Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Syntese av Functionalized 10-nm Polymer-belagt gull partikler for endotelet målretting og narkotika-leveranser

Published: January 15, 2018 doi: 10.3791/56760
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1,2,3, 1,4,5
1Department of Chemical Engineering, Northeastern University, 2Nanomedicine Science and Technology Center, Northeastern University, 3Department of Physics, Northeastern University, 4Departments of Bioengineering, Northeastern University, 5Department of Neuroscience, Albert Einstein College of Medicine

Summary

Vi beskriver en metode for å syntetisere biokompatible 10-nm gull nanopartikler, functionalized av belegg poly-etylenglykol på overflaten. Disse partiklene kan være brukt i vitro i vivo for å levere therapeutics til nanoskala mobilnettet og ekstracellulære områder som er vanskelige å finne med konvensjonelle hydrogenion størrelser.

Abstract

Gull nanopartikler (AuNPs) har blitt brukt mye i medisinsk forskning på grunn av sin størrelse, biocompatibility og modifiserbare overflaten. Spesifikk målgruppe og stoffet levering er noen av programmene i disse AuNPs, men endothelial ekstracellulære matriser defensive egenskaper hemme partikkel opptak. For å løse dette problemet, beskriver vi en syntese metode for ultrasmall gull nanopartikler å forbedre vaskulær levering, med passelig funksjonelle grupper og polymer lengder for ytterligere justeringer. Protokollen gir 2.5 nm AuNPs som er avkortet med tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium chloride (THPC). Utskifting av THPC med hetero-fungerende polyetylenglykol (PEG) på overflaten av AuNP øker etter radius til 10.5 nm samtidig tilby ulike funksjonsgruppene på overflaten. Den siste delen av protokollen inkluderer et valgfritt tillegg av en fluorophore som tillater AuNPs å bli visualisert under fluorescens spore hydrogenion opptak. Dialyse og lyophilization ble brukt til å rense og isolere i AuNPs. Disse fluorescerende nanopartikler kan visualiseres i vitro og i vivo eksperimenter på grunn av den biokompatible PEG malematerialer og fluorescerende sonder. I tillegg størrelse rekke disse nanopartikler gjengi dem en ideell kandidat for undersøkelser av glycocalyx uten å forstyrre normal blodkar-funksjonen, som kan føre til bedre levering og therapeutics.

Introduction

Nanopartikler er brukt narkotika-leveranser og bildebehandling for sin evne til å navigere gjennom kroppen for å nå målet områder av interesse1,2. Partiklene kan akkumuleres i svulster via er lekk blodkar eller lokalisere hvor en mål ligand overexpressed og utsatt. Gull, spesielt, har blitt et vanlig hydrogenion materiale på grunn av sin unike kjemiske og fysiske egenskaper som påvirker transport og utgivelsen av therapeutics3. Gold er en effektiv hydrogenion materiale fordi overflaten kan endres for å binde til thiols og har høy biocompatibility på grunn av sin lav toksisitet4. AuNPs er i stand til å bli bærere av store biomolecular narkotika og har vært vellykket i å levere peptider nucleic syrer og proteiner, slik at AuNPs å være gunstig for målretting2,4.

Dessverre vært hydrogenion stoffet levering effektiviteten hemmet av den negativt ladde glycocalyx, som er den ekstracellulære strøk på membranen av mest pattedyrceller og pore størrelser opptil 7 nm5,6. Denne porestørrelse er mindre enn de fleste hydrogenion narkotika operatører, som har typisk diameter fra 50-200 nm. Under sykdom forhold blir disse glycocalyx porene større på grunn av fornedrelse, øke permeabiliteten gjennom til endotelceller. De fleste nanopartikler er imidlertid fortsatt for stor til å dra nytte av denne strukturelle endringen i glycocalyx. En implikasjon av dette filstørrelse mismatch er at konvensjonelt størrelse partikler ikke samarbeide godt med endotelceller som blodkar. Dette påvirker levering av intravenøst administrert partikler i endotelet, og kan også sies om partikkel transport gjennom blod hjernen barriere7,8,9,10.

En tilnærming for å bekjempe dette problemet er å benytte mindre partikler passerer gjennom små porene i glycocalyx. Her syntetisere vi en 10,5 nm ultrasmall gull hydrogenion, som normalt bør bli avskrekket av intakt, sunt glycocalyx. Når glycocalyx begynner å bli svekket, bør hydrogenion lett trenge cellene til økende porestørrelse. Protokollen i notatet detaljer en syntese av ultrasmall gull belagt med PEG, som øker biokompatibilitet og reduserer systemisk klaring4. PINNEN kan også inneholde flere typer funksjonelle grupper, åpner muligheter for Bøyning av målretting ligander, fluorophores og therapeutics. Tidligere tyder publiserte resultatene på at disse ultrasmall nanopartikler tendens til å bli tatt opp mer gunstig i områder av forstyrret endotelial glycocalyx funksjonen selv uten noen aktive målretting4,11. Dette angir gjennomførbarhet og viktigheten av å utnytte partikler av riktig størrelse for levering-programmer. Følgende protokollen presenterer syntese, rensing og karakterisering av PEG-belagt AuNPs (PEG-AuNP), med diskusjonen i skreddersy funksjonelle grupper og conjugations for andre programmer.

Protocol

1. forberedelse eller anskaffelse av lager løsninger (lagres ved romtemperatur eller frosset før bruk)

  1. Forberede en 1 M natriumhydroksid (NaOH) lagerløsning oppløsende 400 mg NaOH i 10 mL ultrapure vann ved romtemperatur og blanding materialer også.
    Merk: Ultrapure vann er definert som vann uten urenheter som partikler, bakterier, nucleases, ioner eller spor av organiske. En rensing system brukes til å få ultrapure vannet, som resulterer i sin resistivitet av opptil 18.2 mΩ·cm, som indikerer en lav anionic forurensning. Bruken av kommersielt tilgjengelige ultrapure flaskevann anbefales ikke. Heretter kan vil denne ultrapure vann bli referert til som vann, med mindre annet er angitt.
  2. Forberede en 6M NaOH lagerløsning ved oppløsning 2.4 g av NaOH i 10 mL vann, og lagre løsningen ved romtemperatur.
  3. Forbered en 250 mM lagerløsning chloroauric syre (HAuCl4) ved oppløsning 1 g tørket HAuCl4 i 10.16 mL vann. Fortynne 1 mL av 250 mM HAuCl4 med 9 mL vann for å få arbeide konsentrasjon av 25 mM HAuCl4. Lagre HAuCl4 løsningen ved romtemperatur.
  4. Forberede en 0.1 M karbonat buffer ved pH 8,8, ved oppløsning 84 mg natriumbikarbonat i 10 mL vann og justere pH til 8,8 ved å legge 6 M NaOH fra trinn 1.2. Lagre karbonat bufferen ved romtemperatur.
  5. Bland 20 mL tetrazolium sammensatte, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium salt (MTS), med en stabiliserende agent, phenazine ethosulfate (PES) (se Tabell for materiale). Lagre MTS/PES blandingen i dele (for maksimalt 10 fryse-Tin sykluser) på 20 ° C i mørket.

2. syntese av gull hydrogenion kjernene

  1. Forberede en utvannet THPC løsning ved å legge til 12 µL av 80% THPC i vann til 1 mL vann i et microcentrifuge rør ved romtemperatur.
  2. Sikre en 100-mL runde bunnen kolbe over midten av en magnetic røre plate. Hell 45 mL vann i flasken og røre vannet på 300 rpm med en liten egg-formet magnetic røre bar. Legg til 0,5 mL 1 M NaOH og 1 mL av fortynnet THPC løsning. Fortsett å røre reaksjonsblandingen godt i 5 minutter.
  3. Fortsett omrøring blandingen og legge 2 mL 25 mM HAuCl4 løsning. Fargen på blandingen endres fra gul til mørk brun innen sekunder, indikerer dannelsen av THPC avkortet AuNPs med negativ ladning. Rør blandingen for en ytterligere 15 minutter for å gi fullstendig dannelsen av gull kjernene.

3. tillegg av Polymer Corona rundt gull nanopartikler

  1. I 15 min perioden beskrevet i trinn 2.3, forberede PINNEN løsninger ved å løse opp hver av følgende i 1 mL vann 4 mL hetteglass: 30 mg NH2-PEG-SH; 7.5 mg m PEG-SH; 7.5 mg COOH-PEG-SH.
    Merk: De resulterende konsentrasjonene bør være 8.8 M NH2-PEG-SH, 3.75 M m-PEG-SH og 3.75 M COOH PEG-SH.
  2. Etter redusere omrøring hastigheten for løsningen i runde bunnen kolbe til 100 rpm, legge PINNEN avkortet løsninger til løsningen av THPC AuNPs dropwise. Fortsett å røre blandingen forsiktig over natten i romtemperatur, å sikre effektiv fjerning av THPC og utskifting av PINNEN.
  3. For de neste 72 h, bruke en 12-14 kDa molekylvekt cutoff cellulose membran til dialyze rørt blandingen mot en 4 L bøtte med vann rørt på 60 rpm. Binde endene av membraner av dialyse klipp og overføre løsningen via pipette.
    Merk: Denne dialyse prosessen med 12-14 kDa cutoff membran bare fjerner Ureagert pinne, THPC og andre kjemiske reaktantene, ved diffusjon langs en konsentrasjon gradient.
  4. For å opprettholde høy konsentrasjon gradient og fremme kontinuerlig diffusjon, endre vannet hver 2 h for første 6 h og hver 6-12 h for gjenværende 66 h.
    Merk: Hensikten med denne vann endre tidsplanen er å imøtekomme raske spredningen som skyldes tidlig utgangspunktet høy konsentrasjon i utvalget. Dialyse prosessen beskrevet ovenfor blader hydrogenion løsningen semi renset, fordi nanopartikler, precipitates, aggregater og andre store størrelse urenheter ikke kan passere gjennom porene i 12-14 kDa cutoff membranen.
  5. Filtrere semi renset hydrogenion løsningen i en 50-mL konisk tube bruke en 0,2 µm sprøyte filter for å fjerne de gjenværende precipitates, aggregater og andre store størrelse urenheter.
  6. Sett konisk røret i-80 ° C fryser og la renset PEGylated AuNP (PEG-AuNP) løsningen å fryse rundt 5 timer.
  7. Bruk en fryse tørketrommel for å lyophilize den renset PEG-AuNP.
  8. Lagre den tørr, renset PEG-AuNP på 4 ° C før bruk.

4. bøye Fluorophores bruker N-hydroxysuccinimide (NHS) Ester på NH2 grupper på PEG-AuNP

  1. Sikre en 50-mL runde bunnen kolbe over midten av en magnetic røre plate. Fylle kolbe med 18 mL vann og rør vannet 100 RPM bruker en egg-formet magnetic røre bar.
  2. Veie 2 mg lyofilisert PEG-AuNP i en 4 mL konisk tube, med en høy presisjon Borstemmaskin skala. Bruke et antistatisk pistol for å eliminere statisk ladning og klamrer seg av PEG-AuNP pulver til røret overflaten. Legg 2 mL vann til røret. Hell den 2 mL PEG-AuNP løsning i runde bunnen kolbe for ytterligere rekonstituering i totalt 20 ml vann. Fortsett å røre blandingen på 100 rpm bruker en egg-formet magnetic røre bar.
  3. Legg 1 mL av 0.1 M, pH 8,8 karbonat buffer på 20 mL rekonstituert AuNP i runde bunnen kolbe. Fortsett omrøring.
  4. Legge til 5 µL av 10 mg/mL fluorescerende NHS ester i dimethyl sulfoxide.
    Merk: Noen fluorescerende farge kan brukes i denne prosessen. Rør fluorescerende PINNEN over natten. Holde det ved romtemperatur og dekket i folie.
  5. For de neste 72 h, fjerne overflødig fluorophores ved hjelp av protokollen som beskrevet i trinn 3.3. Kort, dialyze rørt blandingen med en 4 L bøtte vann og en 12-14 kDa molekylvekt cutoff cellulose membran. Endre vannet hver 2t for første 6 h og hver 6-12 h for gjenværende 66 h.
  6. Få 1 mL av renset fluorescerende PEG-AuNP løsningen, som skal brukes for karakterisering beskrevet nedenfor i seksjon 5. Fryse og lyophilize gjenværende løsningen for å få fluorescerende nanopartikler i pulverisert form for lagring på 4 ° C, som beskrevet i trinnene 3.5-3.7.
  7. Bruke filtere 0,2 µm sprøyte sterilisere og fjerne alle potensielle precipitates når rekonstituert for celle kultur programmer.

5. karakterisering av fluorescerende pegylert gull nanopartikler

  1. Bruke overføring elektronmikroskop (TEM) å visualisere gull hydrogenion kjernen og kvantifisere størrelsene
    1. Slippe 10 µL av renset fluorescerende PEG-AuNP løsningen til et karbon belagt netting TEM rutenett.
    2. Etter 5 min, bruke filter papir å nøye veken bort overflødig væske fra kanten av TEM rutenettet til en film med fluorescerende PEG-AuNPs er forlatt bak.
    3. Vise fluorescerende PEG-AuNPs på 80 kV og en forstørrelse på 50.000-150, 000. Ta digitale bilder.
      Merk: Bare gull kjernen vil være synlig fordi PINNEN ikke er electron tett på TEM.
    4. Bruker en måling programvare, Angi målskalaen i sammenheng i skala-feltet. Beregne diameter på omkring 20 gull kjerner, og deretter bestemme gjennomsnittlig gull kjernen diameter.
      Merk: TEM tenkelig systemet automatisk plasserer en skala bar på de digitale bildene.
  2. Måling av etter hydrogenion størrelse ved hjelp av dynamiske lysspredning (DLS)
    1. Overføre 1 mg lyofilisert THPC-belagt AuNPs inn i et microcentrifuge rør ved hjelp av tilnærming som beskrevet i trinn 4.2. Overføre 1 mg lyofilisert PEG-AuNP i et separat rør. Legg 1 mL vann til hver tube og overføre hver AuNP løsning til en 1 mL klar plast.
    2. Plasser søppel i et DLS instrument og måle sfærisk etter diameter bruker partikkel analyserer programvaren som er bygget inn i DLS-systemet.
    3. Tegne målt etter diameter med et histogram-format.
      Merk: Histogrammet vil gruppere nanopartikler etter størrelse. Den største gruppen av nanopartikler vil avklare diameter som best beskriver størrelsen på AuNPs syntetisert i denne protokollen.
  3. Fluorometric fluorescens bekreftelse
    Merk: Samme utvalg og cuvette fra trinn 5.2 kan brukes til å måle fluorescerende signal.
    1. Fjerne cuvette fra DLS og sett inn en spectrofluorometer. Sett eksitasjon bølgelengden til 633 nm og lese den slippes ut fluorescensen signaliserer en bølgelengde rekke 650-800 nm.
    2. Bekrefte at toppen er ca 665 nm, som korrelerer til utslipp peak for NHS.
      NB: Tilpass eksitasjon og utslipp bølgelengdene ifølge fluorophore brukes i prosessen.
  4. MTS analysen11 å vurdere biocompatibility
    1. I en 96-brønns klart bunnen sterilt vev kultur behandlet plate, Pipetter 100 µL Dulbeccos endret Eagles middels (DMEM, supplert med 10% fosterets bovin serum og 1% penicillin/streptomycin) og 3.2 x 103 celler i hver brønn.
      Merk: I denne studien rotte fett pad endotelceller brukes. Totalt 21 brukes til å tillate 3 gjentak for hver av 7 forskjellige hydrogenion konsentrasjonen (se trinn 5.4.3 for bestemte konsentrasjoner av interesse).
    2. At cellene å vokse til confluency i luftfuktighet og 5% CO2 kontrollert Inkubatorer på 37 ° C11.
    3. Forberede personlige microcentrifuge rør, hver med 300 µL av DMEM med nanopartikler av ulike konsentrasjoner. Denne studien krever 7 forskjellige rør av DMEM med følgende PEG-AuNP konsentrasjonen: 0 µg/mL, 10 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL og 1000 µg/mL.
    4. Sug opp DMEM fra røret. Fyll brønnene i tre eksemplarer med 100 µL DMEM medietyper som inneholder 0, 10, 50, 100, 250, 500 eller 1000 µg/mL av AuNP.
    5. Lar celler og nanopartikler å co ruge for et bestemt tidsrom, her for 16 h.
    6. Nær slutten av inkubasjonstiden, tine MTS/PES blandingen fra trinn 1.5.
    7. Etter inkubasjon Sug opp DMEM og suspendert, løst tilknyttet nanopartikler fra brønnene. Legg 100 µL av ferske DMEM med 20 µL av MTS/PES løsning å få 1:5 MTS/PES DMEM forhold i henhold til produsentens protokollen. Inkuber cellene MTS/PE på 37 ° C i 2 timer.
      Merk: 2t inkubasjon nå bestemmes av metabolske aktiviteten av endotelceller og kan økes til opptil 4 h for andre celletyper. Innen 2 timer perioden, er MTS metaboliseres endotelceller i farget formazan som blander med DMEM. Biokompatibilitet av PEG-AuNP og sannsynligheten for cellen levedyktighet vil bli demonstrert med flere fargede formazan. Toksisitet av PEG-AuNP og sjansen for at cellene dør vises med mindre intens farge.
    8. Utføre kolorimetrisk analyse av hver brønn ved å lese absorbans ved 492 nm med en kompatibel plate leseren.
    9. Hver hydrogenion konsentrasjon, beregne gjennomsnitt absorbansen tre eksemplarer absorbansen verdier. Dele gjennomsnittlig absorbansen verdien fra snitt absorbansen i brønner som inneholder 0 µg/mL nanopartikler.
      Merk: Disse brønnene som inneholder ingen AuNPs tjene som kontroller for å beregne prosentandel celle levedyktighet svar hydrogenion behandling administrert i andre brønner.
  5. Fluorescens AC confocal mikroskopi vurdering av hydrogenion opptak i tilhenger endotelceller intakt eller dysfunksjonelle glycocalyx11
    1. Frø 1.0 x 104 celler/cm2 rotte fett pad endotelceller på sterilt 12 mm glass coverslips og mate celler med DMEM med 10% fosterets bovin serum og 1% penicillin/streptomycin. At cellene å vokse til full confluency fuktighet og CO2 kontrollert Inkubatorer på 37 ° C, i ca 3 dager.
    2. Legg behandlinger for å endre glycocalyx, hvis aktuelt. For eksempel forringer 2 h behandling av kultivert endotelceller med 2,5 x 10-6 IU heparinase III enzym glycocalyx av spesielt cleaving sin heparan sulfate komponent.
      Merk: Sunn glycocalyx kan modelleres ved å dyrke endotelceller som beskrevet i trinn 5.5.1 uten tilsetning av nedbrytning enzymer.
    3. Med endotelial glycocalyx intakt eller gjengis dysfunksjonelle, ruge endotelceller med fluorescerende AuNPs på 550 µg/mL 16 h eller andre ønsket tid.
    4. Forsiktig vaske cellene med 2 mL 37 ° C 1% bovin serum albumin i fosfat bufret saltvann (PBS, som inneholder 100 mg/L kalsium og magnesium 100 mg/L). Senk cellene i 2 mL 2% paraformaldehyde og 0,1% glutaraldehyde i PBS, og at cellene å fastsette for 30 min ved romtemperatur.
    5. Fjerne aldehyd fikse løsningen og vask cellene med romtemperatur PBS for tre 5-min sykluser.
    6. Før primære antistoff, utsette endotelceller for 2% geit serum i PBS i 30 min ved romtemperatur å blokkere ikke-spesifikk bindende. Cellene må være fullt dekket av blokkering løsningen.
    7. Inkuber endotelceller over natten med 1% anti-heparan sulfate primære antistoff 2% geit serum i PBS i 4 ° C til å merke heparan sulfate komponenten av glycocalyx. Kontroller at fast cellene er fullt i kontakt med antistoff løsningen.
    8. Neste dag, bleke antistoffer med romtemperatur PBS for tre 10 min sykluser.
    9. Inkuber endotelceller med 1:1,000 fortynning av det aktuelle fluorescerende sekundære antistoffet i 30 min ved romtemperatur, i den mørke eller dekket med aluminiumsfolie.
    10. Bleke sekundære antistoffer med romtemperatur PBS for tre 10 min sykluser.
    11. Montere dekkglassvæske på objektglass ved hjelp av en anti-fade montering medium som inneholder 4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (DAPI) for kjerner flekker. Forsegle kantene på dekkglassvæske bruker neglelakk.
    12. Bildet fluorescerende immunostained endothelial celle eksempler med AC confocal mikroskopi, med blå, grønn og langt røde kanaler for å visualisere kjerner, heparan sulfat glycocalyx og nanopartikler, henholdsvis.

Representative Results

Den syntetiserte AuNPs, belagt med THPC eller pinne (figur 1A og figur 1B, henholdsvis), er avbildet med TEM og partikler størrelser måles med TEM og DLS for å sikre riktig hydrogenion størrelsesDistribusjon. Figur 2 viser TEM bildet av en THPC-AuNP eksempel på 80 kV og 150.000 x forstørrelse. Diameter på THPC-AuNP partikler varierer fra 2-3 nm, basert på kalibreringslinjen TEM bilder. Denne THPC-AuNP-størrelsen er også tydelig i DLS størrelse måling histogrammet vist i figur 2, som THPC belagt AuNP vises til har en topp på 2,5 nm. PEGylation er ikke synlig under TEM på polymerer er ikke electron tett. TEM bildebehandling av PEG-AuNP prøver bare bekrefter tilstedeværelsen av personlige spredt partikler, som ventes fordi PEG polymer korona rundt nanopartikler hjelpe i forebygging av aggregering. For disse PEG-AuNP prøver, DLS størrelse måling histogrammet viser et skifte i toppen, til cirka 10.5 nm på DLS. Vedlegg av ytterligere ligander eller narkotika på funksjonsgruppene vil påvirke størrelsen på hydrogenion og bør tas i betraktning når måle diameteren.

Fluorophore tillegg (figur 1 c) er bekreftet ved hjelp av en fluorometer til å måle fluorescens signalet fra et utvalg av nanopartikler, som vist i Figur 3. Når opphisset med en bølgelengde på 633 nm, utslipp måles for å ha maksimalt mellom 660 og 672 nm, som samsvarer med produsentens produktinformasjon om maksimal utslipp på 665 nm. Vedlegg av andre fluorescerende sonder bør kontrolleres på en lignende måte å sikre fluorescerende svar.

Biokompatibilitet av partikler og beslektet celle levedyktighet vurderes ved hjelp av MTS analysen kontrollere relative celle metabolismen av MTS etter 16 h inkubasjon med ulike konsentrasjoner av nanopartikler. Fluorophore konjugert PEGylated AuNPs viser ingen betydelig toksisitet, som angitt av de tilsvarende cellen levedyktighet på alle konsentrasjoner opptil 1 mg/mL (figur 4A). Denne biocompatibility endres avhengig av terapeutisk eller ligand festet til de gjenværende funksjonsgruppene tilpasse partikler. Stoffet vedlegg pleier å øke toksisitet, men avhengig av jobbe-konsentrasjonene, kan den ikke påvirke levedyktighet på en betydelig måte.

Opptak av lysrør, PEGylated AuNPs (figur 1 c) av tilhenger cellene vurderes kulturperler rotte fett pad endotelceller med intakt eller dysfunksjonelle glycocalyx (figur 4B). Dysfunksjonelle glycocalyx betingelsene er oppnådd ved å legge heparinase III enzym til kultur, som fører til en degradering av komponenten heparan sulfate glycocalyx og at de matrix12. Figur 4B viser de ulike nivåene for opptak av PEG-AuNPs, som røde prikker på tverrsnittvisningen av representant endotelceller. En sunn glycocalyx forhindrer opptak av disse gull nanopartikler, men en betydelig økning er observert når enzymet er næringsdrivende11. Dette resultatet fremhever potensialet i disse ultrasmall nanopartikler å levere therapeutics til endotelceller på en måte styrt av forskjellige interaksjoner som er basert på glycocalyx helse.

Figure 1
Figur 1: gull hydrogenion skjematisk. (A) THPC belagt AuNP nanosphere før PEG erstatning. (B) PEGylated AuNP med 3 typer PEG avslutninger, inkludert COOH, NH2og CH3. Blå bølger representerer polymer. (C) konjugert nanopartikler for fluorescens bildebehandling. Røde stjerner viser fluorophores konjugert til NH2 funksjonelle grupper. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: størrelse målinger av gull nanopartikler. Venstre: TEM av gull nanopartikler før tillegg av PEG på 80 kV og 150.000 X forstørrelse, skala bar vises. Høyre: Histogram av hydrogenion målt ved DLS før (AuNP) og etter (PEG-AuNP) i THPC erstatning med PEG. DLS resultatene for THPC-belagt AuNP kvantifisere hva er visualisert ved TEM. DLS PEG-belagt AuNP resultatene overvinne utfordringen med manglende evne til å visualisere pinne av TEM på grunn av polymerer ikke er elektron tett. En TEM av PEG-AuNP vises bare kjernen gull nanopartikler og vil se ut som en THPC-capped AuNP. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: fluorescens data fluorescerende PEG-AuNP. Fluorescens toppen på 667 nm kamper utslipp av fluorophore konjugert til PEG-AuNP. A.U.: vilkårlig enheter.

Figure 4
Figur 4: celle interaksjon med fluorescerende PEG-AuNP. (A) cellen levedyktighet (MTS metabolisme) tomten for rotte fett pad endotelceller etter 16 h co inkubasjon med fluorescerende PEG-AuNP. (B) AC Confocal tverrsnitt bilder av fast rotte fett pad endotelceller farget med DAPI for kjerner (blå) og antistoff mot heparan sulfate, en glycocalyx komponent (grønn). Topp bilde er en sunn glycocalyx og bunnen er en dårligere glycocalyx laget. Det er betydelig mer rød fluorescens fra nanopartikler i utvalget med dårligere glycocalyx. Skala bar er 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Denne teknikken er en effektiv metode for å syntetisere passelig, ultrasmall pinne belagt AuNPs. En viktig del av denne prosedyren er første dannelsen av THPC avkortet gull nanopartikler, som kan bekreftes av fargeendring fra gul til brun som vil skje etter at HAuCl4 er lagt til innholdet i runde bunnen kolbe (protokollen trinn 2.3). Ingen fargeendring angir at det er ingen nanopartikler dannet og at forbokstaven skritt bør være sjekket og gjentatt før du fortsetter. I tilfelle fargen endres til noe annet enn brown som vin rød eller grå, den resulterende partikler vil trolig ikke være rundt mål 2.5-nm og en ny bunke bør gjøres også.

Etter dannelsen av gull kjernen, utveksle THPC pinne og rensing prosedyrer inneholder flere viktige trinn for vellykket gjennomføring av protokollen. Blande natten tillater utskifting reaksjonen å gå. Mislykkede rensing kan oppstå hvis dialyse vannet ikke endres med foreskrevet frekvensen. Aggregering og nedbør av partikler kan også oppstå hvis partikler igjen i dialyse for mer enn 72 timer. Andre potensielle problemer kan observeres under fryser tørking. Hvis ultrasmall PINNEN belagt AuNP løsning ikke var helt frosset eller hvis lyophilizer ikke var satt opp riktig, kan det hende at prøver går tapt. Se håndboken til lyophilizer, som noen utstyr kan kreve forskjellige utvalg forberedelser.

Enkel syntese og biokompatibilitet av resulterende partikler representerer fordeler for å bruke disse PEG-AuNPs. Dessuten, har disse nanopartikler fordelen av å kunne samhandle med nanoskala cellulære strukturer som demonstrert av evnen til å identifisere dårligere glycocalyx ved opptak av disse nanopartikler. Denne fordelen kan utnyttes for utvikling av nye aterosklerose behandlinger og forebyggende tiltak. Utover hva vi presenterer her, en annen fordel med denne protokollen er at det gir omfattende tilpasning av partikler samt økt stabilitet og lagringsegenskapene ved thiol som inneholder pinne på gull nanopartikler4. Den andre enden av PEG kjeden kan inneholde alle funksjonsgruppe, og et mylder av molekyler kan bli bøyd i gruppene. I denne protokollen, knyttes alle tre vanlige funksjonelle grupper (metyl, carboxyl, og amino). PINNEN er valgt å prioritere fluorescerende oppdagelsen først, deretter muligheten til å innlemme en sekundær målretting moiety bruker karboksylsyre gruppen. Prosenter av disse gruppene kan bli forskjøvet basert på programmet, og lengder og figurer av polymerer kan justeres også.

For å måle partikkel opptak, konjugert vi en fluorescerende sonde til en av de funksjonelle gruppene. Det bør bemerkes at enhver Bøyning utover hva vi har beskrevet vil resultere i en endring av overflaten egenskapene til hydrogenion. Hver iterasjon av nanopartikler forhold til tilleggskomponenter og Bøyning reaksjoner bør testes for de ønskede egenskapene.

Denne metoden gir ultrasmall gull nanopartikler skal overvinne defensive egenskapene til endotelial ekstracellulære glycocalyx, som hindrer opptaket av konvensjonelt størrelse nanopartikler. Imidlertid gir den lille størrelsen til problemer med både bildebehandling og stoff lasting aspekt. Disse partiklene er betydelig mindre enn den typiske hydrogenion størrelse, og resultatet areal tilgjengelig for vedlegg legemiddelselskap og målretting moieties er sterkt redusert. Dette kan føre til problemer med å plukke opp individuelle signaler i bildebehandlingsprogrammer, men klynger av partikler kan fortsatt lett identifiseres, som vist i AC confocal bilder. Redusert overflaten for vedlegg ligander og therapeutics kan kreve mer partikler gis for å oppnå målet dosering krav. Imidlertid vil mindre partikler være mer effektiv levering når tar hensyn til glycocalyx.

Disse romanen ultrasmall partikler kan leveres til vanskelig å nå nanoskala områder i kroppen med et minimalt avbrudd for microenvironment. Tillegg av PINNEN gir økt biocompatibility og tilbyr funksjonelle grupper for tunge tilpasning av partikler for forskjellige programmer. Den mindre størrelsen sammenlignet med typisk nanopartikler kommer med noen svakheter, men hvis utviklet strategisk, ultrasmall partikkelen er en lovende tilnærming til av det vanskelig å trenge, intrikate og skjøre glycocalyx i vaskulære målretting og stoffet levering.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Northeastern University kjemisk ingeniørfag avdelingen, gi oppstart midler og Tier 1 Pilot studie stipend fra Northeastern University Provost Office, NIH K01 HL125499 og NSF-IGERT NSF/DGE-096843. Forfatterne vil også gjerne takke Thomas J. Webster og hans lab for deres hjelp som Nanomedicine vitenskap og Technology Center og farmasøytisk Sciences avdeling på Northeastern University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich 795429
Gold (III) Chloride trihydrate (HAuCl4.3H2O) Sigma Aldrich 520918
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S5761
Tetrakis (hydroxymethyl) phosphnium chloride Sigma Aldrich 404861
Mono-functional mPEG-thiol Layson Bio Inc. MPEG-SH-2000-1g Mw: 2,000 Da
hetero bi-functional anime-PEG-thiol Layson Bio Inc. NH2-PEG-SH-3400-1g Mw: 3,400 Da
Carboxymethyl-PEG-thiol Layson Bio Inc. CM-PEG-SH-2000-1g Mw: 2,000 Da
Cellulose dialysis membrane (12-14 kDa) Sigma Aldrich D9777
Zerostat anti-static instrument Sigma Aldrich Z108812
Alexa Fluor 647 (AF647) carboxylic acid succinimidyl ester Fisher A20006 Fluorophore
Fisherbrand Qualitative Grade Plain Filter Paper Circles - P5 grade Thermo Fisher Scientific 09-801-B
Transmission electron microscopy JEOL USA JEOL JEM-1000 TEM
Dynamic Light Scattering Brookhaven Instruments Corporation Brookhaven 90 Plus Particle Size Analyzer DLS
Fluorometer Horiba Scientific Jobin Yvon Fluromax 4 Fluorometer
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) Promega G3582 MTS
Plate reader Molecular Devices SpectraMax M4 Plate reader
10E4 epitope HS mouse monoclonal IgM antibody (primary antibody) Amsbio 370255 Primary antibody
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (secondary antibody) Thermo Fisher Scientific R37120 Secondary antibody
VECTASHIELD mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1000 With DAPI
Confocal Microscope Carl Zeiss Meditex AG Zeiss LSM 700 Confocol microscopy

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Veiseh, O., Gunn, J., Zhang, M. Design and fabrication of magnetic nanoparticles for targeted drug delivery and imaging. Adv. Drug Deliv. Rev. 62 (3), 284-304 (2010).
  2. Feng, X., et al. Conjugated polymer nanoparticles for drug delivery and imaging. ACS Appl. Mater. Interfaces. 2 (8), 2429-2435 (2010).
  3. Ghosh, P., Han, G., De, M., Kim, C. K., Rotello, V. M. Gold nanoparticles in delivery applications. Adv. Drug Deliv. Rev. 60 (11), 1307-1315 (2008).
  4. Kumar, R., et al. Third generation gold nanoplatform optimized for radiation therapy. Transl. Cancer Res. 2 (4), 1-18 (2013).
  5. Tarbell, J. M., Ebong, E. E. The endothelial glycocalyx: a mechano-sensor and -transducer. Sci. Signal. 1 (40), (2008).
  6. Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454 (3), 345-359 (2007).
  7. Becker, B. F., Jacob, M., Leipert, S., Salmon, A. H., Chappell, D. Degradation of the endothelial glycocalyx in clinical settings: searching for the sheddases. Br. J. Clin. Pharmacol. 80 (3), 389-402 (2015).
  8. Muzykantov, V., Muro, S. Targeting delivery of drugs in the vascular system. Int. J. Transp. Phenom. 12 (1-2), 41-49 (2011).
  9. Simone, E., Ding, B. -S., Muzykantov, V. Targeted delivery of therapeutics to endothelium. Cell Tissue Res. 335 (1), 283-300 (2009).
  10. Lockman, P. R., Mumper, R. J., Khan, M. A., Allen, D. D. Nanoparticle technology for drug delivery across the blood-brain barrier. Drug Dev. Ind. Pharm. 28 (1), 1-13 (2002).
  11. Cheng, M. J., Kumar, R., Sridhar, S., Webster, T. J., Ebong, E. E. Endothelial glycocalyx conditions influence nanoparticle uptake for passive targeting. Int. J. Nanomedicine. 11, 3305-3315 (2016).
  12. Fels, J., Jeggle, P., Liashkovich, I., Peters, W., Oberleithner, H. Nanomechanics of vascular endothelium. Cell Tissue Res. 355 (3), 727-737 (2014).

Tags

Bioteknologi problemet 131 gull nanopartikler ultrasmall PEGylation overflate Bøyning glycocalyx narkotika-leveranser endotelceller
Syntese av Functionalized 10-nm Polymer-belagt gull partikler for endotelet målretting og narkotika-leveranser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cheng, M. J., Prabakaran, P., Kumar, … More

Cheng, M. J., Prabakaran, P., Kumar, R., Sridhar, S., Ebong, E. E. Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery. J. Vis. Exp. (131), e56760, doi:10.3791/56760 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter