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Artículo de método

Utilizando el análisis filogenético para investigar origen de genes eucariotas

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DOI:

10.3791/56684

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14 de agosto de 2018

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1Key Laboratory of Three Gorges Regional Plant Genetics and Germplasm Enhancement (CTGU)/Biotechnology Research Center, China Three Gorges University, 2The Institute of Bioinformatics, College of Life Sciences, Anhui Normal University, 3Department of Plant Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 4College of Resources & Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Se describe un método de construir un árbol filogenético basado en la homología de la secuencia de dulces de eucariotas y SemiSWEETs de procariotas. El análisis filogenético es una herramienta útil para explicar la relación evolutiva entre genes o proteínas homólogas de grupos de organismo diferente.

Resumen

El análisis filogenético utiliza nucleótido o aminoácido secuencias u otros parámetros, tales como secuencias de dominio y estructura tridimensional, para construir un árbol para mostrar la relación evolutiva entre diferentes taxones (unidades de clasificación) en el molecular nivel. El análisis filogenético puede utilizarse también para investigar las relaciones de dominio dentro de un taxón individual, particularmente para los organismos que han sufrido importantes cambian en morfología y fisiología, pero para que los investigadores carecen de evidencia fósil debido a la organismos larga historia evolutiva o escasez de fosilización.

En este texto, se describe un protocolo detallado para el método filogenético incluyendo alineamiento de secuencias de aminoácidos usando Clustal Omega y construcción subsecuente árbol filogenético usando ambos máxima probabilidad (ML) de la genética evolutiva Molecular Análisis (MEGA) y la inferencia bayesiana través de MrBayes. Para investigar el origen de genes eucarióticos Azúcares será eventualmente ser exportado transportadores (dulce), se analizaron 228 dulces incluyendo 35 dulce proteínas de eucariotas unicelulares y 57 semidulces proteínas de procariotes. Curiosamente, SemiSWEETs se encuentra en procariotas, pero dulces se encuentran en eucariotas. Dos árboles filogenéticos construidos mediante métodos teóricamente distintos han sugerido consistentemente que el primer eucariota gen dulce podría provienen de la fusión de un gen bacteriano semidulce y un gen de archaeal semidulce. Cabe señalar que uno debe ser cauteloso al sacar una conclusión basada solo en el análisis filogenético, aunque es útil explicar la relación subyacente entre diferentes taxones, que es difícil o incluso imposible de discernir a través de medios experimentales .

Introducción

Secuencias de ADN o ARN llevan la información genética de fenotipos subyacentes que pueden ser analizados mediante métodos fisiológicos y bioquímicos u observada a través de pruebas morfológicas y fósiles. En cierto sentido, la información genética es más confiable que evaluar fenotipos externos porque el primero es la base para el último. En el estudio evolutivo, la evidencia fósil es muy directa y convincente. Sin embargo, muchos organismos, tales como microorganismos, tienen pocas posibilidades para formar un fósil durante edades del tiempo geológicas. Por lo tanto, información molecular como secuencias del nucleotide y del aminoácido secuencias de organismos existentes relacionados son de valor para explorar relaciones evolutivas1. En el presente estudio, una simple introducción de un protocolo fácil de aprender y conocimientos filogenéticos básicos fue proporcionada para los recién llegados que necesitan para construir un árbol filogenético por cuenta propia.

ADN (nucleótidos) y secuencias de la proteína (aminoácidos) pueden utilizarse para inferir relaciones filogenéticas entre genes homólogos, organelos o incluso organismos2. Secuencias de ADN son más propensos a ser afectados por los cambios durante la evolución. Por el contrario, secuencias de aminoácidos son mucho más estables ya que sinónimo de mutaciones en secuencias de nucleótidos no causan mutaciones en secuencias de aminoácidos. Como resultado, las secuencias de ADN son útiles para la comparación de genes homólogos de organismos estrechamente relacionados, mientras que secuencias de aminoácidos son apropiadas para los genes homólogos de organismos distante relacionados3.

Un análisis filogenético se inicia con la alineación de aminoácidos o nucleótidos secuencias4 Obtenido de un genoma anotado secuenciación base de datos5 listados en formato FASTA, es decir, expresa o supuesta proteína secuencias, secuencias de ARN , o secuencias de ADN. Cabe destacar que es fundamental reunir secuencias de alta calidad para el análisis y secuencias homólogas sólo pueden utilizarse para analizar las relaciones filogenéticas. Muchas plataformas diferentes como Clustal W, Clustal X, músculo, T-coffee, MAFFT, puede ser utilizado para alineamiento de secuencias. El más ampliamente utilizado es Clustal Omega6,7 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), que puede ser utilizado en línea o puede descargarse gratis de forma gratuita. La herramienta de alineación tiene muchos parámetros que el usuario puede ajustar antes de comenzar la alineación, pero los parámetros predeterminados funcionan bien en la mayoría de los casos. Una vez finalizado el proceso, las secuencias alineadas se guardará en el formato correcto para el siguiente paso. Que entonces deben ser editados o recortan utilizando un software de edición, como BioEdit, porque la construcción del árbol filogenético por MEGA requiere las secuencias de igual longitud (incluyendo las abreviaturas del aminoácido y guiones. En la secuencia alineada, cualquier posición sin aminoácidos o nucleótidos es representado por un guión "-"). En general, todos los que sobresalen los aminoácidos o nucleótidos en los extremos de la alineación se deben retirar. Además, se pueden eliminar columnas que contienen secuencias mal alineadas en la alineación porque transmiten poca información valiosa y a veces puede dar información confusa o falsa3. En este momento o en la posterior etapa de construcción de árbol se pueden eliminar las columnas que contienen uno o más guiones. Alternativamente, puede utilizarse para cómputo filogenética. Cuando termine el alineamiento de secuencias y el ajuste, las secuencias alineadas se guardará en formato FASTA, o en el formato deseado, para su uso posterior.

Muchas plataformas de software proporcionan funciones de construcción de árbol utilizando diferentes métodos o algoritmos. En general, los métodos se pueden clasificar como métodos de matriz de distancia o métodos de datos discretos. Métodos de matriz de distancia son sencillos y rápidos de calcular, mientras que los métodos de datos discretos son complicados y lentos. Para taxa estrechamente relacionados con un alto grado de intercambio de identidad de secuencia de aminoácidos o nucleótidos, un método de la matriz de distancia (Neighbor Joining: NJ; Método de grupo par no ponderado con la media aritmética: UPGMA) es apropiado; para taxa lejanamente relacionados, un método de datos discretos (máxima verosimilitud: ML; Máxima parsimonia: MP; Inferencia bayesiana) es optimo3,8. En este estudio, se aplicaron los métodos de ML en MEGA (6.0.6) y la inferencia bayesiana (MrBayes 3.2) para construir árboles filogenéticos9. Idealmente, cuando el modelo correcto y los parámetros se utilizan, los resultados derivados de métodos pueden ser consistentes, y son así más fiable y convincente.

Un árbol filogenético de ML construidos con MEGA10, debe cargarse en el archivo de alineación de la secuencia en formato FASTA en el programa. Entonces el primer paso es seleccionar el modelo de sustitución óptima de los datos cargados. Todos los modelos de sustitución disponible se comparan en base a las secuencias subidas, y sus puntuaciones finales se mostrarán en una tabla de resultados. Seleccione el modelo con el menor puntaje de criterio de información Bayesiano (BIC) (aparece primero en la tabla), ajustar parámetros de ML según el modelo recomendado y comenzar el cómputo. El tiempo de cálculo varía desde varios minutos a varios días, dependiendo de la complejidad de los datos cargados (longitud de las secuencias y el número de taxones) y el rendimiento de la computadora en la cual se ejecutan los programas. Cuando haya terminado el cómputo, un árbol filogenético se mostrará en una ventana nueva. Guarde el archivo como "FileName.mat". Tras la configuración de parámetros para especificar el aspecto del árbol, excepto una vez más. Usando este método, MEGA puede generar cifras de publicación grado árbol filogenético.

Para la construcción del árbol con MrBayes11, el primer paso es transformar la secuencia alineada, que generalmente aparece en formato FASTA, en formato nexus (.nex como el tipo de archivo). Transformar archivos FASTA en formato nexus puede ser procesado en MEGA. A continuación, la secuencia alineada en formato nexus puede cargarse en MrBayes. Cuando el archivo es cargado con éxito, especificar parámetros detallados para el cómputo del árbol. Estos parámetros incluyen detalles como el modelo de sustitución de aminoácido, tasas de variación, número de cadena de cadena de Markov Monte Carlo (MCMC), enganche, número de ngen, promedio desviación estándar de división de frecuencias y así sucesivamente. Después de han sido especificados estos parámetros, iniciar el cómputo. Al final, dos figuras de árbol en código ASC II, un mostrando clade credibilidad y las otras longitudes de rama de mostrar, aparecerá en la pantalla.

El resultado del árbol se guardará automáticamente como "FileName.nex.con". Este archivo de árbol puede ser abierto y editado por FigTree, y la cifra que se muestra en FigTree puede modificarse para que sea más conveniente para su publicación.

En este estudio, se analizaron 228 proteínas dulces, incluyendo 35 dulces de eucariotas unicelulares y 57 SemiSWEETs de procariotas, por ejemplo. Los dulces y SemiSWEETs fueron caracterizados como glucosa, fructosa o sacarosa transportistas a través de las membranas12,13. Análisis filogenético sugiere que los dos dominios MtN3/saliva que contiene dulces podrían ser derivados de una fusión evolutiva de un SemiSWEET bacteriana y de un archaeon14.

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Protocolo

1. alineación de la secuencia

  1. Recoge secuencias de aminoácidos de dulce eucariótico y procariótico SemiSWEET en documentos separados y lista en formato FASTA. Descargar secuencias del centro nacional para información biotecnológica (NCBI), laboratorio de Biología Molecular europeo (EMBL) y el Banco de datos de ADN de bases de datos de Japón (DDBJ) por la búsqueda de similitud con la herramienta básica Local herramienta alineación de la búsqueda (BLAST).
    1. En los archivos de ejemplo, recoger secuencias de proteína dulce supuesta 228 que poseen dos dominios de MtN3/saliva (7 hélices transmembranales) de 57 secuencias de proteína semidulce que posee un único dominio MtN3/saliva (3 hélices transmembranales) de procariotas y eucariotas 13.
    2. Para simplificar el proceso, seleccione 35 proteínas dulces de candidato de organismos eucariotas unicelulares entre los 228 dulces putativos para la construcción del árbol filogenético. Estas secuencias se unen para que el lector puede practicar en un conjunto de datos real.
  2. Alinear las secuencias dulce 35 por introducir en Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).
    1. Copiar y pegar las secuencias de la proteína en formato FASTA en el cuadro de entrada o cargar un archivo de secuencia en formato FASTA. Especificar que son secuencia de aminoácidos haciendo clic en el icono en el menú desplegable en la sección de 'Paso 1'.
    2. Especificar el formato de salida y otros parámetros en la sección "Paso 2", si es necesario. Para este estudio, ajuste el formato de salida como "clustal sin número" y dejar los demás parámetros por defecto. En la mayoría de los casos, los parámetros por defecto funcionan bien sin ninguna especificación.
  3. Presentar y ejecutar la alineación en la sección "Paso 3". Puede llevar en cualquier lugar de varios segundos a minutos, hasta que haya terminado la alineación. En el panel de "Resumen de resultado", haga clic en el enlace bajo "Alineación en formato CLUSTAL" y guardar las secuencias alineadas como "35.clustal" (figura 1).
  4. Abra el archivo de resultado de la alineación en BioEdit.
    1. En el panel principal de BioEdit, "Secuencia" y seleccionar "Editar humor" en el primer menú desplegable, haga clic en "Editar residuos" en el submenú (figura 2).
    2. Seleccionar las secuencias que sobresale en el lado izquierdo de la alineación con el cursor (la secuencia seleccionada se mostrará en negro) y haga clic en el icono "Eliminar" en el menú "Editar" para quitar las secuencias seleccionadas (figura 3).
    3. Seleccionar y eliminar las secuencias que sobresale en el lado derecho del primer dominio MtN3/saliva y guardar las secuencias de dominio MtN3/saliva primer recortadas como 35-I.fas (figura 4). Asimismo, eliminar la izquierda y derecha que sobresalen las secuencias del segundo dominio MtN3/saliva y guárdelo como II.fas 35. La primera y las segunda secuencias de dominio MtN3/saliva pueden predecirse con ritmo (http://proteinformatics.charite.de/rhythm/inndex.php?site=helix) o TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) de antemano.
  5. Abra el archivo 35-I.fas con MEGA y haga clic en "alinear" cuando se le solicite. Bajo el menú "Edición", "Seleccionar todo", haga clic en "Seleccionar secuencias"; los nombres y las secuencias de los taxa, se seleccionarán en negro (figura 5).
    1. Elija "Copiar" del menú "Editar" para copiar las secuencias en el portapapeles y luego pegar las secuencias copiadas a un archivo doc.
    2. En el archivo doc, reemplace todas "#" ">" y luego borrar los caracteres sin relación para convertirlos a formato FASTA. Añadir "-I" al final de cada nombre del taxón para marcarlos como las primeras secuencias de dominio MtN3/saliva. La segunda secuencia de dominio MtN3/saliva siguiendo el mismo método de procesar y agregar "-II" después de cada nombre de taxón.
  6. Combinan las primeras y segunda MtN3/saliva dominio las secuencias en formato FASTA en un archivo doc.
    1. Cargar las secuencias combinadas en Clustal Omega otra vez y alinear las secuencias como se describió anteriormente. Guarde el resultado como "35 realigned.clustal".
    2. Abra el archivo "35 realigned.clustal" en BioEdit, eliminar los residuos de aminoácidos (saliente) desigual en cualquier extremo de las secuencias alineadas y guarde las secuencias como "35 realigned.fas". Haga clic en "Sí" cuando advirtió que no se pueden guardar algunos caracteres no estándar.

2. cómputo del árbol filogenético

  1. Abrir "realigned.fas 35" en MEGA.
    1. Haga clic en el menú "Datos" y elija "Exportar la alineación" y guardar la alineación en el formato PAUP (nexus) como "35.nex" para su uso posterior en MrBayes (figura 6).
    2. Mientras tanto, haga clic en el icono de "Modelos" en el panel principal de MEGA, elija "buscar mejor ADN/proteína modelos (ML)" y haga clic en "Aceptar" en la ventana emergente. Haga clic en "Calcular" para iniciar el modelo de búsqueda proceso (figura 7). Se abrirá un nuevo panel de progreso; Este proceso dura varios minutos a varios días, dependiendo de la complejidad de las secuencias de carga y rendimiento del equipo.
      Nota: Una tabla que muestra que los resultados se abrirán después de que termine el proceso de búsqueda de modelo ( figura 8). La menor puntuación de BIC figurarán en primer lugar, seguido por una serie de diferentes modelos con aumentando poco a poco las partituras BIC. El primer modelo "LG + G + F" con la menor puntuación de BIC es el modelo recomendado para ML árbol basado en el archivo "35 realigned.fas".
  2. Haga clic en el icono de "Filogenia" en el panel principal de MEGA, haga clic en "Prueba de construir la máxima probabilidad árbol" y luego haga clic en "Sí" en el panel emergente. Una nueva ventana abrirá mostrando diferentes parámetros que deben ser especifican (figura 9).
    1. En primer lugar, establecer el valor de bootstrap en la prueba de la caja de la filogenia; 500 o 1000 es adecuado en la mayoría de los casos. Bajo el modelo de sustitución, seleccione "aminoácido" como el tipo de sustitución. El propósito de elegir un modelo de sustitución es estimar la verdadera diferencia entre secuencias basadas en sus Estados presentes3.
    2. Seleccione "LG con Freqs. (+F) modelo "(LG + F) en el cuadro de modelo o método. En el cuadro patrón y tarifas, seleccione "Gamma distribuida" (G) para describir las variaciones de la tasa en todos los sitios, es decir., dando más peso a los cambios en evolución lentamente sitios3. En el cuadro de subconjunto de datos, seleccione "Eliminación completa" para eliminar todas las columnas que contienen guiones.
    3. Mantenga todos los otros parámetros en su estado por defecto (figura 9). Después de la especificación de estos parámetros, haga clic en el icono de "Calcular" para iniciar el cálculo.

3. presentación del árbol filogenético

Nota: Un árbol filogenético de ML se presentará cuando termine el cómputo usando MEGA (figura 10).

  1. En el menú desplegable del icono de "Archivo" en el panel de árbol, elija "Guardar sesión" para guardar el resultado (.mas es el tipo de archivo por defecto). En el presente estudio, el resultado se guarda como "35.mas". En el panel de árbol, muchos parámetros incluyendo longitud de clade, estilo árbol, topología de árbol, fuente del nombre del taxón, tamaño y color, se muestran y pueden ajustarse a diferentes opciones.
  2. Guarde el archivo final del árbol haciendo clic en el icono de imagen y guardar la figura en diferentes formatos o copiar la imagen como fuente para edición de fotos.

4. Análisis de la relación de dulces y SemiSWEETs con alineamiento de secuencias

Nota: Este paso no necesite en el análisis de la secuencia ordinaria.

  1. Alinee los 228 dulces eucariotas y 57 SemiSWEETs procariotas Clustal Omega como se describió anteriormente. Los resultados de la alineación se pueden demostrar en Jalview, que está integrada en Clustal Omega y copiado para guardar en un editor de fotos (figura 11).
    Nota: En la alineación de ejemplo, algunos SemiSWEETs de α-proteobacterias se alinean con el primer dominio MtN3/saliva de las secuencias del dulce, mientras que SemiSWEETs de Methanobacteria (archaea) se alinean con el segundo dominio MtN3/saliva de las secuencias del dulce.

5. construcción de árbol filogenético con MrBayes

  1. Inferencias bayesianas con MrBayes, abra el archivo ejecutable de MrBayes y una interfaz de DOS surgirá una nueva ventana. El primer paso es leer el archivo de datos de nexus. Entrada "execute 35.nex" después del símbolo del sistema (recuerda guardar el archivo de nex 35 en el mismo directorio del archivo ejecutable MrBayes, o señalar el camino del archivo antes de cargarlo). Se mostrará un mensaje de "éxito leer matriz" tras el último de los taxa mencionados (figura 12). El archivo de nex 35 ha sido preparado y guardado en MEGA (véase 2.1 supra).
  2. Establecer el modelo evolutivo.
    1. Después el símbolo del sistema, escriba "prset aamodelpr = fixed(lg); LSet tarifas = g ". El "lg" y "g" corresponden al modelo "LG" y "G" que se encuentra en MEGA. Después de configurar correctamente el modelo, tipo "nchains mcmc = 4 ngen = 5.000.000" después el símbolo del sistema. El uso de la "nchains = 4" significa de entrada un número de una cadena de frío y tres cadenas calientes para el acoplamiento de la metrópoli. "ngen = 5.000.000" significa ejecutar generaciones 5.000.000 de acoplamiento de la metrópoli para la convergencia de las cadenas de frías y calientes. En este estudio, promedio desviación estándar de dividir las frecuencias por debajo de 0.01 fue mirado como la convergencia de las cadenas de frías y calientes.
    2. Tenga en cuenta que el número de ngen no se puede predecir con precisión el comienzo del proceso y generalmente es necesario ajustarse basado en el cambio en la desviación estándar promedio de las frecuencias de split. Además, el número de ngen de convergencia puede ser diferente cada vez cuando ejecuta el programa basado en los mismos datos.
  3. Realizar el análisis: Este paso dura desde varios minutos a varios días, dependiendo de la complejidad de los datos de entrada y el rendimiento del ordenador. Después de completar el cómputo preestablecido, un mensaje preguntará "Continuar con el análisis (sí/no)?" Si "no" se ha escrito después del símbolo del sistema, la informática se detiene (figura 13), de lo contrario seguirá calcular después de entrada el número de generaciones más. Terminado el cómputo (con una desviación estándar promedio de frecuencias de split < 0.01 o 0.05), parar el cómputo escribiendo "no" después de la indicación de consulta.
    Nota: 0.01 es un criterio estricto, 0.05 es moderado y generalmente adecuada.
  4. Resumir las muestras: Tipo "sumidero" después el símbolo del sistema para resumir muestras de parámetros del modelo (figura 14). Escriba "sumt relburnin = sí burninfrac = 0.25" después el indicador para resumir las muestras del árbol. Toda la información sobre la construcción del árbol filogenético se mostrará como en la figura 15, seguido por dos figuras de árbol que aparecen en la pantalla, un mostrando clade credibilidad y las otras longitudes de rama de Mostrar código ASC II. Al mismo tiempo, se guardarán automáticamente un archivo de árbol con el nombre de "35.nex.con".
  5. Para una mejor presentación del árbol filogenético, abra el archivo de árbol de "35.nex.con" con la herramienta de FigTree (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/), seleccione un estilo o el tamaño para mostrar el resultado (figura 16) o incluso editar en un editor de fotos para que sea más fácil de leer.

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Resultados

Árboles filogenéticos muestran que todos los dominios MtN3/saliva primera de las secuencias dulce 35 agrupan como un clado y los dominios MtN3/saliva segundo de las dulces secuencias agrupadas como otro clado. Además, resultados de alineación de los dulces y SemiSWEETs muestran que algunos SemiSWEETs de α-proteobacterias alineación con el primer dominio MtN3/saliva de las secuencias del dulce, mientras que SemiSWEETs de Methanobacteria (archaea) alineación con la segunda MtN3/saliva domin...

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Discusión

Es cada vez más popular en la investigación biológica para hacer un árbol filogenético basado en nucleótido o aminoácido secuencias8. Generalmente, hay tres etapas críticas de la práctica incluyendo la alineación de la secuencia, evaluación de las secuencias alineadas con el método apropiado o algoritmo y visualización de los resultados computacionales como un árbol filogenético. En el estudio presentado, se llevaron a cabo tres rondas de la alineación de la secuencia: en primer lugar, se alinearo...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (31371596), el centro de investigación de biotecnología, Universidad de China tres gargantas (2016KBC04) y la Fundación de Ciencias naturales de la provincia de Jiangsu, China (BK20151424).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Adobe Illustrationuna herramienta gráfica desarrollada por Adobe Systems Software Ireland Ltd. Copyright © 2017
BioEditun editor de alineación de secuencias biológicas escrito para Windows 95/98/NT/2000/XP/7. Derechos de autor y copia; Tom Hall
Clustal Omegaun paquete para realizar múltiples alineaciones de secuencias de aminoácidos o nucleótidos.  http://www.clustal.org/
CorelDRAWun software de diseño gráfico. Derechos de autor y copia; 2017 Corel Corporation
FigTree, un visor gráfico de árboles filogenéticos diseñado por la Universidad de Edimburgo
MEGAMolecular Evolutionary Genetics Analysis versión 6.0 http://www.megasoftware.net/home
MrBayes, una herramienta de inferencia filogenética bayesiana
NVIDIAuna empresa diseña unidades de procesamiento gráfico (GPU) para los mercados de juegos y profesionales. Derechos de autor y copia de la corporación; 2017
PAUPAnálisis filogenético utilizando la parsimonia. El programa de David Swofford implementa el método de máxima verosimilitud bajo una serie de modelos de nucleótidos.
Photoshop,un editor de gráficos rasterizados desarrollado y publicado por Adobe Systems Software Ireland Ltd. Copyright © 2017
RHYTHMuna predicción basada en el conocimiento de los contactos de hekix. Caridad; Berlín – Protein Formatics Group - Copyright 2007-2009
TMHMMuna herramienta para la predicción de hélices transmembrana en proteínas. http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/
Memoria Compterde 4 GB, CPU Core 2 o superior. Windows 7, Windows 10

Referencias

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