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Artículo de método

Inyección de contraste percutánea guiada por ecocardiografía intramiocárdica y entrega de celular en un modelo preclínico grande

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DOI:

10.3791/56699

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21 de enero de 2018

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1Institute for Cardiovascular and Metabolic Research, School of Biological Sciences, University of Reading, 2Departamento de Medicina y Cirugía Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, 3Institute of Virology and Immunology (IVI), 4Departamento de Anatomía y Anatomía Comparada, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, 5Unidad de Trasplante Hematopoyético y Terapia Celular, Departamento de Hematología, Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca, IMIB, Universidad de Murcia

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Nuevas estrategias terapéuticas en medicina regenerativa cardiaca requieren extensos y detallados estudios en modelos animales preclínicos grandes antes que pueden ser considerados para el uso en seres humanos. Aquí, demostramos una técnica de inyección de contraste percutánea guiada por ecocardiografía intramiocárdica en conejos, que es valiosa para la hipótesis que prueba la eficacia de estas nuevas terapias.

Resumen

Terapia celular y génica son emocionantes y prometedoras estrategias con el propósito de regeneración cardiaca en el contexto de la insuficiencia cardíaca con reducción fracción de eyección (HFrEF). Antes de que puedan ser considerados para su uso y aplicados en los seres humanos, se requieren extensos estudios preclínicos en modelos animales grandes para evaluar la seguridad, eficacia y destino de injectate (p. ej., células madre) una vez entregado en el miocardio. Modelos de roedores pequeños ofrecen ventajas (e.g., rentabilidad, receptividad para manipulación genética); sin embargo, debido a limitaciones inherentes de estos modelos, rara vez se traducen en la clínica de los resultados en estos. Por el contrario, los modelos animales grandes como conejos, tienen ventajas (e.g., electrofisiología cardíaca similar en comparación con los seres humanos y otros animales grandes), manteniendo un buen equilibrio rentable. Aquí, demostramos cómo realizar una técnica de inyección (IMI) percutánea contraste intramiocárdico guiada por ecocardiografía, que es mínimamente invasivo, seguro, bien tolerado y muy efectivo en la entrega específica de injectates, incluidas las células, en varios lugares en el miocardio de un modelo de conejo. Para la aplicación de esta técnica, también hemos tomado ventaja de un sistema de ecocardiografía clínica ampliamente disponibles. Después de poner en práctica el protocolo descrito aquí, un investigador con conocimientos de ecografía básica será competente en el desempeño de esta técnica mínimamente invasiva y versátil para uso rutinario en los experimentos, a la comprobación de la hipótesis de la capacidades de la terapéutica regenerativa cardiaca en el modelo de conejo. Una vez que se logra la competencia, todo el procedimiento se puede realizar dentro de 25 minutos después de la anestesia en el conejo.

Introducción

Las terapias celular y génica son emocionantes y nunca desarrollar estrategias para la regeneración o reparación del miocardio lesionado en HFrEF. Unos pocos estudios han comparado la eficacia (e.g., tasa de retención celular) de las diferentes rutas de entrega de la célula, que constantemente han demostrado la superioridad del IMI sobre rutas intravenosa o intracoronary1,2 , 3 , 4 , 5. por lo tanto, no es de extrañar que una gran proporción de los estudios sobre modelos traslacionales de la terapia de la célula de vástago del miocardio lesionado, entregar el injectate via IMI realizada bajo visión directa en un pecho abierto procedimiento6,7 . Sin embargo, este enfoque tiene varias limitaciones, incluyendo la naturaleza invasiva del procedimiento, que conlleva el riesgo de mortalidad peri-procedimiento (a menudo debajo-divulgado)8. Además, un IMI bajo visión directa no elimina la posibilidad de que la inyección inadvertida dentro de la cavidad ventricular. En la práctica clínica un IMI durante cirugía abierta de tórax podría ser un método adecuado para la entrega de la terapéutica celular, por ejemplo, en la arteria coronaria bypass cirugía del injerto (CABG); sin embargo, este enfoque no puede ser apropiado para la entrega de celular global miocardiopatía de origen no isquémico (p. ej., HFrEF secundaria a miocardiopatía inducida por antraciclinas (AICM)).

Cabe duda de que la cardiopatía isquémica (IHD) es la causa más común de HFrEF (~ 66%)9,10; sin embargo, la cardiomiopatía no isquémica, incluyendo AICM, todavía afecta a una proporción significativa de pacientes con HFrEF (33%)9 . De hecho, los recientes avances en oncología clínica han resultado en más de 10 millones de supervivientes de cáncer en los Estados Unidos solo11, con las estimaciones de un número similar en Europa, consistente con una tendencia global hacia la mejoría en la supervivencia de pacientes con cáncer12 ,13. Por lo tanto, explorar los beneficios de los nuevos tratamientos como el trasplante de células madre para la cardiomiopatía no isquémica, así como las pruebas de una ruta efectiva y mínimamente invasiva de la entrega de la célula de vástago es de suma importancia, dado el creciente número de pacientes afectados por cardiotoxicidad secundaria a medicamentos contra el cáncer.

De nota, usando terapia de células madre con el objetivo de reparación/regenerar el miocardio lesionado con frecuencia los estudios de prueba de hipótesis consiste en el uso de roedores pequeños (por ejemplo, ratones y ratas). Estos modelos requieren a menudo sistemas de ultrasonido de alta frecuencia costosos para la evaluación de la función miocárdica, generalmente equipada con transductores de arreglo lineal que tienen algunas limitaciones inherentes asociadas (e.g., reverberación)14. Sin embargo, otros modelos como los conejos, que representan un gran modelo preclínico, tienen algunas ventajas para la comprobación de hipótesis de terapias con células madre en HFrEF. Así, en contraste con las ratas y ratones, conejos mantienen un sistema de transporte de Ca+ 2 y electrofisiología celular que se asemeja a el de seres humanos y otros animales grandes (por ejemplo, perros y cerdos)15,16,17 ,18,19. Otra ventaja es su receptividad para ultrasonido cardiaco proyección de imagen usando relativamente baratos y los sistemas de ecocardiografía clínica ampliamente disponible equipados con transductores array relativamente para fase de alta frecuencia, por ejemplo, 12 MHz, tales como los utiliza con frecuencia en cardiología pediátrica y neonatal. Estos sistemas permiten excelente imagen ecocardiográfica con tecnología de vanguardia, y toman ventaja de la superioridad de la proyección de imagen20armónica. Además, comprobación de hipótesis amplia de las posibilidades de terapias regenerativas cardiacas (p. ej., terapia de células madre), su seguridad, eficacia, cardiomiogenético potencial, así como evaluación del destino de la injectate una vez entregado en el miocardio, es obligatorio antes de que se pueden considerar para el uso humano, y requieren el uso de modelos animales preclínicos grandes, tales como el conejo17,19. Aquí, describimos una técnica mínimamente invasiva para la entrega de la célula mediante ecocardiografía de contraste percutánea guiada por IMI utilizando un sistema de ecocardiografía clínica, destinada a terapia basadas en el trasplante con células madre para la cardiomiopatía no isquémica20 . También describimos las ventajas de la tinta de la India (InI, también conocido como tinta China) como un trazador ultrasonido contraste agente y en situ de injectate en el corazón de conejo.

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Protocolo

Los experimentos descritos en este documento fueron aprobados por el Comité ético de investigación de la Universidad de Murcia, España y se realizaron según la Directiva 2010/63/UE de la Comisión Europea. Los pasos descritos fueron realizados bajo protocolos operativos que eran parte del plan de trabajo y no se ha realizado únicamente con el propósito de filmar el vídeo que acompaña a este trabajo.

1. preparación de las células y vectores de expresión mamíferos

Nota: Aquí, brevemente Describimos un protocolo para la preparación y transfección de una línea celular (riñón embrionario humano 293 (HEK-293)); sin embargo, protocolos específicos de célula apropiada para el tipo de la célula de interés deben ser optimizado (p. ej., células madre).

  1. Mantener las células HEK-293 en glucosa alta Dulbecco de modificado medio de águila (DMEM) suplementado con suero de ternera fetal 10% (FCS), piruvato de sodio 1%, 2 mM glutamina, 1% de penicilina/estreptomicina y se incubó a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% CO2 . Una vez que las células son el confluentes, en una relación de 1:3.
  2. Empezar a dividir las células por aspiración de los medios de comunicación, luego lave una vez con fosfato estéril tamponada con solución salina (PBS), quitar exceso PBS e incubar luego con 2,5 mL de 0,5 x ácido tripsina etilendiaminotetracético (EDTA) (5 minutos, 37 º C).
    1. Añadir un volumen de medio DMEM (complementada como se describe anteriormente) para detener la reacción y luego separar las células aspirando lenta y suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta electrónica.
  3. A continuación, transferir la suspensión de células en un contenedor adecuado (p. ej., tubo de centrífuga cónico de 15-50 mL). Centrifugar en una cubeta de swing (100 x g), eliminar el sobrenadante y lavar el pellet dos veces con PBS estéril.
  4. Resuspender el precipitado en medio DMEM fresco y semilla en una densidad de célula apropiada (p. ej., 1 x 106 células en un frasco de 75 cm2 ) en frascos de cultivo fresco o platos grandes de prácticas de laboratorio local.
    1. Sustituir los medios de comunicación existentes con medio fresco cada 2 días.
      Nota: El vector de expresión se deriva de pIRES1hyg y utilizado según las instrucciones del fabricante como se describió anteriormente21. p(EGFP) IRES1hyg ha sido generado por subcloning EGFP cDNA como un BamHI + NotI Inserte de pEGFP-N1 la BamHI + NotI digerido pIRES1hyg21.
  5. 1 día antes de la transfección, semilla HEK-293 células a una densidad de 0,5 x 105 células/cm2 en placas de cultivo de tejidos de 12 o 24 pocillos.
  6. En el día de la transfección, preparar complejos de reactivo de transfección de DNA de lípidos en tubos de microcentrífuga separados 1,5 mL (1 tubo/bien).
    1. Iniciar mediante la adición de 250 μl de medio de suero reducido en cada tubo y agregar entonces 4 μg ADN (mezclar suavemente).
    2. Posteriormente, Añadir 250 μl de una mezcla previamente preparada de 10 μl de reactivo de transfección lípidos y 250 μl de medio de suero reducido, a cada tubo (mezclar suavemente otra vez).
    3. Por último, continuar con transfecciones, incubando las células HEK-293 con complejos de reactivo de transfección ADN lípidos durante 4 h, reemplazar con medio DMEM complementado como se describió anteriormente (paso 1.1) e incubar otro 48 h. realizar selección de droga de estable transfectants con 100 μg/mL higromicina B.
  7. Separar las células HEK-293 con tripsina como se describió anteriormente (paso 1.2). Después de lavar las células en PBS estéril, resuspender en un vehículo apropiado (por ejemplo, 10% v/v InI en PBS), para lograr una concentración celular final de 5 x 106/ml.

2. preparación del conejo

Nota: La posición del conejo y el transductor para IMI no es óptima para evaluar la morfología y función del corazón del animal. Por lo tanto, es recomendable realizar una exploración ecocardiográfica completa20 antes de la IMI (véase abajo) y en momentos posteriores, según lo definido por el diseño experimental. Esto tendrá como objetivo evaluar las anatómicas y funcionales características basales del corazón en los animales que reciben una inyección y también evaluar los efectos, del IMI en la función del corazón.

  1. Llevar a cabo este examen de manera ciega y siguiendo las directrices del Comité de ecocardiografía de la Colegio Americano de medicina interna de veterinaria y la sociedad americana de ecocardiografía Europea Asociación para la proyección de imagen Cardiovascular 22 , 23 , 24.
  2. Obtener un trazo simultáneo de 1 cable de Electrocardiograma (ECG) durante todo el estudio ecocardiográfico todo.
  3. Anestesiar al conejo con ketamina 10 mg/kg, combinado con medetomidina 200 μg/kg, inyección intramuscular (I.M.).
  4. Verificar el nivel de la anestesia después de 10-20 min tras la administración de la anestesia.
  5. Usando un cortador de pelo eliminar el vello del pecho ampliamente (por ejemplo, debajo de la nuca a la región el xiphoid) (figura 1A).
  6. Afeitado más regiones de 1-2 cm2 en la cara interna de la extremidad delantera derecha (región mediocubital) y de ambas extremidades posteriores (región mediotibial) (figura 1B).
  7. Coloque los electrodos de ECG adhesivo en las regiones afeitadas de las extremidades síncrono monitorear el ritmo cardíaco durante el procedimiento (figura 1).
  8. Coloque el animal en la posición de decúbito supino en una manta térmica, con las extremidades extendidas con esparadrapo a la mesa (figura 1).
    1. Asegúrese de que los oídos se flexionan hacia atrás detrás de la cabeza/espalda del conejo y en una posición que es más baja que sus patas delanteras, ya que esto ayuda a mantener la correcta posición del tórax del animal durante todo el procedimiento.
  9. Permitir que el animal respire espontáneamente mientras que administrar oxígeno por mascarilla a lo largo de todo el proceso (100%, 2-3 L/min).

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Figura 1. Preparación del conejo para IMI. (A) Clip pelo del tórax; (B) Clip pelo de miembros; (C) Coloque los electrodos y colocar el conejo con piernas estiradas en una manta térmica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. técnica de contraste percutánea guiada por ecocardiografía IMI en el conejo

  1. Limpiar y desinfectar la piel del tórax con una solución de clorhexidina.
    1. Utilizar una técnica aséptica durante todo el procedimiento, según mejores prácticas actuales.
    2. Siempre que sea posible y si es posible, realizar un procedimiento completamente estéril, incluyendo pero no limitado a, el uso de material estéril, tales como batas, guantes, cortinas de herida quirúrgica, preparación de material para la mesa, así como un ultrasonido estéril estériles cubierta y gel de ultrasonidos estéril. Esto reducirá al mínimo el riesgo de introducción de patógenos a los animales reciben el IMI y es una práctica estándar en el ajuste clínico (por ejemplo, durante la punción cardíaca).
      Nota: Se recomienda a proceder siempre conforme a las regulaciones locales y nacionales de investigación animal aplicable a las instituciones locales y el país de la práctica.
  2. Aplicar gel de transmisión del ultrasonido en el pecho o el transductor y el cable del transductor al cuello del experimentador, realizar un análisis rápido de la ventana del corazón del animal, que a menudo es útil para visualizar la anatomía y planificar para el IMI.
  3. Coloque el transductor manualmente en el 4 espacio intercostalth-6th , 2-3 cm de la línea paraesternal derecha con un ángulo de incidencia de ~ 90 ° con respecto a la derecha de la pared torácica (figura 2A).
  4. Ajuste la ubicación del transductor en relación con el espacio intercostal, así como sus anteroposterior y dorsoventral del ángulo para optimizar una vista modificada eje corto a nivel de los músculos papilares. Identificar en este punto de vista el ventrículo derecho (VD), ventrículo izquierdo (LV), septo interventricular (IVS), pared posterior (PW), así como anterolateral (AL) y músculos papilares posteromedial (PM) (figura 2B).
    1. Tienen un amplio campo de visión incrementando significativamente la profundidad mediante el control apropiado en el sistema (p. ej., botón, esfera).
    2. Prestar especial atención a la obtención de una imagen simétrica en esta vista, así como la adecuada diferenciación de contornos endocárdicos y epicárdicos y, si es necesario, ajuste a través de controles de optimización de la imagen (por ejemplo, ganancia).
  5. Una vez que la vista ecocardiográfica óptima se obtiene (figura 2B), mantener esta posición durante el resto del procedimiento, mientras que un segundo operador realiza el IMI (véase abajo).
    1. Mientras sostiene el transductor, evitar ocultar la marca de orientación del transductor, que siempre debe ser hacia delante, lo que permite su alineación con la aguja en pasos posteriores (figura 2A, C).
  6. Con una aguja 24 G conectada a una jeringa de 1 mL, coloque la aguja cerca de la piel de lo hemitórax simétricos espejado con respecto al transductor. A continuación, alinear manualmente la aguja con la marca de orientación del transductor en un ángulo de ~ 90° (figura 2) y haga avanzar lentamente la aguja a través de la piel y en la cavidad torácica.
    Nota: La inserción percutánea de la aguja en esta posición y la orientación facilita la visualización de la aguja en el plano de la viga del ultrasonido (Figura 2D, E), lo que permite el monitoreo en tiempo real y, cuando sea necesario, el ajuste de la ubicación de la aguja en relación con la región de destino del miocardio (figura 2 G, H).
  7. Con la punta en la ubicación de destino, lentamente entregar el injectate (hasta 0,25 mL por sitio de inyección) dentro de 10-30 s (Figura 2E), mientras que poco a poco y suavemente retrayendo la aguja durante la inyección para aumentar la extensión del miocardio tratados.
    1. Use InI 10% (v/v) diluido en PBS para la estandarización de la técnica y como un trazador en situ y adquisición de competencias, así como para confirmar la focalización exitosa de las cuatro localidades IMI en el miocardio por el grueso de la patología e histopatología (véase Representante de resultados). Una vez que se logra la competencia, InI podría ser sustituida por un agente de contraste de ultrasonido comercial adecuado si se desea.
      Nota: La entrega del 10% (v/v) InI diluido en PBS con o sin células en los resultados de miocardio transmural hyperechogenicity (es decir, aspecto brillante eco) en el sitio de destino de la inyección (Figura 2E, F). Transitoria desaceleración o aceleración del ritmo cardiaco, asociado a Extrasistolia ventricular (p. ej., aislados, pareados y trillizos) se observan con frecuencia incluso desde el primer contacto de la aguja con el epicardio, así como durante o poco después de IMI. Sin embargo, no se desarrollan arritmias peligrosas para la vida, y efectos adversos agudos se observan raramente con 0.25 mL (1.25 x 106 células) de injectate por sitio de la inyección de IMI (véase Representante resultados y discusión).
  8. Realizar cambios sutiles en el ángulo de incidencia de la aguja según sea necesario para completar las inyecciones de 0.25 mL a cada uno de los sitios IMI cuatro (tres en el ventrículo izquierdo libre de pared (LVFW) y en el IVS).
  9. Después de completar el procedimiento de contraste percutánea guiada por ecocardiografía IMI, evaluar ritmo cardíaco (por ejemplo, a través de la serie ECG trace o 24 h Holter ECG) y realizar análisis ecocardiográfico ventana serie para verificar la ausencia de complicaciones, hasta que el animal está recuperado de la anestesia y solo entonces transferencia a un cuarto ciclo de luz.
    1. Aquí, utilizamos 24 h Holter ECG para monitorizar los efectos del IMI con el InI en el ritmo cardíaco durante 24 h. Para ello, se compararon un grupo de 6 conejos con fenotipo normal (grupo Normal) y un grupo de 6 conejos que recibieron administración intravenosa de doxorubicina (una cardiotóxicos anthracycline droga, comúnmente utilizada para el tratamiento del cáncer; Grupo DOX) en una dosis de 2 mg/kg/semana durante 8 semanas y luego ambos cohortes recibido IMI con InI.

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Figura 2 . Inyección de contraste percutánea guiada por ecocardiografía intramiocárdica en el conejo. (A) colocación del transductor en el hemithorax correcto en un ángulo de ~ 90 °. (B) imagen representativa de una visión de eje corto paraesternal (PSSX) del corazón a nivel de músculos papilares en el conejo. (C) alineamiento de la aguja en un ángulo de ~ 90 ° en relación con la marca de orientación del transductor. (D) Ubicación de la aguja en el sitio de destino en una vista PSSX del corazón (note que la aguja se visualiza fácilmente en el plano de la viga del ultrasonido). (E y F) demostración del hyperechogenicity en el sitio de destino en inyección intramiocárdica con tinta de la India (puntas de flecha de resaltar el hyperechogenicity transmural). (G) Ubicación Accidental de la aguja en la cámara del LV (puntas de flecha de resaltar el eje de la aguja). Nuevo (H) de la aguja a la pared libre del LV (puntas de flecha de resaltar el eje de la aguja). RV = ventrículo derecho; LV = ventrículo izquierdo; IVS = tabique interventricular; PW = pared posterior; AL = músculo papilar anterolateral; PM = músculo papilar posteromedial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. post IMI análisis

  1. Realizar el análisis histopatológico de las muestras de tejido de corazón de conejos.
    1. Fijar el tejido durante 24 horas en formaldehído al 10%, seguido de deshidratación con el aumento de las concentraciones de etanol como sigue:
      • 1 x 70% (60 min)
      • 1 x en metanol de ethanol/5% 95% (60 min)
      • 1 x 100% (60 min)
      • 1 x 100% (90 min)
      • 1 x 100% (120 min)
      Nota: Todas las anteriores incubaciones se realizan a temperatura ambiente (RT). Luego, sustituir dos veces con xileno 100% (1 h, RT) y finalmente incluir en parafina en dos pasos (60 min, 58 ° C)25.
    2. Realizar secciones de tejido de 4-5 μm con un micrótomo25. Monte las secciones en las diapositivas.
    3. Realizar tinción con hematoxilina-eosina y trichrome métodos25,26,27 de Masson.
  2. En secciones del tejido del corazón trasplantado, realizar inmunohistoquímica para detectar las células HEK-293 EGFP(+) (p. ej., utilizando el método de (ABC) complejo avidina-biotina), brevemente:
    1. La cera secciones corazón grueso de 4-5 μm en xileno 100% (10 min, a temperatura ambiente). Rehidratar el tejido lavando con la disminución de soluciones de concentración de etanol (2 x 100% (2 min) x 2 en el 95% (2 minutos) 1 x 70% (2 minutos); 1 x en el 50% (2 min); 1 x 30% (2 min); 1 x ddH2O (2 min)) a TA.
    2. Llevar a cabo la inhibición de la peroxidasa endógena que cubre las secciones con 100 μl de 3% H2O2 diluido en metanol (preparada con 5 mL de solución de H2O2y agregar metanol 30% hasta un volumen total de 50 mL) ( Incubar 30 min, RT) y luego lavar por inmersión con solución salina tamponada con Tris (TBS; pH 7,6).
    3. Realizar antígeno desenmascarar mediante tratamiento enzimático, cubriendo las secciones con 100 μl de 0,1% pronasa (preparada con 0.01 g pronasa diluida en 10 mL TBS) (incubar 12 min, RT), a continuación lavado con TBS (5 min, RT).
    4. Incubar en el bloqueo de solución (suero normal de cabra en 10% en TBS) con 100 μl por diapositiva (30 min, RT) y lavado con TBS (5 min, RT).
    5. Incubar con proteína de pollo anti-verde fluorescente (GFP) como anticuerpo primario (1: 500 en TBS) (1 h, 30 ° C) y lavado con TBS (5 min, RT).
    6. Incubar con el anticuerpo secundario biotinilado cabra anti-pollo IgG (1: 250 en TBS) (1 h, 30 ° C) y luego lavado con TBS (5 min, RT).
    7. Incubar con complejo avidina-biotina (20 min, 30 ° C) y luego la etiqueta usando tetrahydrochloride 3,30-diaminobenzidina (DAB) (RT, 5-10 min).
    8. Finalmente, deshidratar por lavado en el aumento de las concentraciones de etanol (1 x 30% (2 minutos) 1 x 50% (2 minutos) 1 x 70% (2 minutos); 2 x (2 min.) el 95%; 2 x 100% (2 min)) en RT, contratinción secciones usando el método de hematoxilina-eosina25y luego montar diapositivas de cubierta. Son positivo, negativo así como controles de isotipo.
      Nota: El breve protocolo descrito anteriormente no está diseñado para uso general inmunohistoquímica; optimización para el tejido de interés y condiciones es necesario.

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Resultados

Contraste percutánea guiada por ecocardiografía IMI con InI:

Utilizando el protocolo descrito anteriormente, y una vez que la posición óptima de la punta de la aguja fue confirmada por la ecocardiografía y la inyección iniciadas, transmural hyperechogenicity se observó durante la entrega de InI (10% v/v en PBS) (Figura 2E) , así como poco después el IMI a la región de destino (

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Discusión

El objetivo principal era desarrollar una técnica mínimamente invasiva que podría ser utilizada para la entrega de células madre en el miocardio de conejos (un gran tamaño animal modelo preclínico)17,18, mientras que tomando ventaja de la utilización de un relativamente barato, fácilmente disponible en muchas clínicas del sistema de imagen y centros de investigación. Aquí, demostramos que, utilizando un sistema de clínicas de la ecocardiografía, y ayudado por el ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen excelente apoyo brindado durante la recogida de datos y Carlos Bueno para proporcionar las células HEK-293 EGFP(+) Sheila Monfort, Brenda Martínez, Carlos Micó, Alberto Muñoz y Manuel Molina. Este trabajo fue financiado en parte por: Fundación Séneca, Agencia de Ciencia y Tecnología, Región de Murcia, España (JT) (número de autorización: 11935/PI/09); Red de Terapia Celular, ISCIII-Sub. Gral. Redes, VI PN de I + D + I 2008-2011 (no de la concesión. RD12/0019/0001) (JMM), cofinanciado con fondos estructurales de la Unión Europea (FEDER) (JMM); y la Universidad de Reading, Reino Unido (AG, GB) (financiación Central). Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Sistema de ultrasonido HD11 XESistema deecocardiografíaPhilips 10670267
S12-4PhilipsB01YgGTransductor de matriz de fase de 4-12 MHz
Gel de transmisión de ultrasonidos (Aquasone)Parket laboratories IncN 01-08
Vasovet 24GBraunREF 381212  catéter sobre la aguja
Omnifix-F jeringa de 1 mlBraun9161406V
Imalgene (Ketamina)MerialRN 9767Es necesaria prescripción veterinaria
Domtor (Medetomidina)EsteveCN 570686.3Es necesaria prescripción veterinaria
Almohadilla
Faber-Castel TG1Faber-Castel16 33 99India (China) Tinta
Holter SyneflashEla medicalSF0003044Ssistema de ECG Holter 24 horas.
Electrodos Blue Sensor®Ambu (NUMED)VLC-00-SHolter.
MicrotomoLeica BiosystemsRM2155
MicroscopioOlimpusCO11
ABC Vector EliteVector LaboratoriesPK-6200Avidin Biotin Complex Kit.
Anticuerpo anti-GFP de polloInvitrogenA10262Anticuerpo primario.
Anticuerpo IgG biotinilado contra cabra y polloLaboratorios de vectoresBA-9010Anticuerpo secundario.
3,30-diaminobenzidina tetraclorhidrato (DAB)DAKO (Agilent)S3000
Microscopio de fluorescenciaCarl Zeiss
MicroImaging		Zeiss AX10 Axioskop
Holter ECGElamedicalSyneflash SF0003044S
Dulbecco' s medio Eagle modificado (DMEM) Fisher Scientific11965084
10% suero fetal de ternera (FCS)Fisher Scientific11573397
0,05% de tripsina-etilendiaminácido tetraacético (EDTA)Fisher Scientific25300054
Lipofectamine 2000 (reactivo de transfección de lípidos)Fisher Scientific11668019
Medio sérico reducido (Opti-MEM)Fisher Scientific
Higromicina BCalbiochem (MERCK)400051
Xileno (histológico)Fisher ScientificX3S-4
Solución de peróxido de hidrógeno (H2O2)SigmaH1009
PronaseFisher Scientific53-702-250KU
.térmicaElectrodos de ECG 31985070

Referencias

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