Artículo de método

Acondicionamiento previo de las vías respiratorias de los ratones con bleomicina aumenta la eficacia del pulmón Orthotopic Engraftment de la célula de cáncer

DOI:

10.3791/56650

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28 de junio de 2018

 ,  , 
1Department of Pathology, Yale University School of Medicine, 2Department of Medical Oncology, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se describe un método para mejorar considerablemente orthotopic engraftment de células de cáncer de pulmón en los pulmones murinos por acondicionamiento previo de las vías respiratorias con lesiones. Este enfoque también puede aplicarse para estudiar las interacciones estromales dentro del microambiente de la pulmonar, diseminación metastásica, comorbilidades de cáncer de pulmón, y generar más eficientemente paciente derivados de xenoinjertos.

Resumen

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Cáncer de pulmón es una enfermedad refractaria mortal tratamiento biológico heterogéneo. Para entender y tratar con eficacia el espectro clínico completo de tumores malignos torácicos, se necesitan modelos animales adicionales que pueden recapitular fases y subtipos de cáncer de pulmón humanas diversas. Aloinjerto o xenoinjerto modelos son versátiles y permiten la cuantificación de capacidad tumorígena en vivo, usando las células malignas de origen murino o humano. Sin embargo, se han realizado métodos previamente descritos del engraftment de la célula de pulmón cáncer en sitios no-fisiológicos, tales como el flanco de los ratones, debido a la ineficiencia del trasplante orthotopic de células en los pulmones. En este estudio, se describe un método para mejorar el acondicionamiento previo de las vías respiratorias de los ratones con la bleomicina de agente induce fibrosis orthotopic engraftment de la célula de cáncer de pulmón. Como un experimento de prueba de concepto, se aplicó este enfoque para engraft las células del tumor del subtipo de adenocarcinoma de pulmón, obtenida de fuentes humanas, o de ratón en varias cepas de ratones. Demostramos que hiriendo a las vías respiratorias con bleomicina antes de la inyección de células de tumor aumenta el engraftment de células tumorales de 0-17% 71-100%. Este método había mejorado significativamente, incidencia de tumor de pulmón y posterior consecuencia utilizando cepas de ratón y diferentes modelos. Además, las células de cáncer de pulmón engrafted difusión desde los pulmones a órganos distantes pertinentes. Por lo tanto, proporcionamos un protocolo que puede utilizarse para establecer y mantener nuevos modelos ortotópico de cáncer de pulmón con limitación de la cantidad de células o muestra biológica y evaluar cuantitativamente la capacidad tumorigénica de las células de cáncer de pulmón en configuración fisiológico correspondiente .

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cáncer de pulmón es la principal causa del cáncer relacionadas con las muertes en todo el mundo1. Pacientes con cáncer de pulmón eventualmente sucumban de metástasis a órganos distantes, en particular para el sistema nervioso central, hígado, glándulas suprarrenales y huesos2,3,4. Tumores malignos torácicos han sido tradicionalmente clasificadas como cáncer de pulmón de células pequeñas (CPCP) o de células no pequeñas lung cancer (NSCLC)5. NSCLC es el más frecuentemente diagnosticado malignidad y puede subdividirse en diferentes subtipos histológicos, como el adenocarcinoma de pulmón (LUAD) y pulmón carcinoma de células escamosas (LUSC)6. Análisis genómico del cáncer de pulmón primario humano resecado ha revelado que los tumores dentro de un determinado histotype también pueden expresar diversas perturbaciones moleculares, contribuyendo a su evolución clínica divergente y confusión paciente pronóstico aún más. La notable heterogeneidad del cáncer de pulmón representa un desafío significativo al diseño racional, pruebas preclínicas y aplicación de estrategias terapéuticas eficaces. Por lo tanto, hay que ampliar el repertorio de modelos de cáncer de pulmón experimental manejable para estudiar los orígenes celulares diversos subtipos moleculares y etapas de esta enfermedad.

Diversos enfoques usando los modelos animales han sido empleados para el estudio de pulmón cáncer en vivo, cada uno con sus ventajas y desventajas dependiendo de las preguntas biológicas de interés. Modelos de ratón modificados genéticamente (GEMMs) pueden dirigirse a alteraciones genéticas específicas en un tipo de célula progenitora dado, resultante en tumores que progresan en un anfitrión inmunocompetente7. Aunque extremadamente potente y clínicamente relevantes, la morbosidad de tumor latencia, variabilidad o pulmón asociada GEMMs puede ser prohibitiva para algunas mediciones cuantitativas y la detección de metástasis de etapa tardía en órganos distantes8. Un enfoque complementario es el uso de modelos de aloinjerto, por el que las células cancerosas de pulmón, ya sea directamente de un tumor de ratón obtenidos o derivados primero como las líneas celulares establecidas en la cultura, son nuevamente introducidas en anfitriones syngeneic. Análogamente, xenoinjertos de cáncer de pulmón se establecen de líneas celulares humanas o muestras tumorales derivados pacientes. Xenoinjertos de línea celular humana o xenoinjertos paciente derivadas (PDXs) se mantienen generalmente en ratones inmunodeprimidos y por lo tanto excluye de vigilancia inmune completa9. A pesar de este inconveniente, que proporcionan una vía para propagar limitando cantidades de humanos hay y estudio fundamental en vivo propiedades de las células de cáncer en humanos, que codifican para aberraciones genómicas más complejas que los tumores GEMM.

Una propiedad útil de aloinjertos y xenoinjertos es que son susceptibles a la tradicional limitación celular dilución ensayos, empleados para cuantificar la frecuencia del tumor iniciar células (TICs) dentro de una población de células malignas10. En estos experimentos, un número definido de las células se inyecta por vía subcutánea en el flanco de los animales y la frecuencia de los TICs puede estimarse en base a la tasa de toma del tumor. Tumores subcutáneos sin embargo pueden ser más hipóxico11 y no pueden modelo claves limitaciones fisiológicas del microambiente del tumor de pulmón. Intratraqueal entrega de madre epitelial o células progenitoras en los pulmones de los ratones es un método para estudiar la regeneración pulmonar y las vías respiratorias la célula de vástago biología12. Sin embargo, la tasa de engraftment de esta técnica puede ser relativamente baja, a menos que los pulmones son sometidos primero a formas fisiológicas de lesiones, tales como infección viral13,14. Apoyo de las células stromal inflamatorias o la interrupción de la membrana basal de pulmón puede mejorar la retención de las células trasplantadas en nichos de células relevantes en la15de las vías aéreas distales. Agentes de inducción de fibrosis puede también previamente la condición los pulmones para mejorar el engraftment de células pluripotentes inducidas16 y17de las células madre mesenquimales. Si otras formas de lesión de las vías respiratorias pueden afectar la tasa de engraftment, capacidad de iniciación tumoral y consecuencia de las células de cáncer de pulmón todavía debe evaluarse sistemáticamente.

En este estudio, se describe un método para aumentar la eficiencia de orthotopic engraftment de la célula de cáncer de pulmón, por acondicionamiento previo de los pulmones de los ratones con lesión. LUAD se presenta en las vías aéreas distales con un subconjunto significativo de estos cánceres en el desarrollo de un tejido conectador fibrótico18 que a menudo se correlaciona con mal pronóstico19. Bleomicina, un peptide nonribosomal natural del híbrido-polyketide, ha sido ampliamente utilizada para inducir fibrosis pulmonar en ratones20. Instilación de las vías respiratorias de la bleomicina primero promueve el desgaste epitelial de los alvéolos y el reclutamiento de células inflamatorias, incluyendo macrófagos, neutrófilos y monocitos21. Esto es seguido por remodelación tisular en las vías aéreas distales, reorganización de la membrana del sótano22,23 y deposición de matriz extracelular (ECM)24. Los efectos de una inyección de bleomicina solo son transitorios, con fibrosis resolver después de 30 días en la mayoría de los estudios de25. Utilizando modelos de aloinjertos y xenoinjertos, probamos si acondicionamiento previo de las vías respiratorias de los ratones con bleomicina puede aumentar significativamente el índice de toma de LUAD células en los pulmones.

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Protocolo

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Todos los experimentos se llevaron a cabo según los protocolos aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) en Universidad de Yale.

1. configuración / preparación de los reactivos.

  1. Bleomicina
    PRECAUCIÓN: Basado en el mundialmente armonizado sistema (SAM) de clasificación y etiquetado de productos químicos, bleomicina está clasificada como un riesgo para la salud GHS08.
    1. Preparación de bleomicina en una campana química. Suspender 15 U en 5 mL de tampón de fosfato estéril salino (PBS).
    2. Alícuota 100-200 μL de la solución en vidrio frascos y congelar a-20 ° C para su uso futuro. Etiquetar correctamente los tubos con la fecha de resuspensión. Utilizar dentro de 6 meses a partir de esta fecha.
      Nota: Cada cepa de ratón tiene una sensibilidad diferente a bleomicina26. Se recomienda probar diferentes dosis de bleomicina para cada cepa de ratón. Las cepas de ratón y las correspondientes dosis de bleomicina en experimentos representativos se enumeran en la tabla 1.
  2. Ratones
    1. Comprar ratones para el experimento y ratones, espere 7 días aclimatar antes de la inyección. Realizar infusiones en una campana de bioseguridad. La transferencia de animales alojados en una habitación obediente no BSL2 BSL2 habitación empleando los procedimientos estándar institucionales antes de la infusión de bleomicina. Inyectar a ratones en 6-8 semanas de edad.
      PRECAUCIÓN: Inyectar ratones siguiendo las directrices de los agentes peligrosos, nivel de bioseguridad 2 (BSL2) y la aprobación del IACUC.
      Nota: Ratones para los experimentos representativos se muestran en la Tabla de materiales. Se han utilizado sólo los ratones machos.
  3. Líneas de células de cáncer de pulmón
    1. Cultura deseada líneas celulares en sus medios respectivos. Antes de las inyecciones, realizar cortos perfiles tándem repetición de ADN o pruebas genéticas para asegurar la identificación correcta de la célula de la línea. Para facilitar in vivo y ex vivo la proyección de imagen, infectar líneas celulares con un lentivirus expresando la timidina quinasa, proteína fluorescente verde (GFP) y fusión de luciferase reporter27y ordenar las células positivas de reportero por fluorescencia activada (FACS) de clasificación antes del engraftment de la célula. Prueba de líneas para micoplasma cada 6 meses.
      1. Cultura línea de células de cáncer humano H2030 según lo recomendado por el fabricante usando el medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con 10% suero bovino Fetal (FBS), penicilina-estreptomicina y anfotericina B.
      2. Cultura 368T1 línea de células murinas (derivado de un ratón KrasG12D, p53- / - ) con medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) con 10% FBS, penicilina-estreptomicina y anfotericina B.
      3. Cultura línea de células de cáncer humano PC9 con RPMI con 10% FBS, penicilina-estreptomicina y anfotericina B.

2. bleomicina tratamiento

  1. Plan para inyectar ratones PCSC con bleomicina 14 días antes del engraftment de la célula tumoral.
  2. Descongele la acción de la bleomicina en el hielo 2 h antes de la inyección.
  3. Una vez descongelado, diluir bleomicina a la concentración deseada de trabajo (0.02 μl de U/50 o 0.005 U/50 μL) y mantenerlo en hielo.
    Nota: Concentración de bleomicina depende de la cepa de ratón utilizada para los experimentos (tabla 1). Debe realizarse valoración de bleomicina en ratones para determinar la dosis óptima.
  4. Anestesia se preparan diluyendo la ketamina y xilacina a una concentración final de 10 mg/mL y 1 mg/mL, respectivamente, usando una aguja de jeringa y 27 G 1 mL, anestesiar cada ratón mediante la inyección intraperitoneal de ketamina/xilacina solución a 100/10 mg/kg respectivamente.
  5. Controlar la respiración de los ratones y emplear una pizca del dedo del pie. Confirmar la anestesia adecuada cuando el ratón no responde a pizca. Aplique ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras esté bajo anestesia.
  6. Ratón de 1 lugar en un momento en una plataforma de intubación por colgar sus dientes delanteros con su espalda contra la plataforma.
  7. Iluminar la parte superior del pecho usando un iluminador de fibra óptica para ayudar con la visualización de la tráquea. Abrir la boca del ratón y sacar la lengua suavemente con unas pinzas planas estériles.
  8. Utilizar un catéter intravenoso sin la aguja para evitar el bloqueo de la respiración. Posición del catéter en la luz blanca emitida por la abertura de la tráquea.
  9. Inserte el catéter en la tráquea hasta la parte superior de la sonda llegue a los dientes frontales. Visualizar la luz blanca brillando a través de la abertura del catéter en la boca para confirmar la colocación correcta del catéter en la tráquea.
  10. Utilizando una pipeta, dispensar 50 μl de bleomicina o vehículo (PBS) directamente en el catéter para asegurarse de que se inhala todo el volumen. Realizar este paso bajo condiciones estériles.
  11. Si el catéter se inserta correctamente, el ratón inmediatamente inhale el contenido del catéter. Espere unos segundos hasta que el volumen entero viaja por el catéter. Luego retire el catéter de la tráquea y disponer en la solución de lejía del 10%.
    Nota: El tiempo medio por ratón de pasos 2.7-2.11 es alrededor de 5 minutos.
  12. Si el ratón no es inhalar el líquido, cuidadosamente controlar respiración y ajuste la posición del catéter. Si el ratón deja de respirar, retire el catéter inmediatamente y permita que el ratón para volver a respirar normalmente antes de volver a insertar el catéter.
  13. Coloque el ratón inyectado en una almohadilla de calefacción aprobado IACUC en su espalda sobre una superficie plana para la recuperación. Todo el procedimiento llevará a 10 min por ratón. No devolver un animal que ha sufrido la inyección a la compañía de otros animales hasta que se recuperó completamente.
  14. Colocar una tarjeta de "Peligrosos químicos en uso" en la jaula durante 24 h.

3. supervisión ratones posteriores a la intubación

  1. Supervisar los ratones para dificultad respiratoria inmediatamente después de la intubación y luego cada 15 minutos hasta ratones despiertan de la anestesia. No descuide la ratones hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal.
  2. Inyectar el ketoprofeno (5 mg/kg) por vía intraperitoneal para aliviar el dolor.
  3. Examinar la ratones 24 h post la intubación y 3 veces por semana para detectar cualquier signo de morbilidad.
  4. Mantener un registro de la fecha de procedimiento, identificación animal, tipo de procedimiento, tipo de observaciones de monitoreo anestésicas y postoperatorias con veces.
  5. Controlar los ratones para pérdida de peso, dificultad respiratoria, anormalidades del comportamiento y una condición corporal < 2 (segmentación de columna vertebral huesos pélvicos evidente dorsal son palpables) dos veces por semana después de la inyección de bleomicina.
  6. Eutanasia a ratones bajo señal de socorro respiratoria o ratones que han experimentado pérdida de 15% de masa corporal por CO2 o ketamina/xilacina seguido por dislocación cervical. Confirmar la eutanasia por medio de la palpación para la actividad respiratoria.

4. injerto de líneas de células de Adenocarcinoma de pulmón.

Nota: Ejecutar el engraftment de células 14 días después de la inyección de bleomicina (paso 2.1).

  1. Permitir a las células crecer en frascos de 75 cm2 imperturbado durante 3 días antes del día de la inyección con los medios correspondientes como se indica en el paso 1.3.
    Nota: Deben ser 80% confluente en el día de la inyección (que corresponde a 2-3 x 106 en cada matraz dependiendo de la línea celular).
  2. Lavar las células crecen en frascos de2 75 cm con 5 mL de PBS a temperatura ambiente.
  3. Aspire PBS y añadir 1,5 mL de tripsina a las células e Incube las células a 37 ° C hasta que desprenda de las células (típicamente 2-5 min).
    Nota: Se recomienda comprobar cada 2 min para la separación celular del plástico por simple visualización de la parte inferior del matraz o bajo un microscopio de luz. No exceda los 5 minutos de incubación con tripsina.
  4. Neutralizar la tripsina añadiendo 4 mL de medio con 10% FBS (mismo los medios de comunicación como paso 4.1). Recoger las células en un tubo de 15 mL y centrifugar a 200 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
  5. Aspire los medios de comunicación y resuspender el precipitado de células en 5 mL de PBS para lavar las células. Centrifugar las células a 200 x g durante 3 min a temperatura ambiente para que sedimenten las células. Repetir esta 1 vez.
  6. Aspire el PBS y resuspender el precipitado en 1,5 mL de PBS por frasco.
  7. Mezclar 50 μl de mezcla de celular con 50 μl de azul tripán y contar las células usando una celda contador/hemocitómetro cámara28.
  8. Preparar suspensión diluir las células en PBS para inyectar 1 x 105 células (o la cantidad indicada) en 50 μL por ratón. Mantener las células en hielo antes de la inyección.
    Nota: Prepare por lo menos dos veces más células de inyección evitar problemas de la suspensión celular.
  9. Anestesia se preparan diluyendo la ketamina y xilacina a una concentración final de 10 mg/mL y 1 mg/mL, respectivamente, usando una aguja de jeringa y 27 G 1 mL, anestesiar cada ratón mediante la inyección intraperitoneal de ketamina/xilacina solución a 100/10 mg/kg respectivamente.
  10. Controlar la respiración de los ratones y emplear una pizca del dedo del pie. Confirmar la anestesia adecuada cuando el ratón no responde a pizca. Aplique ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras esté bajo anestesia.
  11. Ratón de 1 lugar en un momento en una plataforma de intubación por colgar sus dientes delanteros con su espalda contra la plataforma.
  12. Iluminar la parte superior del pecho usando un iluminador de fibra óptica para ayudar con la visualización de la tráquea.
  13. Resuspender las células con la ayuda de una pipeta p200 para asegurarse de que no forman grumos. Abrir la boca del ratón y sacar la lengua suavemente con unas pinzas planas estériles.
  14. Utilizar un catéter intravenoso con la aguja extraer para evitar que se bloquee la respiración. Posición del catéter en la luz blanca emitida por la abertura de la tráquea.
  15. Inserte el catéter en la tráquea hasta la parte superior de la sonda llegue a los dientes frontales. Visualizar la luz blanca brillando a través de la abertura del catéter en la boca para confirmar la colocación correcta del catéter en la tráquea.
  16. Utilizando una pipeta, dispensar 50 μl de las células directamente en el catéter para asegurarse de que se inhala todo el volumen. Realizar este paso bajo condiciones estériles.
    Nota: Si el catéter se inserta correctamente, el ratón inmediatamente inhale el contenido del catéter.
  17. Espere unos segundos hasta que el volumen entero viaja por el catéter, retire el catéter de la tráquea y disponer en la solución de lejía del 10%.
  18. Si el ratón no es inhalar el líquido, cuidadosamente controlar respiración y ajuste la posición del catéter. Si el ratón deja de respirar, retire el catéter inmediatamente y permita que el ratón para volver a respirar normalmente antes de volver a insertar el catéter.
    Nota: El tiempo medio por ratón de pasos 4.11 4.18 es alrededor de 5 minutos.
  19. Coloque el ratón inyectado en una almohadilla de calefacción aprobado IACUC en su espalda sobre una superficie plana para la recuperación.
    Nota: Todo el procedimiento llevará 10 min por ratón. No devolver un animal que ha sufrido la inyección a la compañía de otros animales hasta que se recuperó completamente.
  20. Afeitarse la zona de la costilla entera ventral y dorsal de B6129SF1 J y otras cepas de ratón con el pelo oscuro usando una máquina de afeitar eléctrica antes de la proyección de imagen.
  21. 2-3 min después de la inyección de la célula, inyectar 100 μl de luciferin retro-orbitally (15 mg/mL) utilizando una aguja de insulina. Alternan el ojo utilizado para la inyección de cada sesión de imagen.
  22. Después de al menos 2 minutos, colocar hasta 5 ratones en un reproductor de imágenes de bioluminiscencia animal en la posición dorsal recumbency y adquirir una imagen ventral mediante luminiscencia configuración29.
  23. En el panel de control ajuste la resolución y sensibilidad para medir la luminiscencia de una línea celular determinada. Para la mayoría de las aplicaciones, empezar con 3 minutos (o "Auto" si satura), binning = medio (4), F/Stop = 1, campo de visión = D, altura de objeto = 1.50.
    Nota: Si la inyección es satisfactoria, se detecta señal de luminiscencia en la zona superior del pecho, en un pulmón o en ambos pulmones.
  24. Ratones del tirón en posición esternal recumbency y adquirir una imagen dorsal que el anterior.
    Nota: Si la inyección de la célula no se realiza adecuadamente, las células pueden cluster en la entrada de la tráquea o en el cuello.
  25. Inyectar el ketoprofeno 5 mg/kg por vía intraperitoneal a aliviar el dolor.
  26. Volver a su jaula de ratones y colocar una tarjeta de "agente BSL-2 en uso" en la jaula.
  27. Monitor ratones para dificultad respiratoria inmediatamente después de la intubación y luego cada 15 minutos hasta ratones despiertan de la anestesia. No descuide la ratones hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal.
  28. Examinar la ratones 24 h post la intubación y tres veces por semana para detectar cualquier signo de morbilidad.
  29. Mantener registro en la bitácora la fecha de procedimiento, identificación animal, tipo de procedimiento, tipo de tiempos y observaciones de monitoreo anestésicas y postoperatorias.
  30. Controlar ratones para pérdida de peso, dificultad respiratoria, anormalidades del comportamiento y una condición corporal < 2 (segmentación de columna vertebral huesos pélvicos evidente dorsal son palpables) dos veces por semana después de la inoculación de bleomicina.
    Nota: Los ratones con tumores de pulmón pueden presentar irritación respiratoria, pérdida de peso, caquexia y muerte.
  31. Eutanasia a ratones bajo señal de socorro respiratoria o ratones que han experimentado pérdida de 15% de masa corporal por CO2 o ketamina/xilacina seguido por dislocación cervical si recoge de los tejidos. Confirmar la eutanasia por medio de la palpación para la actividad respiratoria.

5. supervisión del crecimiento del Tumor por proyección de imagen de bioluminiscencia

  1. Repetir la proyección de imagen de los ratones al día 3 post engraftment y semanalmente después de eso.
  2. Anestesiar ratones mediante la inyección de ketamina/xilacina (como se describe en pasos de 2.4-2.5) o de isoflurano inhalado (2%). Controlar la respiración de los ratones y emplear una pizca del dedo del pie para confirmar la anestesia adecuada. Aplique ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras esté bajo anestesia.
  3. Afeitarse la zona de la costilla entera ventral y dorsal de B6129SF1 J y otras cepas de ratón con el pelo oscuro usando una máquina de afeitar eléctrica antes de la proyección de imagen.
  4. Una vez que los ratones bajo anestesia, inyectar 100 μl de luciferin retro-orbitally (15 mg/mL) utilizando una aguja de insulina. Esperar 2 minutos suplente el ojo utilizado para la inyección de cada sesión de imagen.
  5. Lugar de ratones en el reproductor de imágenes y adquirir imágenes dorsales y ventrales como se describe en pasos 4.22 4.24.
  6. Coloque ratones en la jaula después de la proyección de imagen, en su parte posterior sobre una superficie plana para la recuperación.
    Nota: Todo el procedimiento tarda 5 min. por grupo de 5 ratones. No descuide la ratones hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal.
  7. Analizar las imágenes utilizando el software de análisis de imágenes/bioluminiscencia.
    1. Seleccionar las imágenes apropiadas y cargarlos como un grupo en el software de análisis de bioluminiscencia.
    2. Haga clic en herramienta ROI | Plaza para agregar una región cuadrada de interés (ROI). Lugar el retorno de la inversión sobre el área de la parte superior del tórax, cubriendo la imagen del pulmón entero. Repita esto para cada imagen de ratón.
    3. Haga clic derecho y seleccionar copiar todos ROI función para aplicar el mismo ROI a todas las imágenes en el grupo y coloque en la parte superior del pecho de los ratones, vistas ventrales y dorsales.
    4. En la esquina superior izquierda de la ventana de imagen, seleccione la función de fotones . Haga clic en la función de panel de control de medida para medir el ROI. Copie y pegue la tabla de salida que contiene el flujo total (fotones/s) en un software de elección para analizar los datos más lejos.
    5. Normalizar el valor diario del ROI de cada ratón a su valor de retorno de la inversión medido en el día 0.

6. tejido aislamiento y tratamiento.

  1. Anestesiar ratones mediante la inyección de ketamina/xilacina (como se describe en pasos de 2.4-2.5 o de isoflurano inhalado (2%). Controlar la respiración de los ratones y emplear una pizca del dedo del pie. Confirmar la anestesia adecuada cuando el ratón no responde a pizca. Aplique ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras esté bajo anestesia.
  2. Inyectar 100 μl de luciferin retro-orbitally (15 mg/mL) utilizando una aguja de insulina. Esperar 2 minutos.
  3. Ratones de imagen siguiendo pasos 4.22-4.24 del presente Protocolo.
  4. Inyectar en el otro ojo en el paso 6.2 otro 100 μl de luciferin retro-orbitally usando una aguja de insulina antes de la eutanasia.
  5. Eutanasia por inyección intraperitoneal de ketamina/xilacina a los ratones (véase el paso 2.4 para más detalles) seguido por dislocación cervical si los ratones están bajo anestesia profunda con arreglo a pautas proporcionadas por la IACUC. Confirmar la eutanasia por medio de la palpación para la actividad respiratoria.
  6. Usando tijeras quirúrgicas estériles haga una incisión en la piel por debajo del esternón. Abra la capa de músculo a lo largo de la membrana utilizando pinzas y tijeras quirúrgicas y exponer la cavidad torácica cortando a través de la caja torácica en cualquiera de los laterales evitando las arterias torácicas internas.
  7. Inundar el ratón haciendo una pequeña incisión en la aurícula derecha del corazón e inyecte 5 mL de PBS a través del ventrículo izquierdo. El color del tejido pulmonar irá de rojo a rosa pálido-blanco si la perfusión de la sangre no se hace correctamente.
  8. Suprimir los pulmones de la cavidad torácica con cuidado por que ase el esófago o el corazón con unas pinzas. Suavemente Hale el tejido y utilizar tijeras quirúrgicas para cortar con cuidado la conexión del tejido evitando la punción del tejido pulmonar. Preservar lo más posible a la inflación de las vías respiratorias del pulmón en un paso posterior la tráquea.
  9. Lave el pulmón sumergiendo y girando el tejido 3 veces en una placa bien 6 con 3 mL de PBS para eliminar el exceso de sangre.
  10. El pulmón en la tapa de una placa bien 6 y coloque la tapa que contiene el tejido en el reproductor de imágenes bioluminiscente y adquirir una imagen luminiscente30.
    Nota: Se recomienda seleccionar la siguiente configuración de "panel de control de adquisición" "campo de visión = A" y "tema altura = 0,75 cm" y luego "Auto exposición" para evitar que imágenes saturadas.
  11. Impuestos especiales y otros órganos, la imagen como hecho en el paso 6.9-6.10, donde se han identificado metástasis por luminiscencia, tales como cerebro, hígado, suprarrenal, hueso, ganglios linfáticos, bazo o riñón31.
  12. Perfusión pulmonar con 1 mL de paraformaldehído al 4% insertando la aguja en la tráquea del ratón. Los pulmones se inflan si bien perfundidos.
    PRECAUCIÓN: paraformaldehído al 4% es un tóxico, una salud peligro GHS07 y GHS08.
  13. Transferencia de los pulmones en un cónico de 15 mL con 5 mL de paraformaldehído al 4%.
  14. Fijar los pulmones u otros tejidos por incuba el tejido con paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 ° C en un dispositivo de agitación a 30-50 rpm.
  15. Incrustar los pulmones (u otros tejidos) en parafina o corte óptimo temperatura compuesto dependiendo de la aplicación de32.
    Nota: La parafina es el método preferido para preservar la estructura del pulmón y TRICROMICA de Masson y coloración de hematoxilina-eosina.

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Resultados

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Para aumentar la eficiencia del engraftment de la célula cáncer LUAD en los pulmones de ratones, hemos desarrollado un protocolo que primero las condiciones de las vías respiratorias utilizando bleomicina seguida de la inyección de células de tumor ortotópico (figura 1). Se confirmó que incluso cuando se administra en ratones athymic immunocompromised, bleomicina induce fibrosis transitoria día 14 según lo evidenciado por la pérdida de la arquitectura de las ...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sorprendentes paralelismos clínicos han documentado entre cáncer de pulmón y otras enfermedades crónicas del pulmón36. En particular, los pacientes con fibrosis pulmonar idiopática (IPF) tienen una predilección mayor para desarrollar cáncer de pulmón, y esta asociación es independiente de fumar historia37,38. IPF se caracteriza por la destrucción progresiva de la arquitectura pulmonar y deterioro de la función respiratorio a través de la d...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio fue financiado por becas del Instituto Nacional del cáncer (R01CA166376 y R01CA191489 a D.X. Nguyen) y el Departamento de defensa (W81XWH-16-1-0227 a D.X. Nguyen).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BleomicinaSigmaB5507-15UNPRECAUCIÓN Peligro para la salud GHS08
Catéter Exel 24GFisher 1484121Retire la aguja. Para inyección intratraqueal
Ketamina (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL)Butler Schein56344Para anestesiar ratones
XilacinaButler Schein33198Para anestesiar ratones
Ketoprofeno, 5.000 mgCayman Chemical 10006661Analgésico
Puralube Pomada Oftálmica VeterinariaBUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC8897Para prevenir la sequedad ocular bajo anestesia,
D-Luciferin en polvoPerkin Elmer Health Sciences Inc122799Para imágenes luminiscentes. Reconstituya el polvo con PBS para una concentración de trabajo de 15 mg/mL. Proteger de la luz
Soporte de intubación para roedoresBraintree ScientificRIS-100Soporte recomendado para inyección intratraqueal
MI-150 ILUMINADOR 150W MI-150DOLAN-JENNER INDUSTRIESMI-150 / EEG2823MPara iluminar y visualizar la tráquea
Pinzas Graefe, 2,75 (7 cm) de largo serratRobozRS-5111Para inyección intratraqueal
Jeringa Luer-Lok Estéril 5mlBD / Fisher309646
Satinado Smooth de Conair Afeitadora recargable para mojado/seco de doble láminaConair-To
Tijeras Bonn Tijeras, 3.5" rectas de 15 mm Cuchillas de corte seguroRobozRS-5840SC
Tubo cónico de 15 mLBD / Fisher352097
Tubos de centrífuga de 1,5 mLUSA SCIENTIFIC INC1615-5500
Centelleo de vial 7 mL Vidrio de borosilicato GPIFisher701350
Puntas de pipeta con filtro (200 μ L)USA SCIENTIFIC INC1120-8710
Solución salina tamponada con fosfatoLife Technologies14190-144
0.25% Tripsina-EDTALife Technologies25200-056
DMEM alta glucosaLife Technologies11965-092
RPMI Medio 1640Life Technologies11875-093
Suero fetal bovino USDALife Technologies10437-028
Penicilina-EstreptomicinaLife Technologies15140-122
Anfotericina BSigmaA2942-20ML
Tinción azul de tripán 0.4%Life Technologies15250-061
Contador de células automatizado CountessLife TechnologiesAMQAX1000
Frasco T/C 75cm cuello cuadrado, gorra azulFisher / Corning353135
IVIS Spectrum Xenogen BioluminiscencePerkin Elmer Health Sciences Inc124262Para in vivo imágenes de bioluminiscencia
Software de imagen vivaPerkin Elmer Health Sciences Inc128113Para in vivo análisis de bioluminiscencia
XGI-8 Sistema de anestesia gaseosaPerkin Elmer Health Sciences Inc118918Para anestesia con isoflurano
BD Ultra-Fine II Jeringa de insulina de aguja corta 1 cc. 31 g x 8 mm (5/16 in)BD / FisherBD328418Para inyección de luciferina retroorbital
Jeringa 1mlBD / Fisher14-823-434Para inyecciones intraperitoneales
Aguja de 26 G x 1/2 pulg.BD / Fisher305111Para inyecciones intraperitoneales
4% ParaformaldehídoVWR43368-9MPRECAUCIÓN Peligro para la salud GHS07, GHS08. Para la fijación de tejido
Pipet-Lite Pipeta, Unv. SL-200XLS+METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL
Hematoxilina de MayerCIENCIAS DE LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA517-28-2
Tinción de eosina Y 0,25% (p/v) en 57%Fisher67-63-0
Kit de tinción tricrómico MassonIMEB IncK7228Para tinción tricrómática masson para visualizar el colágeno
Superfrost plus portaobjetos de vidrioFisher
Placa de 6 pocillosCorningC3516
Kit universal de detección de micoplasmaATCC30-1012K
OCT Compuesto de inclusiónELECTRÓNICA MICROSCOPY SCIENCES62550-12Para la inclusión de tejido para secciones congeladas
Criostato de investigación Leica CM3050 SLeicaCM3050 SPara seccionar el tejido para el análisis
de tinciónMicroscopio de fluorescencia todo en uno KeyenceKeyenceBZ-X700
ImageJInstitutos Nacionales de Salud de EE. UU.IJ1.46http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html
Prism 7.0 para Mac OS XGraphPad Software, Inc.-
Ratones atímicos (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu)Charles RiverNIH-553
NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) ratonesJackson Laboratories5557
B6129SF1/J ratonesJackson Laboratories101043
células NIH-H2030ATCCCRL-5914
368T1generosamente proporcionadas por Monte Winslow (Universidad de Standford)-
células PC9Nguyen DX et al. Cell. 2009; 138:51 y ndash;
Células BrM3Nguyen DX et al. Célula 2009; 138:51 y ndash; 62-
17014411 1255015 62-H2030

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