Se presenta un protocolo para la selección en vitro y caracterización del ácido ftálico de grupo específico éster enlace DNA aptámeros. También se incluye la aplicación de los aptámeros seleccionados en un aptasensor electroquímico.
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Artículo de método
Selección de aptámeros ADN enlace de éster ácido ftálico, caracterización y aplicación a un Aptasensor electroquímico
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Resumen
Resumen
Ácido ftálico ésteres (PAEs) sonuno de los principales grupos de contaminantes orgánicos persistentes. La detección específica de grupo de PAEs se desea altamente debido al crecimiento rápido de sus congéneres. ADN los aptámeros se han aplicado cada vez más como elementos de reconocimiento en las plataformas de biosensor, pero selección de aptámeros hacia objetivos altamente hidrofóbico molécula pequeña, como PAEs, se divulgan raramente. Este trabajo describe un método basado en el grano diseñado para seleccionar grupo específico DNA aptámeros a PAEs. El grupo amino funcionalizados ftalato de dibutilo (DBP-NH2) como el destino de anclaje fue sintetizado e inmovilizado en las perlas de agarosa epoxy-activado, que permite la visualización del grupo éster ftálico en la superficie de la matriz de inmovilización, y por lo tanto la selección de las carpetas de grupo específica. Determinamos las constantes de disociación de los candidatos de aptámeros por reacción en cadena de polimerización cuantitativa juntada con separación magnética. La relativa afinidad y selectividad de los aptámeros para otros PAEs se determinaron por el análisis competitivos, donde los candidatos de aptámeros fueron previamente delimitados al DBP-NH2 une bolas magnéticas y lanzado en el sobrenadante tras la incubación con las prueba PAEs u otras sustancias interferentes potenciales. El análisis competitivo se aplicó porque proporcionó una comparación fácil afinidad entre PAEs que sin grupos funcionales para la inmovilización de superficie. Finalmente, demostró la fabricación de un aptasensor electroquímica y había utilizado para la detección ultrasensible y selectiva de ftalato de bis(2-ethylhexyl). Este protocolo proporciona información detallada para el descubrimiento de los aptámeros de otras pequeñas moléculas hidrofóbicas.
Introducción
Junto con el rápido desarrollo económico, aceleración de la industrialización y la construcción urbana, la contaminación ambiental es más grave que nunca. Contaminantes ambientales típicos incluyen iones de metales pesados, toxinas, antibióticos, pesticidas, disruptores endocrinos y contaminantes orgánicos persistentes (COP). Además de los iones del metal y las toxinas, otros contaminantes son moléculas pequeñas que muy a menudo consisten en una variedad de congéneres. Por ejemplo, los contaminantes orgánicos persistentes más tóxicos son los bifenilos policlorados (PCBs), hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs), éteres de bifenilo polibromado (PBDE), policlorados....
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Protocolo
1. Biblioteca y Primer diseño y síntesis
-
Diseño de la biblioteca inicial y cartillas.
Biblioteca (piscina0): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3'
Adelante la cartilla (FP): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3'
Fosforilados cartilla reversa (PO4- RP): 5'-PO4- GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3' - Sintetizar la piscina0, FP y PO4- RP usando estándar phosphoramidite química18,19,20y purificar el ADN estándar cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)21. ....
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Resultados
Hemos diseñado y había sintetizado el grupo amino funcionalizado ftalato de dibutilo (DBP-NH2) como destino de anclaje (Figura 1F). Luego realizamos la selección de aptámeros ADN de PAEs con DBP-NH2 como destino ancla y después el método basado en la inmovilización blanco clásico (figura 2). En cada ronda, un piloto PCR fue realizado usando la página desnaturalizada para optimizar el número de ciclo de PCR (.......
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Discusión
Un beneficio excepcional de aptámeros es que se identifican a través del método en vitro SELEX, mientras que los anticuerpos son generados por immunoreactions en vivo . Por lo tanto, los aptámeros seleccionables con especificidad deseado bajo condiciones experimentales bien diseñadas, mientras que los anticuerpos se limitan a las condiciones fisiológicas.
Para facilitar la separación de secuencias límite de secuencias libres, SELEX modificado varios se han divulgado recientem.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran competencia interés financiero.
Agradecimientos
Estamos agradecidos por el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias naturales (21675112), proyecto clave del plan de ciencia y tecnología de la Comisión de Educación de Beijing (KZ201710028027) y Yanjing joven becario programa de Capital Normal University.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| UV-2550 | Shimadzu, protocolo de Japón | , sección 3.8.2 | |
| ADN Engnine Termociclador,PTC0200 | BIO-RAD | secciones 3.5.1.2 y 3.5.2 | |
| C1000 Touch | BIO-RAD | secciones 5.3.6 y 6.3 | |
| VMP3 potenciostato multicanal | Bio-Logic Science, Claix, Francia | sección 7.4,7.8 y 7.11 | |
| Sepharose 6B | activado con epoxiGE Healthcare (Piscataway, Nueva Jersey, EE. UU.) | 10220020 | perlas de argarosa, sección 2.3 y 3.3 |
| Perlas magnéticas de ácido carboxílico Dynabeads M-270 | Invitrogen, EE. UU | 420420 | perlas magnéticas, sección 5.2. y 5.3 |
| Premezcla Taq Versión de inicio en caliente | Takara,Dalian,China | R028A | polimerasa, sección 3.5.1.1 |
| Membrana de sellado PARAFILM | Bemis, EE. UU | PM-996 | sección 3.6.5 |
| Lambda Exonucleasa | Invitrogen, EE. UU | EN0561 | sección3.7.1.2.El tampón de reacción 10 × es proporcionado junto con λ exonucleasa por el proveedor. |
| Dr. GenTLE portador de precipitación | Takara,Dalian,China | 9094 | sección 3.6.2 y 3.8.1 |
| UNIQ-10 PÁGINA Kit de recuperación de ADN | Sangon Biotech (Shanghai) | B511135 | sección 4.2 |
| SYBR Tinción de gel de ácido nucleico de oro | Invitrogen, EE. UU. | 1811838 | tinte de ácido nucelico, sección 3.5.1.5 |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara,Dalian,China | RR820A | mezcla de polimerasa que contiene polimerasa y dNTPs, sección 5.3.5 |
| ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) | Sigma-Aldrich | CAS: 1132-61-2 | sección 5.2.1 |
| clorhidrato de carbodiimida (EDC)1-etil-3-(3-dimetilaminopropilo) (EDC) | Invitrogen, EE. UU | CAS: 25952-53-8 | sección 5.2.2 |
| N-hidroxisuccinimida (NHS) | Sigma-Aldrich | 6066-82-6 | sección 5.2.3 |
| mercaptohexanol (MCH) | Sigma-Aldrich | CAS: 1633-78-9 | sección 7.7 |
| Electrodo de oro | Shanghai Chenhua | CHI101 | sección 7.4. - 7.11 |
| clorhidrato de fosfina tris(2-carboxietil) (TCEP) | Sigma-Aldrich | CAS: 51805-45-9 | sección 7.5 |
| O-(2-Mercaptoethyl)-O'-metil-hexa-(etilenglicol) | Sigma-Aldrich | CAS: 651042-82-9 | sección 7.7 |
| ftalato de dietilhexilo (DEHP) | Instituto Nacional de Metrología, China | CAS: 117-81-7 | sección 7.11 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | CAS: 9005-64-5 | polioxietileno(20) monolaurato de sorbaitán |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | CAS: 9002-93-1 | agente tensioactivo no iónico |
| PBS | Sigma-Aldrich | P5368 | 10 mM tampón de fosfato conteniendo 1 M de NaCl, pH 7,4 |
Referencias
- Vorkamp, K., Riget, F. F. A review of new and current-use contaminants in the Arctic environment: Evidence of long-range transport and indications of bioaccumulation. Chemosphere. 111, 379-395 (2014).
- Net, S., Sempere, R., Delmont, A., Paluselli, A., Ouddane, B.
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Reimpresiones y permisos
