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Artículo de método

Métodos basados en microscopía para la evaluación de la migración de células epiteliales durante la cicatrización de la herida In Vitro

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DOI:

10.3791/56799

⸱

2 de enero de 2018

 ,  ,  , 
1Laboratorio de Oncología Molecular y TGF-β, IMIB-Arrixaca, 2Departamento de Enfermería, Facultad Enfermería, Universidad de Murcia

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este manuscrito describe cómo incisión-como lesiones sobre monocapas de células epiteliales cultivadas convenientemente modelo herida curativo en vitro, permitiendo la proyección de imagen de confocal o microscopia de la exploración del laser, y que puede proporcionar alta calidad datos cuantitativos y cualitativos para el estudio de comportamiento de la célula y los mecanismos implicados en la migración.

Resumen

Migración celular es un aspecto obligatorio de la cicatrización de heridas. Creación artificial heridas en modelos animales de investigación a menudo resultados en procedimientos experimentales costosos y complicados, mientras que potencialmente carece de precisión. Cultivo in vitro de líneas celulares epiteliales proporciona una plataforma conveniente para investigar el comportamiento migratorio de células en la cicatrización de heridas y el impacto de los tratamientos en estas células. La fisiología de las células epiteliales se estudia a menudo en condiciones no-confluentes; sin embargo, este enfoque no puede asemejarse a las condiciones de cicatrización natural. Alterar la integridad del epitelio por medio mecánico genera un modelo realista, pero puede impedir la aplicación de técnicas moleculares. Por lo tanto, técnicas de microscopía basado son óptimas para estudiar la migración de células epiteliales in vitro. Aquí se detallan dos métodos específicos, el ensayo de rayado herida artificial y el análisis de frente de migración artificial, que puede obtener datos cuantitativos y cualitativos, respectivamente, sobre el comportamiento migratorio de las células epiteliales.

Introducción

Migración celular es necesaria para la cicatrización de heridas, ya que es responsable para el cierre final de la brecha epitelial y la restauración de la superficie perturbada1. Realizar heridas artificiales en modelos animales permite la replicación de este complejo proceso en cerca de condiciones fisiológicas2. Sin embargo, este enfoque resulta a menudo en procedimientos experimentales costosos y complicados, que potencialmente carecen de precisión para el estudio de procesos distintos, debido a la intrincada naturaleza del proceso de cicatrización.

Cultivo in vitro de líneas celulares epiteliales proporciona una útil alternativa a modelos animales para investigar el papel que juegan estas células en la cicatrización de la herida y los efectos del tratamiento sobre el comportamiento migratorio de la célula. La fisiología de las células epiteliales a menudo se estudiados por técnicas moleculares con las culturas no-confluentes3,4,5,6; sin embargo, la interrupción de la integridad del epitelio generalmente se logra mediante finas incisiones mecánicas. En cultivo celular, esto implica que una cantidad insignificante de células puede estar expuesta a la brecha de la herida, y representan una muestra demasiado pequeña para técnicas de biología molecular. Sin embargo, estas lesiones pueden estudiarse a escala microscópica, aprovechando las propiedades migratorias innatas de algunas líneas de células epiteliales, como la célula epitelial de pulmón de visón (Mv1Lu) o el celular de queratinocitos humanos espontáneamente inmortalizadas (HaCaT) líneas.

Aquí describimos un método para microscopía que es conveniente obtener datos cuantitativos sobre la migración de células epiteliales en el contexto de3,4,7,8de cicatrización. Por otra parte, se presentan métodos adicionales que son útiles para estudiar los cambios cualitativamente moleculares y morfológicos que se producen en monocapas epiteliales durante la migración. En general, estos métodos proporcionan un marco para estudiar la dinámica y cambios morfológicos con el comportamiento de la célula epitelial y la respuesta a tratamientos durante la cicatrización de heridas.

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Protocolo

1. artificial herida rasguño ensayo para estudios cuantitativos

  1. Preparación de monocapa de células
    1. Trabajando bajo condiciones estériles, de semillas y crecen las células epiteliales Mv1Lu o HaCaT en frascos de cultivo con medio de suplementos de suero. Actualizar media una vez cada 24-48 h. Después de que las células alcanzan el 80% de confluencia, separar las células utilizando un método adecuado, es decir, tripsinización9.
      Nota: Mv1Lu y HaCaT líneas celulares epiteliales son cultivadas con medio de cultivo EMEM y DEMEM, respectivamente, suplementados con 2 mM L-glutamina y se incubaron a 37 ° C con una atmósfera controlada de 5% CO2. Cada línea celular debe ensayarse cuidadosamente para determinar la concentración de células y el tiempo necesarios para llegar a confluencia completo. Típicamente para las células Mv1Lu o HaCaT, 2-4 x 104 o 4-6 x 104 células/pozo, respectivamente, se siembran en un matraz de cultivo de 175 cm2 , y en el 80% confluencia rinde hasta 35 x 106 Mv1Lu o células HaCaT de 1 x 107 .
    2. En tanto un plato de cultura bien de 12 o 24 pocillos, la semilla en cada pozo 2 mL de células. Actualizar media una vez cada 24-48 h. Asegúrese de números de celular son lo suficientemente altas como para llegar a confluencia 100% después de 2 o 3 días.
    3. Después de que las células alcanzan confluencia, quitarlo del medio suplementada con suero y lavar dos veces con medio libre de suero fresco. Mantener las células en medio libre de suero durante 24 h antes del rayado.
      Nota: Las células Mv1Lu o HaCaT no tienen requisitos de sustrato especial; sin embargo, para las líneas celulares susceptibles a separar espontáneamente en condiciones libres de suero, la capa de la superficie de la placa de cultivo con una solución de poli-l-lisina se debe considerar10.
  2. Rasguño de monocapa
    1. Trabajar en un ambiente estéril, rayar la monocapa de cultivo arrastrando firmemente el extremo estrecho de 20 μl o punta de micropipeta estéril 200 μL, dependiendo de la anchura deseada del rasguño. Mantenga la punta perpendicular a la superficie de cultivo para maximizar la homogeneidad del espacio.
      1. Coloque las placas sobre una superficie oscura para monitorear claramente la monocapa celular. Si es necesario, realizar dos rayas perpendiculares (en forma de Cruz) en cada pocillo para estudiar hasta 4 áreas de migración.
    2. Lavar las células separadas quitando suavemente el medio de cultivo y suavemente agregar medio fresco libre de suero. Repetir dos veces, o hasta que se han eliminado las células de más.
  3. Colección de datos y procedimiento experimental
    1. Tomar hasta 4 imágenes de referencia de tratamiento centrados en el espacio cero de cada bien utilizando un microscopio invertido de contraste de fases, incorporando una cámara CCD. Seleccionar áreas de interés alineando el borde del campo del microscopio hasta la intersección adyacente de arañazos.
      Nota: Normalmente, imágenes adquiridas mediante un aumento de 10 x y un tamaño de 1.280 x 1.024 píxeles de la imagen. Selección de áreas de interés como se describe anteriormente ayudas para fácil localización y validación de 4 mediciones por pozo.
    2. Una vez que todas las imágenes son adquiridas, designar pozos de tratamiento; cambio medio en los pozos con medio fresco que contiene tratamientos seleccionados.
      Nota: Alternativamente, para productos químicos o compuestos que no perturban la homogeneidad del medio de cultivo, los tratamientos pueden ser inoculados directamente en el medio de cultivo.
    3. Incube la placa rayada (37 ° C con una atmósfera controlada que contiene 5% CO2) hasta que las condiciones de cierre de brecha cero observación alcance el 90%. Evitar el cierre completo.
      Nota: Cierre de la brecha Total anula colección cuadro después del tratamiento como áreas de referencia no son detectables y no se puede establecer la referencia de tiempo para el cierre de la brecha. En el caso de las células Mv1Lu o HaCaT, 16-19 h son necesaria para llegar a 90% de confluencia.
    4. Detener la migración de la célula mediante la fijación de las células; Vuelva a colocar el medio de cultivo experimental con 1 mL de formol al 4% en PBS. Incubar por 15 min a TA.
    5. Lavar las células para quitar el exceso con formol; Vuelva a colocar la solución en los pocillos con PBS fresco. Repetir al menos dos veces.
      Nota: En esta etapa, después de sellar, las placas pueden almacenarse a 4 ° C indefinidamente.
    6. Tomar imágenes de referencia después del tratamiento de cada pocillo de las áreas de referencia originales capturadas después de rascarse. Utilice el mismo equipo (microscopio invertido de contraste de fase óptica incorpora una cámara de CCD) y la correspondiente configuración de imagen (aumento y densidad de resolución digital).
      Nota: Para las células que migran individualmente y llenan el vacío independientemente de la formación de un frente coherente (p. ej., células humanas de cáncer de mama MDA-MB-231), las imágenes del curso del tiempo pueden permitir el cálculo de las velocidades de migración de célula individual.
  4. Análisis de imagen y cuantificación de la migración
    1. Utilizando el software (por ejemplo, ImageJ) de procesamiento de imágenes, definir límites de gap cero y determinar la superficie de espacio para hasta cuatro mediciones en cuadros de tratamiento previo. Registrar los datos como "superficie de brecha de tratamiento" (PREGAP). Repita el mismo procedimiento para los cuadros después del tratamiento. Registrar los datos como "superficie de separación después del tratamiento" (POSTGAP).
      1. Abra la imagen grabada con ImageJ. En el menú "imagen", establece el tipo de imagen en 8 bits. En el menú de "proceso", ir al submenú de "filtros" y aplicar "varianza" filtrado.
      2. En el menú "imagen", introduzca "ajustar" la submenú y umbral ajustado a blanco y negro (B & W), asegúrese de no seleccionar "Fondo oscuro". En el menú de "proceso", vaya al submenú "binario" y selecciona "llenar agujeros".
      3. En el menú "analizar", seleccione "establecer medidas" y activar "área". Dibuje el área mensurable siguiendo el contorno de borde migrando así delimitar el espacio.
      4. En el menú "analizar", seleccionar "analizar las partículas" y anote los valores de "superficie total" para la superficie del área dibujada.
    2. Introducir valores de superficie total PREGAP y POSTGAP en una hoja de cálculo para cuantificar la migración absoluta para cada conjunto de muestras individuales como la diferencia de superficie medidas de brecha: − PREGAP POSTGAP [unidades arbitrarias]. Además, normalizar datos de migración absoluta de cada condición para muestras de control: (muestra / CONTROL) * 100 [%].
      Nota: Para las células que migran individualmente y llenan el vacío independientemente de la formación de un frente coherente (p. ej., células humanas de cáncer de mama MDA-MB-231), la migración absoluta puede calcularse contando las células invaden una central en la tira el control o las muestras tratadas.
    3. Trama de salidas de la cuantificación (ver figura 1). Realizar análisis estadísticos si es necesario.
Considerar prueba de t de Student al comparar dos condiciones o pruebas de análisis de varianza para el mayor número de condiciones.

2. artificial migración ensayo frontal para estudios topográficos

  1. Preparación de monocapa de células
    1. Trabajar en condiciones estériles, coloque un cubreobjetos redondo esterilizada en placas vacías hasta la superficie de la placa está cubierta totalmente.
      Nota: Hasta 12 y 33 cubreobjetos caben en 5 cm y placas de 10 cm de diámetro, respectivamente.
    2. En la placa de cultivo, semilla suavemente un volumen adecuado de las células a una concentración que permite la confluencia 100% después de 2 o 3 días. Asegúrese de que no cubreobjetos superpone cubreobjetos vecinos e impiden que cubreobjetos flotante aplicando presión suave con una punta de micropipeta estériles. Actualizar el medio cada 24-48 h.
      Nota: Cada línea celular debe ensayarse cuidadosamente para determinar la concentración de células y el tiempo necesarios para llegar a confluencia completo. Típicamente para las células Mv1Lu o HaCaT, 2-3 x 106 o 2.5-4 x 106 células/10 placa de cm de diámetro, respectivamente, se siembran. Para placas más pequeñas, un número de células debe ser reducido.
    3. Después de que las células alcanzan confluencia, quitarlo del medio suplementada con suero y reemplazar con medio libre de suero fresco. Mantener las células en medio libre de suero durante 24 h antes de la herida artificial se lleva a cabo.
      Nota: Las células Mv1Lu o HaCaT no tienen requisitos de sustrato especial; sin embargo, para las líneas celulares susceptibles de extraer espontáneamente en condiciones libres de suero, la capa de la superficie de cultivo con una solución de poli-l-lisina se debe considerar10.
  2. Herir la monocapa
    1. Utilizando pinzas estériles, mueva suavemente un cubreobjetos sobre una placa de 10 cm limpio con medio libre de suero fresco. Evite dañar la monocapa manteniendo el cubreobjetos en la periferia con las pinzas. Evitar la presión excesiva que puede resultar en rotura del cubreobjetos.
    2. Crear heridas artificiales arrastrando una navaja esterilizada en una línea transversal sobre el centro de los cubreobjetos. Arrastre 3-4 mm y atrás, con el fin de eliminar completamente la franja central de la monocapa. Asegúrese de que no hay restos de células permanece adherido a los bordes de la herida.
      Nota: en un diámetro de 12 mm redondo cubreobjetos, la incisión se realiza en el medio del cubreobjetos. Asegúrese de dejar una capa de las células frente a la fachada principal bastante grande (al menos 2 mm de ancho) para evitar la inclinación del cubreobjetos en los siguientes pasos.
    3. Transferencia de cubreobjetos heridos con celdas hacia arriba, a una placa de 6 pozos limpios que contienen al menos 2 mL fresco medio sin suero. Caben hasta 4 cubre-objetos heridos/pozo.
    4. Suavemente Lave dos veces con el fresco medio libre de suero para eliminar las células separadas.
  3. Muestreo y procedimiento experimental
    1. Intercambio suavemente el medio de los pozos con medio fresco que contiene tratamientos seleccionados.
      Nota: Alternativamente, para productos químicos o compuestos que no perturban la homogeneidad del medio de cultivo, los tratamientos pueden ser inoculados directamente en el medio de cultivo. Proceder con precaución para evitar cualquier potencial desprendimiento celular.
    2. Mantenga la placa dentro de una incubadora de la célula (37 ° C, 5% CO2) para el deseado momento experimental.
    3. Detener la migración de la célula mediante la fijación de las células; Vuelva a colocar el medio de cultivo experimental con 1 mL de formol al 4% en PBS. Incubar por 15 min a TA.
      Nota: Para tiempo curso experimentos, extraer las muestras de la placa de cultivo y fijarlas en una placa separada para evitar que los vapores de formol que afectan a las condiciones experimentales, curso.
    4. Lavar las células para quitar el exceso con formol; Vuelva a colocar la solución en los pocillos con PBS fresco. Repetir al menos dos veces.
      Nota: En esta etapa, después de sellar, las placas pueden almacenarse a 4 ° C indefinidamente.
  4. Inmunofluorescencia (IF) y análisis topológico
    1. Realizar tinción de IF y la proyección de imagen en cubreobjetos individuales como describe3,4,11.
      1. Permeabilizar por 10 min sumergiendo cubreobjetos en una solución de Tritón X-100 0.3% en PBS.
      2. Bloque de 30 minutos con la solución de bloqueo siguiente: 0,3% albúmina de suero bovino; Suero bovino fetal 10%; 5% de leche descremada; 0.3% solución Triton X-100 en PBS.
        Nota: Bloqueo solución sin leche se puede preparar con antelación y almacenado a-20 ° C.
      3. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda, con anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo sin leche. Coloque el cubreobjetos boca abajo en la solución de 15 μl del anticuerpo para asegurar una distribución adecuada.
        Nota: La dilución de trabajo del anticuerpo es variable y depende de los anticuerpos en uso. Por ejemplo, los anticuerpos anti-c-Jun requiere una dilución 1/100.
      4. Lavar tres veces sumergiendo el cubreobjetos en una solución de Tritón X-100 0.1% en PBS.
      5. Incubar el cubreobjetos en el anticuerpo secundario diluido en solución amortiguadora de bloqueo leche durante 30 minutos.
        Nota: La dilución de trabajo del anticuerpo es variable y depende de los anticuerpos en uso. Por ejemplo, el cabra-anti-conejo (488) requiere una dilución de 1/400 para una resolución óptima. Otros reactivos Etiquetadoras como phalloidin y Hoechst 33258 pueden agregarse para el tampón de incubación en este momento.
      6. Lavar tres veces sumergiendo el cubreobjetos en solución al 0,1% Tritón X-100 en PBS.
      7. Monte el cubreobjetos boca abajo en una 10 μl montaje media gota (p. ej., Vectashield) coloca en un portaobjetos de microscopio. Dejo las diapositivas en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche para el endurecimiento medio del montaje. Luego, almacenar a 4 ° C en la oscuridad indefinidamente.
    2. Obtener epifluorescencia o imágenes de microscopia confocal de los cambios estructurales que ocurren en el borde delantero de la migración.
      Nota: Pueden realizarse estudios topológicos por mosaico de fotos del frente de migración a la monocapa interna. Estudios semi cuantitativos son posibles mediante el análisis de software basada en intensidades de fluorescencia local.

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Resultados

Ensayo memoria herida artificial para estudios cuantitativos: determinar el Factor de crecimiento epidérmico (EGF) promoción de la migración:

EGF es un conocido inductor de la proliferación de células epiteliales y migración y un control positivo para la cuantificación de promoción de la migración. Monocapas de células Mv1Lu y HaCaT fueron utilizadas en los ensayos de rayado de herida y se obtuvieron imágenes de tratamiento previo....

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Discusión

Sobre la piel o membrana mucosa de la interrupción, se restaura la función barrera por las acciones de numerosos tipos celulares, incluyendo fibroblastos o células epiteliales e inmunes. Conjuntamente, estas células se someten a un complejo proceso que involucra la apoptosis, proliferación, diferenciación e importante, fibroblastos y epitelial celular la migración, que es el último mecanismo responsable de la restauración del tejido interrumpido y la cierre de la brecha epitelial superficial1...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no existe ningún conflicto de interés.

Agradecimientos

Queremos dar las gracias a los miembros más antiguos de laboratorio que ayudan a mejorar y perfeccionar estas técnicas a su estado actual: Dr. Celia Martinez-Mora; Dr. Anna Mrowiec, Dr. Catalina Ruiz-Cañada y Dr. Antonia Alcaraz García. Estamos agradecidos al Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca para apoyar fuertemente el desarrollo de estas técnicas. También el Instituto de Salud Carlos III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. Plan Estatal I + D + I y el Instituto de Salud Carlos III-Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación (beca Nº: PI13/00794); www.isciii.es. Fondos FEDER "Una manera de hacer Europa". También agradecemos a Universidad de Murcia, IMIB-Arrixaca y FFIS para asistencia y apoyo administrativo. Por último, queremos dar un agradecimiento especial a Dr. Isabel Martínez-Argudo y la Facultad de Ciencias Ambientales y Bioquímica, Campus Tecnológico de la Fábrica de Armas, Universidad de Castilla-la Mancha, Toledo por su apoyo en ceder voluntariamente el Biomedicina y biotecnología laboratorio para hacer posible la parte filmada de este documento.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)Biowest, Nuaillé, FranciaL0102-500Opcional 10 % FBS
suplemento Eagles' s Medio esencial mínimo (EMEM)LonzaBE12 -662FSuplemento opcional de 10 % FBS
L-GlutaminaLonzaBE17-605EUso a 2 mM
Suero fetal bovino (FBS)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA EE. UU.DE17603A
Tripsina-EDTASigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UUT4049Diluir según corresponda
Poly-L-LisinaSigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.P9155
Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco (10x)Gibco by Life Technologies14200-067Diluido a 1x
Placas de cultivo de 24 pocillosBD FALCON//SARSTED734-0020
Placas de cultivo de 6 pocillosSARSTEDT83-3920
Factor de crecimiento epidérmico (EGF)Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USAE9644Usado 10 ng/mL
Cubreobjetos redondosMENZEL-GLÄ SERMENZCB00120RA020 PROFUNDIDAD DE CAMPO CORTA Hoja de
afeitar reforzada n.º 743Martor (a través de VWR)MARO743.50
200 µ l puntas de pipeta de aerosol estérilesVWR732-0541
20 µ l puntas de pipeta de aerosol estérilesVWR732-0528
digital microscopio de contraste de fase acopladoMotic SpainCámara Moticam 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31
Microscopio confocalZEISS Microimaging, AlemaniaLSM 510 META
10 cm Placa de cultivoBD FALCON353003
Anticuerpo policlonal anti c-Jun de conejoSanta Cruz Biotechnologysc-1694Usado 1:100
Anti-conejo IgG (cabra policlonal ) AF 488InvitrogenA11008Usado 1:400
Hoechst-33258Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA14530Usado 1:1000
Alexa Fluor 594 phalloidin (en metanol) (rojo)InvitrogenA12381Usado 1:100
Albúmina sérica bovinaSanta Cruz BiotechnologySC-2323
Triton X-100Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USAT9284
Leche desnatadaBD DIFCO232100
ImageJInstitutos Nacionales de Salud, EE. UU.Versión 1.50i
Zen LSM 510 software de procesamiento de imágenesZEISS Microimaging, AlemaniaVersión 5.0 SP 1.1
. Cámara

Referencias

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