Artículo de método
* These authors contributed equally
Hemos generado con éxito dos ensayos de sustrato específico γ-secretasa. Ambos ensayos celulares presentados aquí están diseñados para cuantificar las actividades enzimáticas de la γ-secretasa a través de la salida de los reporteros de luciferasa de luciérnaga.
Hemos desarrollado un par de ensayos de gen reportero basadas en células para medir cuantitativamente la γ-secretasa escote de distintos sustratos. Este manuscrito describe los procedimientos que pueden utilizarse para monitorizar la γ-secretasa-mediada por hendidura del APP-C99 o muesca, utilizando un sistema de Gal4 impulsado por el promotor firefly luciferase reportero. Estos ensayos fueron establecidos por estable Co transfectar las células HEK293 con el gen reportero de luciferasa Gal4-conducido y el fragmento de Gal4/VP16-etiquetadas C-terminal de APP (APP-C99; Células del CG), o el Gal4/VP16-tagged muesca-ΔE (NΔE; Células de NG). Mediante estos ensayos reportero en paralelo, hemos demostrado que un inhibidor ErbB2, CL-387.785, preferentemente puede suprimir la γ-secretasa hendidura del APP-C99 en células del CG, pero no NΔE en las células de NG. Las respuestas diferenciales exhibidas por las células del centro de gravedad y NG, con CL-387.785, representan una característica preferida para moduladores de la γ-secretasa, y estas respuestas están en marcado contraste con la pan-inhibición de la γ-secretasa inducida por DAPT. Nuestros estudios proveen evidencia directa que las actividades de la γ-secretasa hacia diferentes sustratos pueden diferenciarse en un contexto celular. Estos nuevos ensayos por lo tanto pueden ser herramientas útiles en el descubrimiento de fármacos para mejorar terapias de AD.
Los formas de amiloide-β (Aβ) se creen que la causa primaria de la neurodegeneración en los cerebros de pacientes que sufren de enfermedad de Alzheimer (EA)1. Péptidos Aβ se producen por el paso a paso clivaje de la proteína precursora de amiloide (APP), primero por la β-secretasa y luego por la γ-secretasa2. En la última década, enfoques terapéuticos hacia el tratamiento de la EA se han centrado en la prevención de la producción de Aß3. La mayoría de los estudios se ha centrado en ambos el aumento de la actividad de la α-secretasa, que puede impedir la γ-secretasa escote de aplicación y disminuir....
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1. medición de las señales de reportero de luciferasa, que corresponden al escote de la γ-secretasa de aplicación-C99 o NΔE
Nota: Consulte las publicaciones anteriores para descripciones detalladas de la generación de CG y NG células20,21.
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Inhibición de ErbB2 por CL 387.785 diferencialmente puede promover el proceso de aplicación-C99 por Γ -secretasa sin afectar el escote de la muesca
Para establecer un ensayo basado en la célula que puede medir cuantitativamente el clivaje proteolítico de un substrato determinado γ-secretasa, generamos la línea celular CG HEK293 derivado por la transfección estable Co de un tetracycline inducible C-terminal Gal4/VP16-tagged APP-C99 y un.......
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Los resultados prometedores de un ensayo de 1b de fase de aducanumab la inmunoterapia para el anuncio han establecido firmemente el papel crítico de Aß en la patogenesia del anuncio22 y sugieren que los enfoques anti-Aß siguen siendo una estrategia viable para el desarrollo de fármacos anti-AD. Aquí, describimos ensayos basadas en células para la cuantificación de proteólisis catalizada por γ-secretasa de aplicación-C99 y NΔE utilizando sistemas de reportero de luciferasa de luciérnaga. APP-C99 y .......
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Los autores no tienen nada que revelar.
Los autores agradecen las instalaciones centrales del Instituto de celular y biología organísmica, Academia Sinica, soporte técnico. Este estudio fue apoyado por el Ministerio de ciencia y tecnología, Taiwán (más 103-2320-B-001-016-MY3 a Y.-F. L.), el programa de innovación aplicada de desarrollo biofarmacéutico – tecnología de eje de plataforma de apoyo régimen (NP7 a F.L. Y.) y Academia Sinica (a Y.-F.L.).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Lector de placas de luminiscencia VictorLight | PerkinElmer | 2030-0010 | |
| Clase II, Tipo 2 Cabina de seguridad biológica | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| CL-387,785 | EMD Calbiochem | 233100-1MG | |
| DAPT | Merck | 565770 | |
| Dulbecco' s Medio Eagle Modificado (DMEM) | Thermo Fisher | 12100046 | principal componente del medio de crecimiento |
| Suero fetal bovino (FBS) | Thermo Fisher | 16000044 | |
| Blasticidina | Thermo Fisher | A1113903 | |
| Zeocin | Thermo Fisher | R25005 | |
| Higromicina B | Gibco | 10687010 | |
| Hemocitador | Sigma-Aldrich | BR717805 Microplaca Aldrich | |
| de 96 pocillos | Nunc | 156545 | |
| Tetraciclina | Sigma | T7660 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Reactivo de ensayo de luciferasa Steady-Glo | Promega | E2510 | |
| Incubadora de CO2 humidificada | Revco | Ultima II | |
| Línea celular T-REx293 | Invitrogen | R71007 | |
| Wallac 1420 software versión 3.0 | PerkinElmer | software de control de instrumentos del lector de microplacas de luminiscencia |
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