Investigar los efectos perjudiciales de baja presión Plasma esterilización sobre la supervivencia de vivir el Bacillus subtilis esporas usando el celular microscopia

Resumen

Este protocolo ilustra los pasos consecutivos importantes requeridos para evaluar la importancia del monitoreo de parámetros de vitalidad y procesos de reparación del ADN en la reactivación de las esporas de Bacillus subtilis después del tratamiento con plasma de baja presión por seguimiento proteínas a través del tiempo-resolved de la microscopia confocal y microscopía electrónica de barrido de reparación del ADN marcado con fluorescencia.

Resumen

Esterilización de plasma es una alternativa prometedora a métodos convencionales de esterilización industrial, clínico, y vuelos espaciales. Descargas de plasma (LPP) de baja presión contienen un amplio espectro de especies activas, que conducen a la rápida inactivación microbiana. Para estudiar la eficacia y los mecanismos de esterilización por LPP, utilizamos las esporas del organismo prueba Bacillus subtilis debido a su extraordinaria resistencia contra procedimientos de esterilización convencionales. Se describe la producción de monocapas de esporas B. subtilis , el proceso de esterilización por plasma de baja presión en un reactor de plasma inductivamente acoplado doble, la caracterización de la morfología de la espora mediante microscopía electrónica (SEM) y la Análisis de germinación y consecuencia de esporas por microscopía de células vivas. Un objetivo importante de especies de plasma es material genómico (DNA) y la reparación de lesiones de DNA inducida por plasma al renacimiento de la espora es crucial para la supervivencia del organismo. Aquí, estudiamos la capacidad de germinación de las esporas y el papel de ADN reparación durante la germinación de las esporas y consecuencia después del tratamiento con LPP por seguimiento marcado con fluorescencia ADN reparación proteínas (RecA) con microscopía de fluorescencia confocal tiempo resuelto. Tratados y monocapas de espora sin tratar son activadas para la germinación y visualizarse con un microscopio confocal invertido vivo de la célula con el tiempo a seguir la reacción de esporas individuales. Nuestras observaciones revelan que la fracción de germinación y rebasar las esporas depende de la duración del tratamiento de LPP llegando a un mínimo después de 120 s. RecA-YFP (proteína de la fluorescencia amarilla) fluorescencia fue detectada solamente en algunas esporas y desarrollada en todas rebasar las células con una elevación leve de las esporas tratadas con LPP. Por otra parte, algunas de las bacterias vegetativas derivan de esporas LPP tratados mostraron un aumento en el citoplasma y tendían a lyse. Los métodos descritos para el análisis de esporas individuales podrían ser ejemplares para el estudio de otros aspectos de la germinación de las esporas y consecuencia.

Introducción

Una meta importante de la exploración espacial es la búsqueda de firmas de las formas de vida y biomoléculas en otros cuerpos planetarios y lunas de nuestro sistema solar. La transferencia de microorganismos o biomoléculas de origen terrestre a las áreas críticas de exploración es de particular riesgo para impactar el desarrollo y la integridad de las misiones de detección de vida en cuerpos planetarios como Marte y Europa¹. Las normas internacionales de protección planetaria, establecida por el Comité de investigaciones espaciales (COSPAR) en 1967, imponer regulaciones estrictas en misiones tripuladas y robóticas a otros planetas, sus lunas, a....

Protocolo

1. producción de esporas de bacillus subtilis y purificación

1. Para la producción de esporas, transferir una cultura noche 5 mL de la cepa B. subtilis , suplementado con antibióticos apropiados, al medio de esporulación Schaeffer líquido de 200 mL de doble resistencia (por litro caldo nutritivo de 16 g, KCl 2 g, 0,5 g de MgSO ₄* 7 H₂O, 2 mL 1 M Ca (NO₃)₂, 2 mL 0.1 M MnCl₂ * • 4 H₂O, 1 mM 2 mL FeSO₄, 2 mL de glucosa 50% (w/v)¹⁸) y cultivar con aireación vigorosa a 37 ° C por 72 h o hasta > 95% de la cultura ha esporulado. Se utilizan las espora....

Resultados

Supervivencia de los tratados con plasma B. subtilis esporas

Tratamiento del plasma de las esporas B. subtilis había utilizado en este estudio muestran una disminución en la supervivencia con aumento de la duración del tratamiento de plasma (figura 2). Las esporas de la cepa expresando la recA-gen fusionado a YFP mostraron curvas de supervivencia similares a las esporas de la.......

Discusión

Esterilización de superficies con baja temperatura, baja presión de plasma es una alternativa prometedora distinta a los procedimientos de esterilización algo convencional como el tratamiento con radiaciones ionizantes radiación, productos químicos (por ejemplo, gases como el H₂O₂ o óxido de etileno) o calor seco y húmedo²³. Métodos de esterilización normal sobre todo proporcionan una efectiva esterilización, pero se sabe que influyen en el material tratado y represe.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Boquilla de dos sustancias (modelo 970-8)	Schlick	14.404	230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0,8 mm diámetro interior
Luria Bertani Medium	Sigma Aldrich	70122-100G
Conectores de tubo	Festo	n/a	G 1/8
Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC	Bosch Rexroth	820005100
PLN Tubo de poliamida	Festo	558206	d = 6 milímetros
Correderas de vidrio	VWR	48300-026
Temporizador eléctrico 550-2-C	Gefran	F000074	220 V
cámara de celda attofluor	Menzel, Fisher Ref.	3406816	d=25 mm, redondo
MgSO4*7 H2O	Sigma Aldrich	13152
Ca(NO3)2	Sigma Aldrich	202967
MnCl2 * 4 H2O	Sigma Aldrich	244589
FeSO4 * 7H2O	AppliChem	13446-34-9
Glucosa	Merck	215422
KCl	Sigma Aldrich	P9541-500G
Caldo de nutrientes (NB)	Merck	105443
Luria-Bertani (LB)	Merck	110283
placa de 96 pocillos	ThermoFisher	243656
Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1	Carl Zeiss Microscopy GmbH	n/a
Leo 1530 Gemini	Carl Zeiss Microscopy GmbH	n/a
ZEN 2 y ZEN lite 2012 (Software)	Carl Zeiss Microscopy GmbH	n/a
SigmaPlot, version 13.0 (Software estadístico)	Systat GmbH, Erkrath, Alemania	n/a
Cámara de células Attofluor	Invitrogen	A7816
µ-Plato de 35 mm, alto Grid-500 Fondo de cristal	ibidi	81168