Este protocolo presenta un en vitro en vivo-proyección de imagen de fagocitosis ensayo para medir la capacidad fagocitaria de los astrocitos. Microglia y astrocitos de rata purificados se utilizan junto con sinaptosomas conjugado con indicador de pH. Este método puede detectar cinética en tiempo real de la inmersión y la degradación y proporciona una plataforma de proyección adecuado para identificar factores de modulación de fagocitosis de los astrositos.
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Artículo de método
Un pH de novela In Vitro Live-proyección de imagen de ensayo de astrositos mediado fagocitosis usando sinaptosomas conjugado con indicador
En este artículo
Resumen
Resumen
Los astrocitos son las células principales en el cerebro y contacta directamente con las sinapsis y los vasos sanguíneos. Aunque las células microgliales se han considerado las principales células inmunes y solamente fagocitos en el cerebro, estudios recientes han demostrado que los astrocitos también participan en diversos procesos fagocíticos, tales como eliminación de sinapsis desarrollo y despacho de placas de beta amiloide en la enfermedad de Alzheimer (AD). A pesar de estos resultados, la eficiencia de la inmersión de astrositos y degradación de sus objetivos es confusos en comparación con la de microglia. Esta falta de información se debe principalmente a la falta de un sistema de ensayo en el que la cinética de fagocitosis mediada por astrositos y microglía son fácilmente comparables. Para lograr este objetivo, hemos desarrollado un a largo plazo vivir-proyección de imagen en vitro ensayo fagocitosis para evaluar la capacidad fagocitaria de purificada astrocitos y microglía. En este ensayo, detección en tiempo real de la inmersión y la degradación es posible usando sinaptosomas conjugado con indicador de pH, que emiten fluorescencia roja brillante en orgánulos ácidos, tales como lisosomas. Nuestro ensayo novela proporciona una detección simple y eficaz de la fagocitosis a través de imágenes en vivo. Además, este ensayo de fagocitosis en vitro puede utilizarse como una plataforma de proyección para identificar productos químicos y compuestos que pueden potenciar o inhibir la capacidad fagocitaria de los astrocitos. Como mal funcionamiento de la poda sináptica y acumulación de la proteína patógena han demostrado como causantes de trastornos mentales y enfermedades neurodegenerativas, productos químicos y compuestos que modulan la capacidad fagocitaria de las células gliales deberán ser útiles en el tratamiento de varios trastornos neurológicos.
Introducción
Células gliales, que se refieren a las células no excitables en el cerebro, son el tipo de células principales en el sistema nervioso central (SNC). Anteriormente, las células glial fueron miradas como meras células de soporte que principalmente desempeñan un papel pasivo en el mantenimiento de propiedades sinápticas basals y la supervivencia neuronal. Sin embargo, nuevas pruebas ha revelado que las células gliales desempeñan un papel más activo en diversos aspectos de la neurobiología, como mantenimiento de la homeostasis cerebral, mediar la sinapsis formación1,2,3 y sinapsi....
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Protocolo
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el Korea Advanced Institute of Science y tecnología institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC), KA2016-08.
1. synaptosome purificación
Nota: Estos procedimientos son adaptados de un trabajo previamente publicado19 con varias modificaciones para mejorar el rendimiento de sinaptosomas purificadas (figura 1).
- Preparar medios de gradiente de densidad discontinuo.
- Introducir en el hielo: 3%, 10% y 23% densidad gradiente soluciones tampón de gradiente (llevar a 250 mL de agua con 109,54....
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Resultados
En este en vitro fagocitosis análisis con imágenes en vivo a largo plazo, utilizamos sinaptosomas de homogenados de cerebro de ratón adulto, que se separaron de la solución gradiente entre solución gradiente 23% y 10% degradado por ultracentrifugación ( Figura 3). Después de la preparación, sinaptosomas expusieron PS en su membrana externa (figura 4), sugiriendo que perdieron su función y pueden ser reconocidos por recep.......
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Discusión
En este artículo se presentan métodos para un largo plazo imágenes viven en vitro fagocitosis ensayo usando células gliales purificadas y sinaptosomas conjugado con indicador de pH. Se muestra que en comparación con la microglia, astrocitos poseen diferente capacidad de inmersión y degradación durante la fagocitosis de sinaptosomas. Además, nuestros datos sugieren que factores secretados de astrositos, que contienen moléculas puente como GAS6, proteínas y MEGE8, son esenciales para la fagocitosis depende PS efic.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Jung Yeon-Joo por su apoyo experimental durante la purificación de synaptosome y Jungjoo Corea Parque imágenes de sinaptosomas con exposición de PS. Además, agradecemos a todos los miembros del laboratorio de Chung de discusión útil. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de investigación de concesión de Corea (NRF) financiado por el gobierno coreano (MSIP) (NRF-2016M3C7A1905391 y NRF-2016R1C1B3006969) (W. S. C).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| purificación de sinaptosomas | |||
| Percoll | GE ciencias de la vida para el cuidado de la salud | 17-0891-01 | |
| Kit de ensayo de proteínas Bradford de inicio rápido 2 | BIO-RAD | 5000202 | |
| indicador de pH fuerte | |||
| dimetilsulfóxido (DMSO) | LPS | ||
| Sondas de | de éster de succinimidilo rojo pHrodo | P36600 | |
| Immunopanning | |||
| 10X Earle' s solución salina equilibrada (EBSS) | Sigma | E7510 | |
| Albúmina sérica bovina | Bovogen | BSA025 | |
| Desoxirebonucleasa 1 (DNasa) | Worthington | Is002007 | |
| (DMEM) | Gibco | 11960-044 | |
| (dPBS) | Welgene | LB001-02 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Griffonia Simplicifolia Lectina (BSL-1) | Vector Labs | L-1100 | |
| Cabra anti-ratón IgG+IgM(H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-044 | |
| Cabra anti-ratón IgM (μ-cadena) | Jackson ImmunoResearch | 115-005-020 | |
| Factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina | Sigma | E4643 | |
| Anticuerpo HepaCAM humano | R& Sistemas D | MAB4108 | |
| Anticuerpo monoclonal integrina beta 5 (KN52) | eBioscience | 14-0497-82 | |
| L-cisteína | Sigma | C7880 | |
| L-glutamato | Gibco | 25030-081 | |
| N-acetil-L-citeína (NAC) | Sigma | A8199 | |
| Medios neurobasales | Gibco | 21103-049 | |
| O4 hibridoma, sobrenadante(ratón IgM) | Bansal et al.23 | ||
| Papain | Worthington | Is003126 | |
| Penicilina/estreptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| Pluristrainer 20 μ m | PluriSelect | 43-50020-03 | |
| Poly-D-lisina | Sigma | P6407 | |
| Progesterona | Sigma | P8783 | |
| Picilorhidrato de putrescina | Sigma | P5780 | |
| Anti-ratón de rata purificado CD45 | BD Pharmingen | 550539 | |
| Anti-rata de ratón purificada CD45 | BD Pharmingen | 554875 | |
| Piruvato de sodio | Gibco | 11360-070 | |
| Selenito de sodio | Sigma | S5261 | |
| Transferrina | Sigma | T1147 | |
| Tripsina | Sigma | T9935 | |
| Inhibidor de tripsina | Worthington | LS003086 | |
| Tubo ultra claro (Tubo, pared delgada, ultra transparente) | Beckman Coulter | 344059 | |
| Collect Dispositivos centrífugos IP-ACM | |||
| Macrosep Advance con membrana Omega (10k) | PALL | MAP010C37 | |
| Dispositivos centrífugos Macrosep Advance con membrana Omega (30k) | PALL | MAP030C37 | |
| Ensayo de imagen en vivo de fagocitosis | |||
| Juli fuerte | Complementos de NanoEntek | ||
| Time Series Analyzer V3 | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html |
Referencias
- Singh, S. K., et al. Astrocytes Assemble Thalamocortical Synapses by Bridging NRX1alpha and NL1 via Hevin. Cell. 164 (1-2), 183-196 (2016).
- Allen, N. J., et al. Astrocyte glypicans 4 and 6 promote formation of excitatory synapses via Gl....
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Reimpresiones y permisos
