Protocolo experimental para detectar la función mitocondrial en hepatocitos expuestos a plaguicidas organoclorados

Summary

Comprender la influencia de los pesticidas organoclorados ambientales (OCP) en la función mitocondrial en los hepatocitos es importante para explorar el mecanismo de los OCP que causan trastornos metabólicos. Este artículo presenta métodos detallados para detectar la función mitocondrial hepática.

Abstract

Este artículo presenta métodos detallados para detectar la función mitocondrial hepática para comprender mejor la causa de los trastornos metabólicos causados por los pesticidas organoclorados ambientales (OCP) en los hepatocitos. Las células hepG2 se expusieron al hexaclorociclohexano durante 24 h a una dosis equivalente de exposición interna en la población general. La ultraestructura en los hepatocitos se examinó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) para mostrar el daño de las mitocondrias. La función mitocondrial se evaluó aún más por la intensidad de fluorescencia mitocondrial, los niveles de adenosina 5'-trifosfato (ATP), la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y el potencial de membrana mitocondrial (MMP) en células hepox2 incubadas con HCH. La intensidad de fluorescencia de las mitocondrias después de mancharse por la sonda fluorescente verde mitocondrial se observó con una microscopía de fluorescencia. La reacción luciferina-luciferasa se utilizó para determinar los niveles de ATP. El MMP fue detectado por el tinte catiónico JC-1 y analizado bajo citometría de flujo. El OCR se midió con un analizador de flujo extracelular. En resumen, estos protocolos se utilizaron en la detección de la función mitocondrial en hepatocitos con para investigar los daños de las mitocondrias.

Introduction

Los efectos de los plaguicidas organoclorados (OCP) en la salud, por ejemplo, interferencia reproductiva, toxicidad inmunológica, cambios metabólicos se han estudiado previamente^1,2,3. Los métodos para detectar el metabolismo celular y descubrir la disfunción mitocondrial han permitido a los científicos comprender el papel de la función mitocondrial(es decir., niveles de STAT3 mitocondrial, lactato, piruvato, relación lactato-piruvato, coenzima Q10, fuga de protones mitocondriales, bioenergética, biogénesis y dinámica) en áreas como el envejecimiento, la obe....

Protocol

Todos los experimentos y los protocolos del experimento se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes y fueron aprobados por el Comité ético local de la Universidad Médica de Nanjing.

1. Ultraestructura mitocondrial por TEM

1. Recolección de células HepG2
   1. Células HepG2 de semilla en platos de 100 mm. Conservar a 37oC y 5% de CO₂.
   2. Disetique las células con 0,25% EDTA en tubo de 1,5 mLEP.
   3. Centrífuga a 1000 x g durante 3 min a temperatura ambiente (RT). Deseche el sobrenadante.
   4. Recoger 4-6 x 10⁵ células HepG2.
2. Añadir ....

Results

Las mitocondrias cristae de las células de HepG2 expuestas a la HCH fueron marcadamente dañadas. Las mitocondrias dispersas fueron levemente expandidas, de forma irregular, y la cresta mitocondrial desapareció con una arquitectura mitocondrial relativamente anormal (Figura 1).

Intensidad media de fluorescencia verde mitocondrial, que representa las mitocondrias, disminución en las células de HepG2 e.......

Discussion

Crítico para el éxito del protocolo de detección es el uso de una variedad de métodos experimentales que se han cubierto el estudio desde el fenotipo hasta el mecanismo. En este estudio, las células HepG2 se cultivaron en DMEM con penicilina y estreptomicina y 10% de suero bovino fetal. Cuando las células alcanzaron el 40-50% de confluencia, se añadieron e incubaron los HCH (0, 10, 100 ng/ml) durante 24 h. En primer lugar, utilizamos TEM que mostró los cambios ultraestructurales en el hepatocito causados por los OCP repr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopio electrónico de transmisión	FEI	Tecnai G2 Spirit Bio TWIN	Imágenes de alto contraste y alta resolución, Observación e imágenes de baja dosis, Observación a baja temperatura, Rendimiento analítico excepcional, Automatización para mayor comodidad y rendimiento
Mito-Tracker Green	Beyotime	C1048	Mito-Tracker Green es una sonda fluorescente verde mitocondrial que se puede utilizar para la tinción fluorescente específica de mitocondrias de células vivas.
Microscopio confocal de escaneo láser	Zeiss	700B	El diseño es compacto, estable, la trayectoria de luz es la más corta, la alta precisión de luz, la tecnología creativa y la tecnología de escaneo sofisticada junto para producir una imagen de muestra tridimensional perfecta.
	Beyotime	S0027	El kit de ensayo de ATP mejorado se puede utilizar para detectar los niveles de ATP (adenosina 5'-trifosfato) en soluciones, células o tejidos comunes. Las células y las muestras de tejido se pueden dividir para completar la preparación de la muestra, sensibilidad de detección de hasta 0,1 nmol / L, la quimioluminiscencia se puede mantener durante 30 minutos.
Luminómetro	Berthold	Centro LB 960	El luminómetro es un detector de quimioluminiscencia, la muestra de prueba en sí puede ser ligera, no es necesario estimular. El luminómetro es el instrumento que detecta la quimioluminiscencia.
Kit de ensayo de proteínas BCA	Beyotime	P0012	El kit de ensayo de proteínas BCA es uno de los métodos más utilizados para detectar concentraciones de proteínas.
Lector multimodo	TECAN	InfiniteM200	El lector multimodo se utiliza para detectar la consentimiento de proteínas.