Una identificación basada en redes neuronal desarrollo competentes o incompetentes adulto de ovocitos de ratón

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para la evaluación no invasiva de competencia desarrollo de oocito durante su maduración en vitro de la vesícula germinal a la etapa de metafase II. Este método combina la proyección de imagen de Time-lapse con partículas imagen velocimetry (PIV) y análisis de redes neuronales.

Abstract

Clínicas de infertilidad se beneficiarían de la capacidad para seleccionar al desarrollo competente vs incompetente ovocitos utilizando procedimientos no invasivos, mejorando así el resultado general del embarazo. Recientemente se desarrolló un método de clasificación basado en observaciones energizados microscopio de ovocitos de ratón durante su maduración en vitro de la vesícula germinal (VG) a la etapa de metafase II, seguida por el análisis de los movimientos citoplasmáticos que ocurre durante este período de lapso de tiempo. Aquí, presentamos protocolos detallados de este procedimiento. Ovocitos son aislados folículos antrales adulto y cultivados durante 15 h dentro de un microscopio equipado para Time-lapse análisis a 37 ° C y 5% CO₂. Los cuadros son tomados a intervalos de 8 minutos. Las imágenes son analizadas utilizando el método de imagen de partícula Velocimetry (PIV) que calcula, para cada ovocito, el perfil de velocidades de movimiento citoplásmico (CMVs) que ocurren durante el período de la cultura. Por último, CMVs de cada ovocito solo son alimentados a través de una herramienta de clasificación matemática (red neuronal Artificial de Feed-forward, FANN), que predice la probabilidad de que un gameto al desarrollo competente o incompetente con una precisión de 91.03%. Este protocolo, configurar el ratón, ahora podría ser probado en ovocitos de otras especies, incluyendo a seres humanos.

Introduction

Infertilidad femenina es una patología que afecta a un número creciente de mujeres. Según la Organización Mundial de la salud, 20% de las parejas son infértil, con un 40% debido a la infertilidad femenina. Además, un tercio de las mujeres sometidas a tratamientos contra el cáncer (300.000/año y 30.000 al año en Estados Unidos o Italia, respectivamente) desarrollar falla ovárica prematura.

Una estrategia para prevenir la infertilidad en pacientes con cáncer es el aislamiento y criopreservación de los folículos ováricos antes del tratamiento oncológico, seguido de maduración en vitro (MIV) de ovocitos GV a la etapa MII (transición de....

Protocol

Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por el institucional Animal cuidado uso y comités de ética en la Universidad de Pavía. Animales fueron mantenidos bajo condiciones de 22 ° C, 60% de humedad y un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 h.

1 aislamiento de ovario

1. Inyectar por vía intraperitoneal 2 cuatro a once semanas de edad CD1 ratones femeninos con 10 U de hormona folículo estimulante con una jeringa de insulina de 1 mL estériles.
2. Espere 46-48 h.
3. Peso del ratón y anestesiar con una inyección intramuscular de 50 mg/kg de Zoletil (Tiletamina y clorhidrato de cloridrate). Eutanasia por d....

Results

La figura 2 muestra una representativa ovocitos desarrollo competentes e incompetentes, respectivamente al principio (GV) y al final (MII) del procedimiento IVM. MIV de ovocitos de ratón adulto ocurre en el cultivo de 15 h. La observación de Time-lapse registra la progresión de la meiosis y detecta grandes acontecimientos meiotic, incluyendo la GVBD y la extrusión del primer cuerpo polar.

El análisi.......

Discussion

Hay varios pasos críticos uno debe cuidar al realizar este protocolo con ovocitos de ratón, así como con los de otras especies. Una vez aisladas de sus folículos, ovocitos deben ser transferidos inmediatamente en las gotas de la grabación, como la separación de la cumulus compañero células activa el inicio de la transición de la GV para MII. Una posible modificación en el presente Protocolo podría ser la adición de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) M2 medio utilizado para el aislamiento de los AOC. IBMX evita la activació.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Folligon	Intervet	A201A02	Tratamiento hormonal
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261	Para la tinción de heterocromatina de ovocitos
Cultivo celular Placa de Petri 35 mm x 10 mm	Corning	430165	Para el aislamiento de AOC
EmbryoMax M2 Medio (1X), Líquido, con rojo fenol	Merck-Millipore	MR-015-D	Para el aislamiento de AOC
Medio MEM Alpha (1X) + Glutamax	Sigma-Aldrich	M4526	Para la maduración in vitro de ovocitos
Cultivo celular Placa de Petri de 35 mm con fondo de vidrio	WillCo	GWSt-3522	Para experimentos de imagen BioStation
IM-LM	vivas	Nikon MFA91001
Pipeta Pasteur	Delchimica Scientific Glassware	6709230	Para la manipulación de folículos
Aceite mineral	Sigma-Aldrich	M8410	Para prevenir la contaminación y la evaporación del medio
Penicilina / Estreptomicina	Life Technologies	15070063	Para prevenir la contaminación del medio
Suero fetal bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	ML16141079	Para el maquillaje y alfa; MEM medio
L-Glutamina	Life Technologies	25030	Para el maquillaje y alfa; MEM medio
Taurina	Sigma-Aldrich	T0625	Para maquillaje y alfa; MEM medio
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A3310	Para maquillaje y alfa; Medios MEM
Piruvato de sodio	Sigma-Aldrich	P4562	Para confeccionar y alfa; Medios MEM
Zoletil (Tiletamina y Zolazepan cloridrato)	Virbac Srl QN01AX9		Para ratones anestesia
Cell_PIV software	Amablemente proporcionado por el Dr. Shane Windsor, Universidad de Bristol, Reino Unido	-	-
MATLAB	The MathWorks, Natick, MA	-	Para computación numérica multiparadigma