En este informe, se destacan las ventajas de las culturas organotypic y disociadas cultivos primarios de ganglios de raíz dorsal derivadas de ratón para investigar una amplia gama de mecanismos asociados a la interacción neuronal-glial, neuroplasticidad, neuroinflamación y la respuesta a la infección viral.
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Artículo de método
Ratón adulto DRG explante y disociado modelos celulares para investigar respuestas a insultos ambientales incluyendo infección Viral y la neuroplasticidad
En este artículo
Resumen
Resumen
Este protocolo describe un modelo ex vivo de raíz dorsal de ratón derivados ganglios (DRG) explante y en vitro derivados de DRG Co cultura de disociado de las neuronas sensoriales y las células glial satélite. Estos son modelos versátiles y útiles para investigar una variedad de respuestas biológicas asociadas con condiciones fisiológicas y patológicas del sistema nervioso periférico (PNS) que van desde la interacción neuronal-glial, neuroplasticidad, neuroinflamación y la infección viral. El uso de explantes de DRG es científicamente ventajoso en comparación con las células simples modelos por múltiples razones. Por ejemplo, como una cultura organotypic, explante GRD permite a transferencia ex vivo de toda una red neuronal como el microambiente extracelular que juegan un papel significativo en todas las funciones neuronales y gliales. Además, DRG explantes pueden también mantener ex vivo para varios días y las condiciones de cultivo pueden ser perturbadas como deseado. Además, el DRG cosechado puede ser disociado más en una cultura Co en vitro de neuronas sensoriales primarias y células glial satélite para investigar la interacción neuronal-glial, neuritogenesis, cono axonal interacción con el medio extracelular microambiente y más general, cualquier aspecto asociado con el metabolismo neuronal. Por lo tanto, el sistema de DRG-explante ofrece una gran flexibilidad para estudiar una amplia gama de eventos relacionados con las condiciones biológicas, fisiológicas y patológicas de una manera rentable.
Introducción
En este manuscrito, se presenta un método para obtener un modelo ex vivo de organotypic de un sistema de modelo de ratón derivado DRG como un microambiente como tejido conservado para investigar una amplia gama de respuestas biológicas a los insultos PNS desde neuronal-glial interacción, neuroplasticidad, marcadores inflamatorios, infección viral. Además, hemos desarrollado un protocolo para crear una cultura co primaria de derivados de DRG solo neuronas sensoriales y las células satélite.
El DRG son gris-materia-unidades satélite situadas fuera de sistema nervioso central (SNC) a lo largo de las raíces espinales dorsales de los ne....
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Protocolo
Todos los procedimientos incluyendo el uso de los animales han sido aprobados por los protocolos de aprobado por la Junta de revisión institucional (IACUC Midwestern University).
1. recolección de DRG de embriones de ratón
-
Eutanasia a los ratones adultos por método de asfixia (CO2) seguidos de la decapitación. Inmediatamente proceder a extirpar quirúrgicamente de la columna vertebral.
- Exponer la columna vertebral por el corte hacia abajo de la capa de la piel dorsal con unas tijeras finas. Aislar la columna vertebral por el corte a través de las costillas a ambos lados de la columna y el sacr....
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Resultados
Múltiples aspectos de la interacción de la neuroplasticidad y la neurona y el medio ambiente se pueden investigar mediante DRG y un modelo de cultura de célula disociados. Comenzamos los estudios aislando un explante de GRD y las células disociadas derivadas de DRG como esquemáticamente representadas en la figura 1. Modelos de células y tejidos pueden ser analizados usando una variedad de técnicas moleculares como la inmunofluorescencia, Western blot, ensayos de genómicos y otras técnicas an.......
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Discusión
El modelo ex vivo DRG es muy útil para investigar una amplia gama de eventos como interacción neurona-glia, así como el efecto del microambiente en ambos el metabolismo neuronal y glial37. Además, el DRG-modelo podría utilizarse como una herramienta rentable para abordar preguntas relevantes sobre el mecanismo patogénico y asociado marcadores desarrollando ex vivo sistemas para fase aguda crónica y latente de la infección o de una determinada enfermedad. Además, una biblioteca de.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada a la divulgación.
Agradecimientos
Agradecemos sinceramente las instalaciones centrales de la proyección de imagen en Midwestern Universidad (Uth) y el grupo de estudiantes [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo y Casey Sigerson] por sus contribuciones en cultivo celular y trabajo de imagen. Este trabajo de investigación fue apoyado por donaciones de la Uth Intramural fondos fondos de puesta en marcha M.F. e investigación a V.T.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ratones adultos NIH/ | Suiza Harlan Laboratories Placa | ||
| Petri de 35 mm | Tratamiento de células | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | de proteínas gelatinosas |
| F12 | Media Gibco | 11765-054 | *Parte de SFM |
| Media Colagenasa IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Tripsina | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| Filtro de 0,22um | BD Falcon | 352350 | |
| Medios neurobasales | Gibco | 10888-022 | |
| B27 suplemento | Gibco | 17504-044 | Suplemento para el cultivo neuronal |
| Antibióticos PSN | Gibco | 15640-055 | *Parte de los medios SFM Mezcla de antibióticos |
| L-glutamato | Sigma-Aldrich | G7513 | *Parte de los medios de SFM |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Factor de crecimiento nervioso |
| Portaobjetos recubierto de laminina | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrata | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | ||
| Anticuerpo anti-B-tubulina | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilución |
| Anticuerpo anti-periferona | Millipore | AB1530 | dilución 1:1000 |
| Colorante Hoechst | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µ M concentración final |
| Sulfato antiheparán | US Biológico | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anticuerpo anti gD | Virostat | 196 | dilución 1:10 |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Parte de los medios SFM |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Parte de los medios SFM |
| Glucosa | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Parte de los medios SFM |
| KIT (Insulina-transferrina-Selenio-A) | Gibco | 51300-044 | *Parte de los medios SFM |
| Vitamina-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Parte de los medios SFM |
| Putrescina | Sigma-Aldrich | P7505 | *Parte de SFM media |
| 488 (anti-ratón de cabra) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (anti-conejo de cabra) | Laboratorios de investigación inmunológica de Jackson | 111-165-003 | |
| Suero de cabra normal | Vector | S-1000 | |
| Solución de Formalina | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence |
| mount Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
Referencias
- Muratori, L., et al. Generation of new neurons in dorsal root Ganglia in adult rats after peripheral nerve crush injury. Neural Plast. , 860546(2015).
- Dellarole, A., Grilli, M. Adult dorsal root ganglia sensory neurons express the ea....
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Reimpresiones y permisos
