de Unión p53) es otra proteína sensible al OSD importante promover la reparación de DSB por nonhomologous end-joining evitando la recombinación homóloga. Según las funciones específicas de γH2AX y 53BP1, el análisis combinado de γH2AX y 53BP1 por microscopia de la inmunofluorescencia puede ser un enfoque razonable para un análisis detallado del OSD. Este manuscrito ofrece un protocolo paso a paso con notas metódicas para la realización de la técnica. Específicamente, se demuestra la influencia del ciclo celular en patrones de focos γH2AX en fibroblastos normales de la línea celular NHDF. Además, el valor de los focos de γH2AX como un biomarcador es representado en los linfocitos de rayos x irradiada de un individuo sano. Finalmente, se investiga inestabilidad genética en las células CD34 + de un paciente con leucemia mieloide aguda por microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1.

Introducción

DNA se daña continuamente por endógeno (p. ej., estrés de replicación, especies reactivas de oxígeno, la inestabilidad intrínseca del ADN) y exógenos (por ejemplo, los radicales químicos, irradiación) fuentes (figura 1)^{1,2 ,3,4}. Entre los daños en el ADN, roturas de DNA doble cadena (DSB) son particularmente graves lesiones y pueden inducir la muerte celular o carcinogénesis. Cerca de 50 OSD puede surgir por célula y ciclo celular⁵. En células de mamífero, recombinación....

Protocolo

todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el II Comité de ética de la Mannheim facultad médica de la Universidad de Heidelberg. Escrito el consentimiento informado fue obtenido de todos los individuos.

1. preparación de materiales

1. solución anticoagulante: Prepare una solución anticoagulante de 200 U.I. heparina / mL en cloruro de sodio 0.9%. Llenar cada uno de los tubos de colección (dibujar volumen 9 mL) con 2 mL de la solución anticoagulante antes de retiro de las muestras de sangre o médula ósea.
2. Solución de lisis de glóbulos rojos: preparar el 10 x solución de lisis d....

Resultados

Análisis de los focos de γH2AX en las células es más precisa en la fase G0/G1 y el G2 fase cuando γH2AX focos aparecen como puntos fluorescentes distintas (figura 5A). En contraste, análisis de focos de γH2AX en las células durante la fase S se complica con puntos dispersos γH2AX pan-nuclear causados por el proceso de replicación (figura 5B).

Fijación de las células fue.......

Discusión

Microscopia de la inmunofluorescencia de γH2AX y 53BP1 es un método útil para el análisis de la formación y reparación de DSB en un amplio espectro de áreas de investigación. Los parámetros críticos que influyen en el resultado de los experimentos son la fase del ciclo celular, los agentes utilizados para la fijación y permeabilización de las células, la elección de los anticuerpos y el hardware y el software del microscopio de fluorescencia.

La influencia del ciclo celular en patrones de foco.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medio RPMI	Sigma-Aldrich	R0883	Medio para cultivo celular
Heparina sódica	ratiopharm	PZN 3029843	Heparina 5.000 U.I. / mL
Solución de cloruro de sodio 0,9%	B. Braun	PZN 1957154	Componente de la solución madre anticoagulante
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare	17-5442-02	Medio para el aislamiento de células mononucleares
Solución de tripsina 10X	Sigma-Aldrich	59427C	Enzima para la disociación de fibroblastos en cultivo celular
CD34 MicroBead Kit	Miltenyi Biotec	130-046-702	Aislamiento de células progenitoras mieloides CD34+
Portaobjetos de microscopio de diagnóstico	Thermo Scientific	ER-203B-CE24	Portaobjetos de microscopio
Megafuge 1.0 R	Heraeus	75003060	Centrífuga de sobremesa
			Cytospin
Tapa	Heraeus	76003422	Tapa para trabajar sin microtubos
Contenedor Cyto	Heraeus 75003416		Contenedor Cyto con 2 orificios cónicos
Portaclips	Heraeus		75003414 Portador para sujetar un contenedor de citocitos y una corredera
Inserto de soporte	Heraeus	75003417	Inserto de soporte para sujetando un soporte
de clip Triton X-100 (Octoxinol 9)	Thermo Scientific	85112	Detergente para la permeabilización de membranas celulares
Solución de hidróxido de potasio 1M	Merck Millipore	109107	Necesario para preparar la solución de paraformaldehído
Paraformaldehído	Sigma-Aldrich	P6148	Agente de fijación
Salina tamponada con fosfato	Sigma-Aldrich	D8537	Solución salina equilibrada
Chemiblocker	Merck Millipore	2170	Agente bloqueante
Monoclonal de ratón anti-& gamma; Anticuerpo H2AX (JBW301)	Merck Millipore	05-636	Anticuerpo primario para la detección de γ H2AX
Anticuerpo policlonal anti-53BP1 de conejo (NB100-304)	Novus Biologicals	NB100-304	Anticuerpo primario para la detección de 53BP1
Alexa Fluor 488-conjugado anti-ratón de cabra anti-ratón	Invitrogen	A-11001	Anticuerpo secundario
Alexa Fluor 555-conjugado anti-conejo anticuerpo	Invitrogen	A-31572	Anticuerpo secundario
Vectashield medio de montaje	Vector Laboratories	H-1200	Contiene DAPI para la tinción de ADN
Axio Scope.A1	Zeiss		490035 Microscopio de fluorescencia
Cool Cube 1 Cámara CCD	Metasystems	H-0310-010-MS	Sistema de cámara para grabación digital
Software Isis	Metasystems	Software de	microscopio

Dispositivo No aplicable