Cromatina difundir preparados para el análisis de progresión de ovocitos de ratón de profase a metafase II

Resumen

Ovogénesis en mamíferos es conocido por ser errores, particularmente debido a protooncogenes del cromosoma. Este manuscrito describe métodos de preparación de cromatina extensión de profase de ratón, metafase I y II etapas ovocitos. Estas técnicas fundamentales permiten el estudio de las proteínas de la cromatina-limite y morfología cromosómicas en mamíferos Oogénesis.

Resumen

Técnicas de propagación de cromatina se han utilizado ampliamente para evaluar la localización dinámica de proteínas diferentes durante la gametogénesis, particularmente para la espermatogénesis. Estas técnicas permiten para la visualización de patrones de localización de ADN y proteína durante eventos meióticas como cromosoma homólogo emparejamiento, synapsis y ADN reparación. Mientras que en la literatura se han descrito algunos protocolos, cromatina general técnicas de propagación utilizando ovocitos de mamífero profase son limitados y difíciles debido a la sincronización de la iniciación de la meiosis en los ovarios fetales. En comparación, espermatocitos de profase se pueden recoger en ratones machos menores con rendimientos más altos sin necesidad de microdissection. Sin embargo, es difícil obtener una población sincronizada pura de células en fases específicas debido a la heterogeneidad de las poblaciones de meiótica y posterior meiosis células germinales en el testículo adulto y juvenil. Para etapas posteriores de la meiosis, es ventajoso para evaluar oocitos en meiosis I (MI) o meiosis II (MII), porque grupos de ovocitos maduros pueden ser obtenidos de ratones hembra adultas y estimulados para reanudar la meiosis en la cultura. Aquí, métodos para preparaciones de meiosis cromatina extendida utilizando ovocitos disecaron de fetal, neonatal y adulto ovarios se describen con el acompañamiento de demostraciones en video. Eventos de protooncogenes cromosoma en ovocitos mamíferos son frecuentes, especialmente en MI. Estas técnicas pueden utilizarse para evaluar y caracterizar los efectos de diversas mutaciones o exposiciones ambientales en distintas etapas de la Oogénesis. Como hay diferencias distintas entre ovogénesis y espermatogénesis, las técnicas descritas son invaluables para aumentar nuestra comprensión de la Oogénesis mamíferos y las características de dimorfa sexual de cromosoma y proteína dinámica durante la meiosis .

Introducción

Durante la espermatogénesis, grandes olas semisincrónico de meiótica de las células germinales se rápidamente y continuamente reponen en el testículo en el inicio de la pubertad y a lo largo de la edad adulta¹. En contraste con los varones, la meiosis de las hembras se inicia únicamente durante el desarrollo fetal. Después de nacimiento, ovocitos permanecen detenidos en una etapa prolongada dictyate de profase I con una vesícula germinal intacta (GV; envoltura nuclear) hasta la pubertad. En el inicio de la pubertad, un subconjunto de los ovocitos se seleccionan cíclicamente a experimentar crecimiento y maduración, marcando el inicio de la reanudación meiótica. Reanudación meiótica de ovocitos adulto se manifiesta por la desaparición de la GV en un proceso conocido como ruptura de vesícula germinal (GVBD). Entonces, el ovocito sufre cromosoma condensación y segregación, seguido por la protuberancia del cuerpo polar. Ovocitos pasan arrestados tras progresión a MII y son estimulados para completar la segunda y última división meiótica sólo después de la fertilización.

Fertilidad de la mujer depende el éxito de la profase meiótica I progresión. Clave para esto es la formación de un vínculo físico entre los cromosomas homólogos denominados quiasmas, que está mediada por la reparación de roturas de doble cadena inducida por ADN (distritales) via crossover recombinación². Este proceso ocurre dentro del contexto de un andamio proteínico dinámico conocido como el Complejo Sinaptonémico (SC) que se forma entre los cromosomas homólogos para facilitar sus sinapsis³. El SC es una cremallera-como estructura tripartita que consta de dos elementos laterales paralelos conectados por las proteínas de la región central que posee homólogos juntos a lo largo de curso reparación del ADN. Antes de la sinapsis, precursores de los elementos laterales, llamados elementos axiales, forman entre cromátides hermanas. Las proteínas del Complejo Sinaptonémico como SYCP2 y SYCP3 forman elementos axiales que colocalize a los ejes de la hermana chromatid cohesión durante la profase temprana. Estos más adelante servir como sitios para la proteína del filamento transversal, SYCP1, que facilita el montaje del elemento central y sinapsis entre homólogos alineados⁴de Unión. En ovocitos de ratón, sinapsis completa se indican por la presencia de 20 completamente superposición de extensiones SYCP3 y SYCP1, que pueden visualizarse mediante el uso de cromatina difundir preparativos. Synapsis se ha completado al entrar en el subestadio de paquiteno, por el crossover maduro que está destinado a quiasmas forma entre homólogos está decorada con dímeros de mutL homólogo (MLH1/3) para promover su proceso exacto^{5,6 , 7}. el mantenimiento estructural de complejos de cromosomas (SMC), incluyendo la cohesina, condensin y el SMC5/6 complejos, son importantes para la regulación de la dinámica del cromosoma y estructura a lo largo de la meiosis^{8,9, 10,11,12}. Colectivamente, estos eventos aseguran bi-orientación adecuada de los cromosomas homólogos a polos de huso después de desmontaje de la SC. de oposición

El ciclo celular meiótico es un poderoso modelo para examinar los papeles de varias proteínas en el mantenimiento del genoma debido a la inducción programada y posterior reparación del ADN distritales. Además, mamífera meiosis es también un modelo relevante para el estudio de las modificaciones epigenéticas e impresión¹³. Sin embargo, es técnicamente difícil de evaluar estos acontecimientos durante la meiosis femenina, que tiene lugar en los ovarios fetales y neonatales en los mamíferos (figura 1). Profase I puedo se divide en 5 subetapas: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema y dictyate. Adjunto, describimos cómo aislar y distinguir entre ovarios fetales y neonatales y los testículos (figura 2). Adaptado de los métodos anteriormente descritos, este manuscrito describe también un protocolo (paso 1) con video de demostración para la preparación de la profase meiótica femenina la cromatina separa^14,15,16,17 . Cuando se combina con immunolabelling, tal como se describe en los pasos 6 y 7, este protocolo permite análisis microscópico detallado de profase I eventos en ovocitos.

Ovogénesis son propenso, y eventos de protooncogenes del cromosoma durante la primera división meiótica representan la fuente más común de enfermedades genéticas en la progenie de^18,19. En este manuscrito (paso 2 del Protocolo), se describe un protocolo que ovocitos maduros organizado por el GV se extraen preparados ovarios de ratones hembra adultos. Condiciones de apoyo, ovocitos adulto pasan por independiente de la hormona luteinizante reanudación de la meiosis después de aislamiento y la cultura²⁰. Tras la reanudación meiótica, ovocitos progresan a través de la meiosis I y luego arrestan en metafase II. Ovocitos siendo arrestados en metafase II, a menos que fertilizan. En los pasos 2 – 5, nos adaptamos a protocolos previamente divulgados con video de demostración para describir cómo recopilar, cultura y preparar MI y MII ovocitos cromatina difundir preparativos²¹. Esta cromatina separarse técnica permite immunolabelling claro de proteínas relacionadas con los cromosomas. Además, este protocolo también puede utilizarse para distinguir entre los cromosomas bivalentes y univalentes y además puede resolver sola hermana chromatids para facilitar la evaluación de la ploidía de ovocitos. Por lo tanto, además de revelar patrones de localización de proteínas meióticas, este protocolo también puede servir como una valiosa herramienta para dilucidar las causas potenciales de protooncogenes cromosoma durante MI y MII.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad Johns Hopkins. Los experimentos fueron realizados en ratones C57BL/6J de tipo salvaje.

1. recolección de ovarios fetales o neonatales y la preparación de la profase la cromatina se separa

1. Para extraer embriones en 14.5 – 19,5 días post-coitum (dpc) sacrificar hembras preñadas mediante dislocación cervical o CO₂ asfixia según las pautas IACUC.
   Nota: para el día postnatal 1 – 5 ovarios vaya directamente al paso 1.3. Figura 1 resume las etapas de la profase meiótica enriquecidas a diferentes edades embrionarias y postnatales.
2. Abrir la cavidad de abdominopelvic con tijeras estériles, haciendo una abertura en forma de V. Diseccionar hacia fuera el cuerno uterino materno, separar la placenta de los embriones y transferir los embriones en platos de petri de 35 mm que contiene 3 mL de precalentado 1 x solución salina buffer fosfato (PBS) a 37 ° C.
   Nota: Puede utilizarse una fliptop la incubadora a 37 ° C para mantener la temperatura. Además, también puede utilizarse una platina de vidrio de temperatura regulada para mantener la temperatura durante la manipulación del ovario.
3. Tijeras quirúrgicas de 3,5 pulgadas, sacrificar embriones o crías mediante decapitación según las pautas IACUC. Colocar embriones decapitados o cachorros en PBS precalentada antes de la disección posterior.
4. Diseccionar un embrión o cachorro a la vez en una placa Petri separadas 35 mm que contiene 3 mL de PBS precalentada a 37 ° C. Proceder con el corte a lo largo de la línea media ventral de la mitad posterior del embrión, a lo largo de la mitad anterior por debajo de los miembros anteriores y directamente sobre las extremidades posteriores y la cola como se indica en la figura 2A–B.
5. Abrir el abdomen con tijeras quirúrgicas de 3,5 pulgadas. Con unas pinzas de punta fina desplazar o eliminar el hígado y asas del intestino, exponiendo los ovarios en una nueva placa de petri de 35 mm que contiene 3 mL de PBS precalentada a 37 ° C (consulte la guía en la figura 2B). Los ovarios están situados inmediatamente debajo y detrás del riñón hacia la pared posterior de la cavidad peritoneal (figura 2B,C). Una guía para diferenciar las gónadas masculinas y femeninas se presenta en la Figura 2D.
   Nota: Para condiciones óptimas, rápidamente disecar hacia fuera de los ovarios después de mujer embarazada se sacrifica.
6. Extirpar ambos ovarios de cada feto femenino con un par de pinzas de punta fina en un ámbito de disección y en unas gafas de ver o pozos separados de un pozo varios con 0.5 a 1.0 mL de PBS con la placa y mantienen a 37 ° C.
7. Colocar cada par de ovarios en 0,5 mL de tampón de extracción hypo (17 mM de citrato trisódico dihidrato, sacarosa de 50 mM, 5 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 30 mM Tris-HCl, inhibidor de la proteasa, pH 8.2) en un vidrio de reloj limpio o en un pequeño pozo de una placa de 9 pozos, asegurándose de que sumerja la comp ovarios letely. Incubar durante al menos 15 minutos, pero no más de 30 minutos.
   Nota: Hacer tampón de hypo-extracción fresca y usar dentro de 2 h de además de TDT.
8. Durante la incubación, usando una barrera hidrofóbica PAP pluma, dibujar dos cuadrados de 22 x 22 mm² en un limpia vidrio 25 x 75 mm², portaobjetos grueso 1 mm como se muestra en la Figura 3A.
   Nota: Diapositivas se pueden preparar antes de tiempo.
9. Pipeta de 45 – 50 μl de sacarosa 100 mM sobre un portaobjetos limpio y transferir un par de ovarios a la gota.
10. Con los extremos afilados de dos agujas de 27 G, embromar aparte los ovarios para liberar las células en la solución de sacarosa. Con pinzas, quite los pedazos grandes de ovario y Pipetear cuidadosamente la solución de sacarosa para dispersar las células.
11. Lugar 40 μl de solución de fijación (1% paraformaldehido (PFA), detergente de 0.2% (véase Tabla de materiales), pH 9.2) en cada plaza de la corredera preparada. Con una punta de pipeta de 200 μL, distribuir uniformemente la solución fijador sobre la superficie del portaobjetos.
12. Pipetear 20 μl de la mezcla de sacarosa en cada cuadrado de la diapositiva que contiene el fijador.
    Nota: Esto equivale a usar un par de ovarios por diapositiva.
13. Incubar los portaobjetos en cámara húmeda cerrada durante la noche a temperatura ambiente.
    Nota: La incubación durante la noche puede variar alrededor de (12-15 horas) a temperatura ambiente.
14. Abra la tapa de la cámara y deje que el portaobjetos se seque al aire completamente.
15. Lavar los portaobjetos en una jarra de Coplin conteniendo 50 mL de solución de agente humectante-PBS 0.4% (véase Tabla de materiales) por 2 min, secar al aire y proceder al Protocolo de immunolabelling (paso 6).
    Nota: Es posible guardar las diapositivas a-80 ° C para su uso posterior, pero esto varía en función de la proteína de interés. Para obtener resultados óptimos proceder inmediatamente al protocolo immunolabelling (paso 6).

2. metafase I colección de ovocitos

1. Para maximizar el número de folículos antrales aislada de cada ratón, inyectar intraperitonealmente ratones hembra Virgen sexualmente maduros con 5 UI de gonadotropina de suero de yegua preñada (PMSG gonadotropina coriónica también conocido como equina (eCG)).
   Nota: Para el rendimiento óptimo de ovocitos, ratones deben ser 1 a 3 meses de edad, como el número de ovocitos cosechados disminuirá con la edad. Para preparar la PMSG, disolver botella de 5.000 UI en 100 mL de PBS estéril (5 mL de U/0.1) tienda alícuotas de un solo uso de 600 μL en-20 ° C.
2. Después de 44 a 48 h, preparar medio de colección, mínimo esencial medio alfa (MEMα) suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS) y 3 mg/mL albúmina sérica bovina (BSA; MEMΑ/BSA/FBS). Esterilizar los medios de comunicación a través de un filtro de poro de 0.2 μm. Decantar el 2,5 mL de MEMα/BSA/FBS medio en un recipiente de vidrio por ratón y caliente a 37 ° C en un incubador de 5% CO₂ .
   Nota: Otra colección y medios de cultivo comercialmente disponibles (M2 y M16) son también de uso general.
   Atención: Aconsejamos quitar platos de cultura de la incubadora 5% CO₂ , uno en una hora de duración limitada minimizar la exposición al aire ambiente durante los pasos de manipulación.
3. Sacrificar a los ratones mediante dislocación cervical o CO₂ asfixia según las pautas IACUC.
4. Abrir la cavidad de abdominopelvic con tijeras estériles, haciendo una abertura en forma de V grande. Con unas pinzas, desplaza los intestinos hacia la cabeza del ratón. Localizar cada cuerno uterino; los ovarios son actual próximo a la caja torácica. Sostenga el oviducto con pinzas finas y cortar a la grasa superior al ovario con tijeras de disección (figura 4). Continúe oprimiendo el oviducto y con otro juego de Pinzas finas suelte el ovario de la bursa y el lugar en el recipiente de colección que contiene medio de MEMα/BSA/FBS.
   Nota: Como en el paso 1, es imprescindible mantener los ovarios a 37 ° C y se mantiene a 5% CO₂. Una incubadora de fliptop enganchada a la mezcla de 5% CO₂ puede utilizarse para permitir el óptimo mantenimiento de la temperatura y niveles de CO₂ . Además, una etapa de vidrio temperatura regulada puede usarse también para mantener la temperatura durante la manipulación de ovocitos.
5. Utilizando una jeringa de 1 mL con una aguja de calibre 27 o tamaño similar, liberar complejos de ovocito cumulus manualmente pinchando los grandes folículos antrales.
6. Mientras observa a través de un microscopio de disección, recoger ovocitos organizado por el GV utiliza una pipeta de vidrio de boca operada o capilar o una manual micrómetro-jeringa (figura 5). Sólo recoger óvulos que se liberan de folículos antrales. GV ovocitos tienen un diámetro de aproximadamente 90 μm. GV ovocitos puede ser rodeados por 2-3 capas de células granulosas y tienen un diámetro total de alrededor de 200 μm.
7. Ovocitos en un vidrio de reloj limpio o una placa de la pozo 9 que contiene medio de MEMα/BSA/FBS por 6 h para llegar a la metafase de la cultura que a 37 ° C en un incubador de 5% CO₂ .
8. Proceda al paso 4.

3. colección de ovocitos metafase II (MII)

1. Para maximizar ovocitos aislados de cada ratón, inyectar intraperitonealmente ratones hembra Virgen sexualmente maduros con 5 UI de PMSG. Después de 44 a 48 h, inyectar por vía intraperitoneal con 5 UI de gonadotropina coriónica humana (hCG).
   Nota: Para el rendimiento óptimo de ovocitos, ratones deben ser 1 a 3 meses de edad, como el número de ovocitos cosechados disminuirá con la edad. Para preparar el hCG, disolver una botella de 10.000 U en 200 mL de PBS (5 mL de U/0.1). Almacenar en alícuotas de un solo uso de 600 μL en-20 ° C.
2. Después de 12-14 hrs, preparar medio de colección MEMα/BSA/FBS, como se describe en el paso 2.2, anteriormente.
3. Sacrificar a los ratones mediante dislocación cervical o CO₂ asfixia según las pautas IACUC.
4. Abrir la cavidad de abdominopelvic con tijeras estériles, haciendo una abertura en forma de V grande. Con unas pinzas, desplaza los intestinos hacia la cabeza del ratón. Localizar cada cuerno uterino, los ovarios son actual próximo a la caja torácica. Sostenga el oviducto con pinzas finas y cortar a la grasa superior al ovario con tijeras de disección (figura 4). Luego quitar el ovario y oviducto y coloque un plato de colección que contiene medio de MEMα/BSA/FBS.
   Nota: Como en los pasos 1 y 2, es imprescindible mantener los ovarios a 37 ° C y se mantiene a 5% CO₂. Una incubadora de fliptop enganchada a la mezcla de 5% CO₂ puede utilizarse para permitir el óptimo mantenimiento de la temperatura y niveles de CO₂ . Además, una etapa de vidrio temperatura regulada puede usarse también para mantener la temperatura durante la manipulación de ovocitos.
5. Utilizando una jeringa de 1 mL con una 27 G (o tamaño similar) o afiladas pinzas, rasgar un agujero en la ampolla del oviducto a soltar de los ovocitos en MII.
   Nota: Tenga cuidado de no dañar los ovocitos en la ampolla. La ampolla aparece hinchada y transparente que los ovocitos son visibles (figura 4).
6. Cosechar ovocitos MII de la ampolla del oviducto en una nueva placa con medio de colección, utilizando una pipeta de vidrio de boca operada o tubo capilar o una manual micrómetro-jeringa (figura 5).
7. Proceda al paso 4.

4. ovocito desollamiento y el retiro de la Zona pelúcida

1. Preparar 300 UI/mL de hialuronidasa en medio MEMα suplementado con 3 mg/mL de BSA para raspar ovocitos de rodear células del cúmulo (2.5 mL/ratón) en un vidrio de reloj y a 37 ° C, 5% CO₂.
   Nota: Eficacia de hialuronidasa disminuye agudamente después de 1 h de preparación. Para ovocitos MII, no se requiere tratamiento de hialuronidasa.
2. Exponen complejos ovocito-cumulus cell 300 UI/mL de hialuronidasa en MEMα/BSA durante 3 minutos para raspar ovocitos de rodear células del cúmulo.
   PRECAUCIÓN: No exceda los 3 minutos de exposición a la hialuronidasa, dañará los ovocitos.
3. Lavar los ovocitos, transferencia de ovocitos a una fresca y caliente plato medio MEMα/BSA. Con una pipeta de vidrio boca operada o capilar (ligeramente más grande que el diámetro del ovocito, que es aproximadamente de 90 μm), pipetear los complejos para arriba y hacia abajo para separar totalmente las células del cúmulo. Permita que los ovocitos recuperar en la incubadora mientras se prepara para el siguiente paso.
4. Calentar la solución ácida de Tyrode, MEMα y la BSA y los medios de comunicación de Waymouth a 37 ° C (500 μl/ratón). Lugar 300 μL en cada pocillo de las placas de vidrio 9-bien.
5. Para remover la zona pelúcida (ZP) transferencia de 5 a 10 ovocitos en la solución de Tyrode. Exponga los ovocitos para solamente 30-45 s a la solución.
   Nota: Muy poca exposición a la solución no elimina el ZP totalmente, que evitará que los ovocitos una explosión y los cromosomas se extienda. Exposición excesiva al dañar y matar el ovocito. Viendo el disolver de ZP bajo el microscopio de disección puede ayudar en la optimización de tiempo de exposición.
   PRECAUCIÓN: Utilizar solución de Tyrode fresca es crítica, como su función disminuye con la edad. Usar un pozo fresco de solución de Tyrode para cada grupo de ovocitos tratadas para asegurar la digestión uniforme de la ZP.
6. Inmediatamente después del retiro de ZP, lave los ovocitos por transferencia en caliente medio MEMα/BSA/FBS. Repita este paso de lavado.
   Nota: Tenga cuidado al transferir, como ovocitos se pegan juntos y a la pipeta de vidrio o capilar eliminación siguiente de la ZP. Mojar previamente la pipeta de vidrio o tubo capilar en medio de Waymouth minimizará ovocitos pegadas.
7. Transferencia y permitir que los ovocitos recuperar durante 30 minutos en medio de Waymouth a 37 ° C en un incubador de 5% CO₂ .
8. Proceda al paso 5.

5. MI y MII de ovocitos cromatina

1. Usando una pluma PAP, dibuje un rectángulo de 11 x 44 mm² en el portaobjetos de cristal como se muestra en la figura 6A.
2. Cubrir el portaobjetos con una fina capa de fijador (paraformaldehído al 1%, 0.2% Triton-X 100 de H₂O, pH 9.2) Pipetear 100 μl de fijador en la diapositiva y mecer la corredera hacia adelante y hacia atrás. Puntee la diapositiva para deshacerse de exceso fijador.
3. Recoger entre 5 a 10 ovocitos con una aguja de pipeta de boca pequeña con como poco posible y arrastre la aguja en línea a través de la diapositiva de cubierta fijador al depositar los ovocitos desde 1 cm encima de la diapositiva en la solución fijadora. Realizar este paso usando un microscopio de disección para asegurar que los ovocitos han sido depositados y que han irrumpido.
   Nota: Los ovocitos deben estallar inmediatamente en la diapositiva. La altura a la que los ovocitos son depositados impacto del grado de difusión de la cromatina. Ver resultados representativos en la figura 6 para obtener más detalles.
4. Incube los portaobjetos a temperatura ambiente en una cámara humidificada cerrada durante la noche para permitir que la cromatina se adhieran.
5. Deje que el portaobjetos se seque completamente y enjuagar diapositivas en una jarra de Coplin conteniendo 50 mL de 0.4% humectante-H₂O, pH 8.0.
6. Proceda al paso 6.

6. Immunolabelling

1. Preparar el tampón de dilución de anticuerpo (Bad) se describe en la tabla 1.
2. Preparar dos frascos Coplin conteniendo 50 mL de solución tampón (WB) de lavado (10% Bad diluido en PBS) y una jarra de Coplin con solución detergente WB y 0.05% de 50 mL (por ejemplo, Añadir 250 μl de detergente al 10% 50 ml WB).
3. Lave las diapositivas que fueron elaboradas en la sección 1 y 5 del presente Protocolo por 10 min en una jarra de Coplin conteniendo 50 mL de WB.
   PRECAUCIÓN: No deje que los portaobjetos seco en cualquier momento durante el immunolabelling.
4. Lave los portaobjetos por 10 min en el recipiente frasco conteniendo 50 mL WB y solución detergente al 0,05%. Luego, lave los portaobjetos en la jarra de Coplin restante que contiene 50 mL de solución de WB por 10 min.
5. Tap off exceso líquido y la tapa porta con 100 μl de anticuerpos primarios seleccionados diluido en ADB. Incubar a 4 ° C durante la noche en una cámara húmeda cerrada.
   Nota: La incubación puede acortarse a 2 a 3 horas a 37 ° C. Utilizar volúmenes menores de anticuerpos (p. ej., 50 μL) al cubrir el portaobjetos con un cubreobjetos o parafilm.
6. Enjuague los portaobjetos en un recipiente frasco con 50 mL de 0.2% solución humidificante-PBS, pH 8.0.
7. Repita los pasos de 6.2 a 6.5.
8. Tap off exceso líquido y la tapa porta con 100 μl de anticuerpos secundarios seleccionados diluido en ADB. Incube los portaobjetos 1 a 2 horas a 37 ° C en cámara húmeda cerrada.
9. Lavar el portaobjetos 2 veces durante 10 minutos en frascos Coplin conteniendo 50 mL de 0.2% solución humectante-PBS, pH 8.0.
10. Lavar el portaobjetos 2 veces durante 5 minutos en frascos Coplin conteniendo 50 mL de solución de agente humectante-H₂O 0,2%, pH 8.0.

7. montaje de diapositivas

1. De la profase la cromatina se separa preparado en el paso 2, agregar 100 μl de medio de montaje que contiene 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1.5µg / mL). Para MI y MII cromatina extensiones preparadas en paso 5, agregue 50 μl de medio de montaje con DAPI (1.5µg / mL). Suavemente Seque lejos exceso de líquido.
2. Coloque un cubreobjetos de 22 x 60 mm en la parte superior y selle con esmalte de uñas claro. Guarde en una caja de diapositivas a 4 ° C o -20 ° C hasta evaluación por microscopía de fluorescencia.
   Nota: Toque ligeramente el cubreobjetos para eliminar el exceso de medio de montaje antes del sellado con esmalte de uñas.

Resultados

Hemos descrito dos técnicas de visualización y evaluación de los cromosomas meiotic en ovocitos. La primera técnica es atendida para evaluar la progresión de la profase en ovarios embrionarias y neonatales. Profase la cromatina propagación preparados son muy valiosos para la visualización de numerosos procesos dinámicos durante la meiosis, incluyendo cromosoma emparejamiento, synapsis y desynapsis, recombinación homóloga y remodelación de cromosoma epigenético. Aquí, hemos demostrado la u...

Discusión

Preparaciones de extensión de cromatina permiten a los investigadores estudiar cronológicamente meiosis mamífera hembra y la localización dinámica de las proteínas implicadas. Las extensiones de cromatina embrionaria y neonatal permiten análisis cercano de los acontecimientos a lo largo de la profase meiótica. Metafase I y metafase II se separa de la cromatina puede utilizarse para distinguir solo hermana chromatids de emparejado hermanas y cromosomas homólogos emparejados, así como evaluar la ploidía. En comparación, el...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10X Solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7.4	Calidad Biológico	119-069-161
placas de Petri de 60 mm x 15 mm	Denville	T1106
Placas de Petri de 35 mm x 12 mm	Denville	T1103
Pinza fina	VWR	300-050
Tijeras de microdisección	Ted Pella	1340
Disección  tijeras, punta afilada, 41/2"	VWR	82027-578
Reloj de cristal cuadrado 1 5/8	Carolina Biological Supply Company	742300	Autoclave antes de cada uso
Sacarosa	Sigma	S8501
Citrato Trisódico Dihidratado		Sigma S1804
EDTA	Sigma	E6758
Trizma Base	Sigma	T1503
1,4-Ditiotreitol (DTT)	Sigma	646563	Añadir al tampón hipotónico inmediatamente antes de usar
50x Inhibidor de la Proteasa	Roche	11873580001	Añadir al tampón hipotónico inmediatamente antes de usar
Jeringa de turberculina con aguja (1cc, 27 G x 1/2 in)	Becton, Dickinson (BD)	309623
Correderas de vidrio ultra escarchado con sello de oro (25X75mm, 1mm de grosor)	Thermo	3063-002
Bolígrafo Super PAP, grande (bloqueador de líquidos)	Ciencias de la Microscopía Electrónica (EMS)	71310
16% Paraformaldehído acuoso	Ciencias de la Microscopía Electrónica (EMS)	15710
Triton X-100	Sigma	T8787	Detergente en manuscrito
Cámara de humedad de inmunotinción	Evergreen	240-9020-Z10
Frascos Coplin	Fisher	08-815
Photo-flo 200	Ciencias de la Microscopía Electrónica (EMS)	74257	Agente humectante en manuscrito
Gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG)	Sigma	G4877	Almacene alícuotas a -20C
Gonadotropina coriónica humana (HCG)	Sigma	C0434	Almacene alícuotas a -20C
Placas puntuales PYREX con nueve cavidades cóncavas	Fisher	13-748B	Autoclave antes de cada uso
Capilar	de vidrio Fisher	22260943	Para la fabricación de agujas de recolección de ovocitos
Marca Parafilm M	Sigma	BR701501	Para la fabricación de agujas de recolección de ovocitos
Tubo de caucho de látex (3,2 mm de diámetro interior x 6,4 mm de diámetro exterior)	Fisher	14-178-5B	Para la fabricación de agujas de recolección de
ovocitosTubo de caucho de látex (6,4 mm de diámetro interior x 11,1 mm de diámetro exterior)	Fisher	14-178-5D	Para la fabricación de agujas de recolección de ovocitos
Revólver de caucho de silicona flexible, boquilla de plástico duro y 15 pulgadas de tubo de látex	Sigma	A5177-5EA	Para la fabricación de agujas de recolección de ovocitos
Cabeza de micrómetro Mitutoyo	Mituoyo	150-208	Para la fabricación de agujas de recolección de ovocitos
Jeringa 5 mL	BD Biosciences	309646	Para la fabricación de agujas de recolección de ovocitos Filtro de
jeringa 0.45 μ m filtro	Corning	431220	Para la fabricación de agujas de recogida de ovocitos
Pipeta Pasteur de vidrio 5 3/4"	Fisher	13-678-6A	Para la fabricación de agujas de recogida de ovocitos
83 x 0,5 mm punta de pipeta	Denville	P3080	Para la fabricación de agujas de recogida de ovocitos
α-MEM	Invitrogen	11415049
los medios de Waymouth Life	Technologies
Suero fetal bovino	Fisher A3160602
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma	A3311	Para medios de cultivo de ovocitos
500ml unidades de filtro 0.22um	Denville	F5227
Hialuronidasa	Sigma	H3506
Tyrode' Solución Sigma		T1788	Almacene las alícuotas a -20 °C
Suero de caballo	Sigma	H-1270	Para ADB/tampón de lavado
Albúmina de suero bovino (BSA)	Sigma	A1470	Para ADB/tampón
de lavado VECTASHIELD Medio de montaje antidecoloración con DAPI	Vector Labs	H-1200
Portaobjetos de cubierta de microscopio (22 mm x 60 mm)	Fisher	12-544-G
Esmalte de uñas transparente	Amazon	N/A
Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
Microscopios
SteREO Discovery.V8	Zeiss	495015-0001-000
Observador Z1	Zeiss
Name	Company<	strong>Número de catálogo	Comentarios
Anticuerpos primarios
Mouse anti-MLH1	Life Technologies	MA5-15431 Factor de	dilución- 1:100
Conejo anti-SYCP1	Life Technologies	PA1-16763	Factor de dilución- 1:1000
Cabra anti-SCP3	Santa Cruz	sc-20845	Factor de dilución- 1:50
Proteína anti-centrómero humana	Anticuerpos incorporados	15-235	Factor de dilución- 1:100
Conejo anti- TOPOII	Abcam	ab109524	Factor de dilución- 1:100
Ratón anti-histona H4 (di metilo K20, tri metilo K20)	Abcam	ab78517	Factor de dilución- 1:500
Conejo anti-Rec8	Cortesía de la Dra. Karen Schindler	N/A	Factor de dilución- 1:10,000
Nombre	Company	Número de catálogo	Comments
Anticuerpos secundarios
Burro anti-cabra IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugado	Thermo-Fisher Scientific	A-11057	Factor de dilución- 1:500
Burro anti-ratón IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugado	Thermo-Fisher Scientific	A-21202	Factor de dilución- 1:500
Burro anti-conejo IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugado	Thermo-Fisher Scientific	A-31573	Factor de dilución- 1:500
Cabra anti-ratón IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugado	Thermo-Fisher Scientific	A-11004	Factor de dilución- 1:500
anti-humano IgG (H+L) Anticuerpo secundario de adsorción cruzada, Alexa Fluor 488	Thermo-Fisher Scientific	A-11013	Factor de dilución- 1:500
Cabra anti-conejo IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugado	Thermo-Fisher Scientific	A-11011	Factor de dilución- 1:500