Métodos basados en microscopía para la evaluación de la migración de células epiteliales durante la cicatrización de la herida In Vitro

Summary

Este manuscrito describe cómo incisión-como lesiones sobre monocapas de células epiteliales cultivadas convenientemente modelo herida curativo en vitro, permitiendo la proyección de imagen de confocal o microscopia de la exploración del laser, y que puede proporcionar alta calidad datos cuantitativos y cualitativos para el estudio de comportamiento de la célula y los mecanismos implicados en la migración.

Abstract

Migración celular es un aspecto obligatorio de la cicatrización de heridas. Creación artificial heridas en modelos animales de investigación a menudo resultados en procedimientos experimentales costosos y complicados, mientras que potencialmente carece de precisión. Cultivo in vitro de líneas celulares epiteliales proporciona una plataforma conveniente para investigar el comportamiento migratorio de células en la cicatrización de heridas y el impacto de los tratamientos en estas células. La fisiología de las células epiteliales se estudia a menudo en condiciones no-confluentes; sin embargo, este enfoque no puede asemejarse a las condiciones de cicatrización natural. Alterar la integridad del epitelio por medio mecánico genera un modelo realista, pero puede impedir la aplicación de técnicas moleculares. Por lo tanto, técnicas de microscopía basado son óptimas para estudiar la migración de células epiteliales in vitro. Aquí se detallan dos métodos específicos, el ensayo de rayado herida artificial y el análisis de frente de migración artificial, que puede obtener datos cuantitativos y cualitativos, respectivamente, sobre el comportamiento migratorio de las células epiteliales.

Introduction

Migración celular es necesaria para la cicatrización de heridas, ya que es responsable para el cierre final de la brecha epitelial y la restauración de la superficie perturbada¹. Realizar heridas artificiales en modelos animales permite la replicación de este complejo proceso en cerca de condiciones fisiológicas². Sin embargo, este enfoque resulta a menudo en procedimientos experimentales costosos y complicados, que potencialmente carecen de precisión para el estudio de procesos distintos, debido a la intrincada naturaleza del proceso de cicatrización.

Cultivo in vitro de líneas celul....

Protocol

1. artificial herida rasguño ensayo para estudios cuantitativos

1. Preparación de monocapa de células
   1. Trabajando bajo condiciones estériles, de semillas y crecen las células epiteliales Mv1Lu o HaCaT en frascos de cultivo con medio de suplementos de suero. Actualizar media una vez cada 24-48 h. Después de que las células alcanzan el 80% de confluencia, separar las células utilizando un método adecuado, es decir, tripsinización⁹.
      Nota: Mv1Lu y HaCaT líneas celulares epiteliales son cultivadas con medio de cultivo EMEM y DEMEM, respectivamente, suplementados con 2 mM L-glutamina y se incubaron a 3....

Results

Ensayo memoria herida artificial para estudios cuantitativos: determinar el Factor de crecimiento epidérmico (EGF) promoción de la migración:

EGF es un conocido inductor de la proliferación de células epiteliales y migración y un control positivo para la cuantificación de promoción de la migración. Monocapas de células Mv1Lu y HaCaT fueron utilizadas en los ensayos de rayado de herida y se obtuvieron imágenes de tratamiento previo........

Discussion

Sobre la piel o membrana mucosa de la interrupción, se restaura la función barrera por las acciones de numerosos tipos celulares, incluyendo fibroblastos o células epiteliales e inmunes. Conjuntamente, estas células se someten a un complejo proceso que involucra la apoptosis, proliferación, diferenciación e importante, fibroblastos y epitelial celular la migración, que es el último mecanismo responsable de la restauración del tejido interrumpido y la cierre de la brecha epitelial superficial^1.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)	Biowest, Nuaillé, Francia	L0102-500	Opcional 10 % FBS
suplemento Eagles' s Medio esencial mínimo (EMEM)	Lonza	BE12 -662F	Suplemento opcional de 10 % FBS
L-Glutamina	Lonza	BE17-605E	Uso a 2 mM
Suero fetal bovino (FBS)	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA EE. UU.	DE17603A
Tripsina-EDTA	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU	T4049	Diluir según corresponda
Poly-L-Lisina	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE. UU.	P9155
Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco (10x)	Gibco by Life Technologies	14200-067	Diluido a 1x
Placas de cultivo de 24 pocillos	BD FALCON//SARSTED	734-0020
Placas de cultivo de 6 pocillos	SARSTEDT	83-3920
Factor de crecimiento epidérmico (EGF)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	E9644	Usado 10 ng/mL
Cubreobjetos redondos	MENZEL-GLÄ SER		MENZCB00120RA020 PROFUNDIDAD DE CAMPO CORTA Hoja de
afeitar reforzada n.º 743	Martor (a través de VWR)	MARO743.50
200 µ l puntas de pipeta de aerosol estériles	VWR	732-0541
20 µ l puntas de pipeta de aerosol estériles	VWR	732-0528
digital microscopio de contraste de fase acoplado	Motic Spain	Cámara Moticam 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31
Microscopio confocal	ZEISS Microimaging, Alemania	LSM 510 META
10 cm Placa de cultivo	BD FALCON	353003
Anticuerpo policlonal anti c-Jun de conejo	Santa Cruz Biotechnology	sc-1694	Usado 1:100
Anti-conejo IgG (cabra policlonal ) AF 488	Invitrogen	A11008	Usado 1:400
Hoechst-33258	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	14530	Usado 1:1000
Alexa Fluor 594 phalloidin (en metanol) (rojo)	Invitrogen	A12381	Usado 1:100
Albúmina sérica bovina	Santa Cruz Biotechnology	SC-2323
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA	T9284
Leche desnatada	BD DIFCO	232100
ImageJ	Institutos Nacionales de Salud, EE. UU.	Versión 1.50i
Zen LSM 510 software de procesamiento de imágenes	ZEISS Microimaging, Alemania	Versión 5.0 SP 1.1