Method Article

Creando un modelo geométrico realista estructural de elementos finitos de cardiomiocitos para estudiar el papel de la arquitectura celular de cardiomiocitos biología de sistemas

DOI:

10.3791/56817

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April 18th, 2018

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1Cell Structure and Mechanobiology Group, University of Melbourne, 2Systems Biology Laboratory, Melbourne School of Engineering, University of Melbourne, 3Department of Biomedical Engineering, University of Melbourne, 4School of Mathematics and Statistics, Faculty of Science, University of Melbourne, 5Department of Engineering Science, University of Auckland, 6Advanced Microscopy Facility, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 7ARC Centre of Excellence in Convergent Bio-Nano Science and Technology, University of Melbourne, 8School of Medicine, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, University of Melbourne, 9Living Systems Institute, University of Exeter

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un método novedoso para crear un modelo de elementos finitos espacial detallada de la arquitectura intracelular de cardiomiocitos de imágenes de microscopía confocal y microscopia electrónica. La potencia de este modelo espacial detallada se demuestra mediante estudios de caso en la señalización de calcio y bioenergética.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Con la llegada de tres dimensiones (3D) tecnologías imagenológicas como la tomografía de electrones, cara de serie bloque de análisis de microscopía electrónica y microscopía confocal, la comunidad científica tiene acceso sin precedentes a grandes conjuntos de datos en secundario-micrómetro resolución que caracterizan la remodelación arquitectónica acompaña a cambios en la función de cardiomiocitos en salud y enfermedad. Sin embargo, estos conjuntos de datos han sido utilizados para investigar el papel de la arquitectura celular remodelación en función de los cardiomiocitos. El propósito de este protocolo es describir cómo crear un modelo de elementos finitos precisa de un cardiomiocito mediante microscopia electrónica de alta resolución e imágenes de microscopía confocal. Un modelo detallado y preciso de la arquitectura celular tiene gran potencial para proporcionar nuevas penetraciones en la biología de cardiomiocitos, más experimentos solo pueden reunir. El poder de este método radica en su capacidad de cómputo fusionar información de dos modalidades de imágenes dispares de ultraestructura de cardiomiocitos para desarrollar un modelo unificado y detallado de los cardiomiocitos. Este protocolo describe los pasos para integrar la tomografía electrónica e imágenes de microscopía confocal de cardiomiocitos de rata Wistar (nombre de una raza específica de rata albina) macho adulto para desarrollar un modelo de elementos finitos medio sarcómero de los cardiomiocitos. El procedimiento genera un modelo de elementos finitos 3D que contiene una descripción exacta, alta resolución (orden del día de ~ 35 nm) de la distribución de las mitocondrias, miofibrillas y los grupos de receptores de rianodina que liberan el calcio necesario para el cardiomiocito contracción de la red reticular sarcoplásmica (SR) en el compartimiento cytosolic y miofibrillas. El modelo generado aquí una ilustración no incorpora detalles de la arquitectura del túbulo transversal o la sarcoplásmica, reticular, red y por lo tanto es un modelo mínimo de los cardiomiocitos. Sin embargo, el modelo ya puede ser aplicado en investigaciones basadas en simulación en el papel de la estructura de la célula en bioenergética mitocondrial y señalización calcio, que es ilustrado y discutido usando dos estudios de caso que se presentan después de la Protocolo detallado.

Introduction

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Acoplamiento excitación-contracción (ECC) en el corazón se refiere a la importante e intrincado acoplamiento entre la excitación eléctrica de la membrana del cardiomiocito y la posterior contracción mecánica de la célula durante cada latido. Modelos matemáticos han desempeñado un papel clave en el desarrollo de una comprensión cuantitativa de los procesos bioquímicos vinculados entre sí que regulan el potencial de acción1,2,3de bioenergética, de señalización de calcio citosólico y la posterior generación de la fuerza contráctil. Tales modelos han predicho con éxito los cambios en el latido del corazón cuando uno o varios de estos procesos bioquímicos se someten a alteraciones4,5. La ultraestructura altamente organizada de los cardiomiocitos se ha reconocido cada vez más a desempeñar un papel crítico en la función contráctil normal de la célula y el corazón entero. De hecho, cambios en la morfología y organización de los componentes de la ultraestructura cardiaca se producen en paralelo a los cambios bioquímicos en condiciones de enfermedad tales como hipertrofia6,7de insuficiencia cardíaca y miocardiopatía diabética8. Si estos cambios estructurales son menores, adaptativas o patológicas las respuestas a las cambiantes condiciones bioquímicas sigue siendo en gran parte desconocido9. El acoplamiento inherentemente estrecha entre forma y función en biología significa que estudios experimentales solo no pueden proporcionar penetraciones más profundas que las correlaciones entre la función de cardiomiocitos y remodelación estructural. Una nueva generación de modelos matemáticos que pueden incorporar el montaje estructural de los componentes del celulares, junto con los procesos bioquímicos estudiados, son necesarias para desarrollar una comprensión integral, cuantitativa de la relación entre la estructura, bioquímica y fuerza contráctil en los cardiomiocitos. Este protocolo describe métodos que pueden utilizarse para generar modelos de elementos finitos estructural precisa de cardiomiocitos que pueden ser utilizado para tales investigaciones.

La última década ha visto avances en microscopia electrónica 3D10, confocal11y súper resolución microscopia12 que proporcionar penetraciones sin precedentes, de alta resolución en la Asamblea de la nano-escala y microempresas de la componentes subcelular de los cardiomiocitos. Recientemente, estos conjuntos de datos se han utilizado para generar modelos computacionales de cardiomiocitos ultraestructura13,14,15,16. Estos modelos utilizan un método bien establecido de simulación ingeniería, llamado el método de elementos finitos17, para crear elementos finitos mallas computacionales sobre que procesos bioquímicos y cardiomiocitos pueden simular las contracciones. Sin embargo, estos modelos están limitados por la resolución y el detalle que puede proporcionar un método de microscopia en un conjunto de datos de imagen. Por ejemplo, la microscopia electrónica puede generar nanómetro-nivel detalle de estructura de la célula, pero es difícil identificar proteínas específicas dentro de la imagen que sería necesario crear un modelo. Por otro lado, el microscopio óptico de superresolución puede proporcionar imágenes de alto contraste con resoluciones del orden de 50 nm de sólo un selecto pocos molecular componentes de la célula. Sólo mediante la integración de información complementaria de estas modalidades de imágenes puede uno realista explorar la sensibilidad de la función a los cambios en la estructura. Correlativa luz y microscopia electrónica todavía no es un procedimiento de rutina y aún sufriría la limitación de que sólo un número limitado de componentes podría manchado en la vista de inmunofluorescencia y correlacionado con el punto de vista de la microscopia electrónica.

Este protocolo presenta un enfoque novedoso18 que usa métodos estadísticos19 para analizar y cómputo fusionar información de microscopía de luz en la distribución espacial de los canales iónicos con microscopia electrónica información en otros cardiaca componentes de la ultraestructura, como las miofibrillas y mitocondrias. Esto produce un modelo de elementos finitos que se puede utilizar con modelos biofísicos de los procesos bioquímicos para estudiar el papel de la organización celular de cardiomiocitos en los procesos bioquímicos que regulan la contracción de cardiomiocitos. Por ejemplo, este protocolo podría ser utilizado para crear modelos de salud y8modelos de miocitos cardiacos diabetes inducida para estudiar el efecto de remodelación estructural en función de la célula cardíaca que se observa en animales diabéticos. Una ventaja adicional de la naturaleza estadística del método presentado se ilustra también en el protocolo: el método puede generar varias instancias de geometrías de elementos finitos que mímico de cerca las variaciones observadas experimentalmente en la estructura de la célula.

Como un resumen, los pasos del protocolo incluyen: (i) preparación de tejido cardíaco para microscopia electrónica para generar imágenes 3D con suficiente resolución y contraste; (ii) reconstrucción y segmentación de las pilas de imágenes en 3D de datos de microscopia electrónica usando una reconstrucción 3D de microscopia electrónica y software de análisis de imagen llaman IMOD20; (iii) utilizar iso2mesh21 para generar una malla de elementos finitos usando los datos segmentados como entrada; (iv) utilizando el algoritmo de novela y códigos para la distribución de los canales iónicos en la malla de elementos finitos.

La premisa del enfoque a cada paso se describe en el protocolo y resultados representativos se encuentran en las figuras que lo acompaña. Un resumen se describe especificando cómo los modelos espacial detallados generados se pueden utilizar para estudiar la dinámica espacial de calcio durante la ECC como bioenergética mitocondrial. Algunas de las limitaciones actuales del Protocolo se discuten, así como nuevos desarrollos que se están realizando para superarlas y avanzar a una comprensión cuantitativa de la función de la estructura de la célula a la biología de sistemas cardiaco. También se aborda cómo estos métodos se podrían generalizar para crear modelos de elementos finitos de otros tipos de células.

Los usuarios de este protocolo pueden omitir paso 1 y la parte de la reconstrucción del paso 2 si tienen acceso a un montón de imagen de microscopia electrónica existente. Usuarios que deseen adquirir sus datos en colaboración con microscopistas electrón más experimentados deseen discutir y comparar la fijación y los procedimientos de tinción en el paso 1 con el experto para determinar un protocolo óptimo para la adquisición.

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Protocol

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Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por la Universidad de Auckland Animal Comité de ética y el Comité de uso, donde originalmente se desarrolló el protocolo de tejido y cuidado de animales institucional de la Universidad de California San Diego.

1. experimental Preparación

  1. Preparar soluciones de sodio 0.15 M y 0,3 M amortiguadores cacodilato a pH 7.4 según tabla 1.
  2. Preparar fijador de glutaraldehido (2% paraformaldehido (PFA) + glutaraldehído 2.5% + 0.2% ácido tánico en buffer de cacodilato de sodio de 0.15 M a pH 7.4) usando componentes listados en la tabla 1.
    1. Disolver 2 g de polvo de la PFA en 20 mL de agua destilada a 60 º C sobre una placa calefactora con agitación constante.
    2. Agregar solución de NaOH de 1 M hasta que la solución es clara.
    3. Espere hasta que la temperatura de la solución está por debajo de 40 ° C, luego añadir 10 mL de glutaraldehído y 20 mL de cacodilato de sodio de 0.3 M.
    4. Añadir 0,2 g de ácido tánico y disolver en la solución.
    5. Añadir 50 mL de cacodilato de sodio de 0,15 M.
    6. Guardar tres o cuatro viales de centelleo de 20 mL de fijador en nevera a 4 ° C o en hielo si se utiliza el mismo día.
  3. Preparar solución de Tyrode con 20 mM 2, 3-butanedione monoxima (BDM), según la receta en la tabla 1.
  4. Construir un aparato Langendorff dentro de un armario del humo.
    1. Abrazadera de dos tubos de jeringa de plástico de 100 mL a dos soportes diferentes réplica, aproximadamente 70 cm de altura desde la base de soporte.
    2. Conecte los tubos de jeringa de plástico y un tubo conector usando 3 mm diámetro interior tubería y una llave de tres vías como se muestra en la figura 1.
    3. Colocar una cánula de diámetro externo de 3 mm en la parte inferior del conector de la tubería, donde el corazón se va atado para la fijación de la perfusión.
  5. Llenar los tubos de jeringa con solución de Tyrode y fijadores soluciones a 37 ° C.
    1. Eliminar burbujas de aire dentro de la tubería pasando las soluciones de la jeringa a través de ellos.

2. adquirir datos de microscopia electrónica de la ultraestructura de cardiomiocitos

  1. Preparar el animal para la supresión y la fijación química del corazón.
    Nota: Este protocolo detalla los pasos para procesar adulto tejido cardiaco masculino del rata de Wistar (nombre de una raza específica de rata albina). El protocolo puede requerir modificaciones del tejido cardíaco se obtiene de otras especies.
    1. Anestesiar el animal por el tratamiento de la rata (200-250 g de peso corporal) con 0,5 mL de 250 heparina U/mL mediante inyección intraperitoneal. Espere 10 minutos, y luego la rata con la inyección intraperitoneal de pentobarbital (210 mg/kg de peso corporal).
    2. Prueba el reflejo del pellizco del dedo del pie para confirmar un grado adecuado de anestesia.
    3. Eutanasia a los animales por dislocación cervical.
    4. Cosecha el corazón mediante los procedimientos de disección similares a artículos previamente publicados de JoVE22,23, luego colocarlo en solución salina helada.
    5. Aislar la aorta ascendente y la canule. Asegúrese de que la punta de la cánula se encuentra justo por encima de la la válvula semilunar, donde las arterias coronarias se ramifican. Ate un hilo alrededor de la aorta ascendente.
    6. Conectar la cánula al aparato de Langendorff impulsado por gravedad a ~ 70 cm sobre la base del sistema (figura 1).
    7. Gire la llave de paso en el sistema de Langendorff a inundar el corazón con solución de Tyrode, incluyendo 20 mM BDM (un inhibidor de la miosina) durante 2-3 minutos.
    8. Gire la llave de paso para iniciar la perfusión con fijador de 2% paraformaldehído, glutaraldehído al 2.5% y 0,2% ácido tánico en cacodilato de sodio de 0.15 M a 37 ° C durante 10 minutos. Si tiene éxito, el corazón marrón claro y ser dura y gomosa.
    9. Usando una cuchilla de afeitar, disecar bloques de tejido de la pared libre (lateral) ventricular izquierda y obtener tejido bloquea aproximadamente 1 mm3 de tamaño.
    10. Guarde las muestras en viales de centelleo 20 mL previamente enfriado el mismo fijador en el hielo para 2 h. almacenan tantas muestras como sea posible en los frascos y aseguran que las muestras son sumergidas en la solución.
      PRECAUCIÓN: Es importante mantener las muestras frías hasta después del paso de deshidratación 100% abajo.
  2. Más fijación y tinción de muestras para microscopía electrónica.
    1. Vierta 100 mL de buffer de cacodilato de sodio de 0.15 M en un vaso de vidrio y enfriar sobre hielo.
    2. Preparar volúmenes iguales de 4% el tetróxido de osmio y 0,3 M cacodilato de sodio, seguido por la adición de 0,08 g de ferrocianuro de potasio para hacer una solución de tinción de metal pesado que contiene ferrocianuro de potasio 2% en 2% el tetróxido de osmio y 0.15 M cacodilato de sodio. Enfríe la solución en el hielo.
    3. Pipeta el fijador hacia fuera y reemplazarlo con suficiente frío tampón de cacodilato de sodio de 0.15 M para sumergir las muestras en los frascos. Colocar los viales en hielo durante 5 minutos.
    4. Repita el paso 2.2.3 cuatro veces más con cacodilato de sodio de 0.15 M para quitar exceso fijador.
      PRECAUCIÓN: No utilice pipetas de vidrio debido a pequeños fragmentos pueden entrar en la muestra y pueden arruinar cuchillas de diamante durante el bloque de seccionamiento de tejidos. Es importante para pre-enfriar todas las soluciones en el hielo antes de agregar a la muestra. También es importante que la muestra sigue siendo cubierta por la solución de todos los tiempos (muy breves períodos de cobertura parcial que dura no más de unos pocos segundos pueden ser brevemente toleradas durante intercambios de solución). Al lavar o reemplazar soluciones, añadir la nueva solución rápidamente después de retirar la solución anterior. Mantener los viales de centelleo en el hielo entre lavados. Tenga en cuenta que este paso no es tiempo sensible, los bloques de tejido se pueden lavar un poco más largos, si es necesario.
    5. Reemplazar amortiguador de cacodilato de sodio con metal pesado helada mancha solución y almacenar en hielo durante la noche. Asegurar que el ferrocianuro está bien mezclado agitando el frasco con la mano; la solución debe da vuelta a negra.
      PRECAUCIÓN: El trabajo en la campana extractora al realizar este paso porque el osmio es tóxico.
    6. Diluir solución stock 4% acuosa uranilo acetato (UA) (tabla 1) 2% utilizando volúmenes iguales de material solución UA y agua bidestilada y enfriarse en el hielo.
    7. Reemplazar metales pesados mancha con amortiguador de cacodilato de sodio de 0.15 M enfriado con hielo y dejar la muestra Incubar durante 5 minutos en hielo.
    8. Repita el paso 2.2.7 cuatro veces más hielo para enjuagar cualquier solución de tinción de exceso del metal pesado.
    9. Enjuagar las muestras cuatro veces, con un período de espera de 2 minutos en el medio en agua purificada (destilada doble es suficiente).
    10. Agua purificada con helada 2% UA y deje que la muestra de incuban por 60-120 min en hielo.
    11. Enfriar cinco viales de centelleo de 20 mL de etanol (lo suficiente para sumergir las muestras) en el hielo que se utilizará en el paso de deshidratación. Los seis frascos tienen crecientes porcentajes de etanol en agua destilada: 20%, 50%, 70%, 90% y 100%.
    12. Vierte acetona pura en otro vial de centelleo de 20 mL y enfriar en hielo junto con los frascos de etanol.
    13. Enjuagar las muestras en agua purificada cuatro veces con períodos de espera de 2 minutos en el hielo para lavar exceso UA.
  3. Deshidratar muestras en etanol.
    1. Deshidrate en etanol frío serie sustituyendo sucesivamente solución en el frasco de la muestra como sigue, en el hielo: 20% de etanol durante 10 minutos; etanol al 50% durante 10 minutos; etanol al 70% durante 10 minutos; etanol al 90% durante 10 minutos; a continuación, dos veces en etanol 100% durante 10 minutos.
    2. Muestra a la temperatura de transición sustituyendo el etanol 100% final con acetona pura refrescado y coloque el frasco de la muestra en un banco de laboratorio de temperatura durante 10 minutos.
    3. Realizar un lavado más de 10 min en acetona pura a temperatura ambiente para eliminar la condensación que es observable dentro de los frascos. Durante la incubación, son las soluciones de acetona/resina.
    4. Sustituir la acetona pura en los frascos con 50: 50 resina pura acetona y epoxy (con proporciones de componentes de resina epoxi según lo indicado por el fabricante). Utilizar todos los componentes de un mismo lote. Dejar los frascos de muestra lleno de resina durante la noche en un rotor.
  4. Incrustar las muestras en resina.
    1. Reemplazar la resina de 50: 50 con la resina de 75% (25% acetona) e incubar durante 3 h, seguido por la posterior incubación/infiltración en resina 100% durante 4 h a temperatura ambiente.
    2. Vuelva a colocar la resina 100% con resina 100% fresco y dejar los frascos de muestra durante la noche para una penetración más profunda de la resina en las muestras de tejido.
    3. Tomar muestras de los frascos y colocarlos en recipientes que son respetuosos del horno y tienen una base plana; aluminio o papel de plata para horno puede usarse para este propósito, por ejemplo.
    4. Verter suavemente (para evitar el desplazamiento de las muestras) dulce resina sobre las muestras (así incorporar las muestras en resina) y polimerizar la resina y las muestras en un horno a 60 ° C durante 48 h.
  5. Volver a orientar bloques de resina a las celdas de imagen de corte transversal.
    1. Obtener 1 μm las secciones de la prueba de espesor de los bloques de resina utilizando un ultramicrótomo con un cuchillo de vidrio para evaluar células orientación24.
    2. Mancha de las secciones de prueba gruesa de 20 s con 1% tolueno azul y 1% de bórax.
    3. Examinar la orientación de la célula de músculo bajo un microscopio de campo brillante.
    4. Basado en la orientación que se infiere de las imágenes de las secciones de la prueba de manchado, reorientar longitudinalmente u oblicuamente orientados (similar a la figura 2A) bloques para asegurar que las células se exponen a la cuchilla de vidrio por lo que cortaron en sección transversal (la resina similar a la figura 2B).
  6. Imagen las secciones de tejido usando la tomografía de electrones.
    1. Obtener secciones semi-delgadas (~ 300 nm) del tejido reorientarse bloques usando un diamante cuchillo y transferir las secciones sobre rejillas de cobre25.
    2. Mancha de las secciones de espesor con 2% UA y Sato plomo25.
    3. Partículas de oro coloidal se aplican a ambos lados de las secciones25.
    4. Obtener sistemas de inclinación única o de doble eje serie de imágenes proyectadas de-70 ° a + 70 °25.
  7. Utiliza IMOD20 para reconstruir la pila de imagen 3D (una serie de imágenes 2D que proporcionan la información 3D de una sección de tomografía electrónica única) de la célula. Esta pila reconstruida será segmentada en el paso siguiente.

3. segmento de miofibrillas y mitocondrias regiones del conjunto de datos de imagen en 3D de EM

  1. Ejecutar el programa IMOD "3dmod".
  2. Dentro de la interfaz gráfica de usuario de 3dmod, escriba la dirección de la ".rec" o ".mrc" archivo que contiene el 3D reconstruido dataset de la imagen de la célula (generada en el paso 2.7) en la casilla de entrada "archivos de la imagen:", pulse "OK".
  3. En el menú "Archivo", seleccione nuevo modelo y, a continuación, guarde el archivo con un nombre apropiado usando "Guardar modelo como"... en "Archivo" del menú.
    Nota: Un objeto en IMOD puede contener una colección de componentes segmentados que constituyen el "objeto". De forma predeterminada, un nuevo modelo contiene un nuevo objeto con el id "#1".
  4. En el menú "Especial", seleccione "Herramientas de dibujo". Se abrirá una nueva barra de herramientas similar a la que se muestra en la Figura 3A.
    Nota: Hay varias herramientas que pueden utilizarse para crear contornos alrededor de los límites de diferentes organelas. Más ayuda sobre cómo utilizar estas herramientas puede encontrarse en la documentación de20 IMOD.
  5. Elige la opción de "Esculpir" en el menú de "Herramientas de dibujo" y mueva el ratón sobre la ventana de imagen; aparecerá un contorno circular centrado en el puntero del ratón.
  6. Pulsando el botón central del ratón sobre una mitocondria (las regiones más oscuras de los archivos de imagen, como se ilustra por las demarcaciones con líneas de contorno verdes en la Figura 3A), arrastre el perímetro del contorno de círculo en la forma de su límite.
  7. Una vez contorneado de la frontera de la mitocondria, suelte el botón del medio y repita los pasos 3.6 por cada mitocondria en los datos. Cada contorno será reconocido automáticamente por IMOD como un nuevo contorno dentro del objeto mismo.
  8. Bajo la "edición | Objeto "menú, seleccione"Nuevo"para crear un nuevo objeto. Automáticamente se incremente el número total de objetos en uno y asignar a este número al nuevo objeto.
  9. Repita los pasos 3.6 y 3.7 segmento y contornos de la miofibrilla.
  10. Repita el paso 3,8, seguido del paso 3.6, para segmentar el límite de la célula, así.
  11. Guarde el archivo de modelo en el menú "Archivo".
  12. Ejecutar los siguientes comandos en una ventana de línea de comandos para convertir cada objeto de agrupación en una máscara binaria como se ilustra en la figura 4A-c.
    1. Extraer un objeto específico de la modelo "imodextract objeto modelfile outputmodelfile" donde el "objeto" es el número del objeto se extrae.
    2. Crear una máscara para ese objeto: imodmop-máscara 255 outputmodelfile imagefile outputmask.mrc
    3. Convertir el archivo en una pila de tif: mrc2tif -s outputmask.mrc outputmask.tif

4. crear una malla de elementos finitos de componentes segmentados

  1. Iso2mesh es un programa MATLAB libremente disponible para convertir pilas de imagen TIFF en mallas de elementos finitos tetraédricos volumétrica. Descargar y añadir el path MATLAB iso2mesh de iso2mesh.sourceforge.net.
  2. Descargar el código fuente y los datos para simular racimos de RyR en la malla de los github sitio web https://github.com/CellSMB/RyR-simulator.
  3. Inicie la aplicación CardiacCellMeshGenerator MATLAB (figura 5).
  4. Cargar las máscaras de componentes de diferentes organelas en MATLAB mediante los tres botones en la parte superior izquierda de la interfaz gráfica.
  5. Crear a otra pila de imagen binaria que demarca las diferencias entre las miofibrillas y mitocondrias como se muestra en la figura 6A.
    1. Abra el ImageJ.
    2. Utilizando el archivo | Abrir cuadro de diálogo, cargar las pilas de tiff de miofibrillas y mitocondrias en el programa.
    3. Iniciar el plugin de además de la imagen seleccionando "proceso | Calculator Plus ".
    4. Seleccionar la pila de la imagen de miofibrilla como i1, la mitocondria pila como i2 de la imagen y elegir el operador "Agregar". Haga clic en "Aceptar".
    5. Después de una nueva pila de imagen que representa el resultado de 4.5.4 aparece, seleccione "editar | Invertir"para producir una pila de imagen similar a la figura 6A.
  6. Cargue el archivo que contiene la pila de la imagen binaria de las brechas entre las miofibrillas y mitocondrias pulsando el botón de "RyRGapsFile" en el programa de CardiacCellMeshGenerator.
  7. Presione "Generar malla" en la interfaz gráfica de usuario. Esto activará el iso2mesh comando v2m con la opción 'cgalmesh' para generar una malla tetraédrica similar a la figura 4E. Tres archivos se encontrarán al final de este paso: un archivo .ele, un archivo .face y un archivo de .node que contendrá el listado de nodos que componen los elementos, los nodos que conforman las caras y las coordenadas de los nodos , respectivamente.

5. matemáticamente del mapa la densidad espacial variable de canales del Ion de interés sobre la malla de elementos finitos.

  1. Generar los insumos necesarios para el simulador de RyR pulsando el botón etiquetado entradas generar RyR-simulador de la interfaz gráfica.
    Nota: El botón activará una función generateRyRsimulatorInputs.m, que utiliza la información siguiente en el paso 4 para generar las entradas:
    (1) outDir: la ubicación para archivos de salida que son necesarios para la simulación de cluster de RyR.
    (2) imres: la resolución de píxeles en las tres direcciones de las pilas de imágenes.
    (3) myofibril_file: el archivo que contiene la pila de imagen binaria como la que se muestra en la Figura 4B.
    (4) sarcolemma_file: el archivo que contiene la pila de imagen binaria como la que se muestra en la Figura 4A.
    (5) ryrgaps_file: el archivo que contiene la pila de imagen binaria como la que se muestra en la figura 5A.
    1. Después de esta función se ejecuta, compruebe que los siguientes archivos se han creado dentro del directorio especificado como el camino outDir:
    • d_axial_micron.txt, que representa la distancia axial entre la posición de los discos z y el resto de los píxeles en la pila de la imagen.
    • d_radial_micron.txt, que representa la distancia euclidiana (excluyendo el componente axial) de cada píxel en el conjunto de posibles ubicaciones de cluster de RyR a los píxeles en el plano z-disco.
    • W_micron.txt, que representa la lista de coordenadas espaciales de todos los puestos disponibles para grupos de RyR para estar presente.
    • Los restantes 3 archivos en la carpeta contienen el sufijo "_pixel" en lugar de "_micron" para denotar que los valores dentro de estos archivos han sido escritos en forma de coordenadas de píxel.
  2. Simulación de distribuciones de cluster de RyR en la pila de la imagen binaria de las miofibrillas.
    1. Presione el botón etiquetado "Abierto de RyR-simulador en R" para iniciar el programa de R.
    2. En la R-gui, seleccione "archivo | Open"y buscar el archivo"settings. R"dentro del paquete de RyR-Simulator (RyR-simulador/fuente/settings. R).
    3. También abrir el archivo ryr-simulador-paralelo. R (ubicado en RyR-simulador/fuente/ryr-simulador-paralelo. R). entornos como Rstudio (https://www.rstudio.com) o una interfaz de línea de comando simple se puede utilizar, por ejemplo, el comando R64 en una ventana de comandos o shell.
    4. Cambiar los parámetros de configuración. R archivo tal como se detalla a continuación:
      1. Ruta2 conjunto a la dirección de la carpeta que contiene archivos que se enumeran en 5.1.2 para una pila experimental adquirido imagen confocal de racimos de RyR y miofibrillas.
        Nota: El github repositorio carpeta entrada-archivos/master-célula ya contiene archivos que se generaron de una pila de imagen previamente recogidos.
      2. Establecer Path4 a una dirección de la carpeta donde se almacenan los archivos que se generaron en el paso 5.1.2.
      3. Establecer punto de Path3 a una carpeta donde el usuario desea las ubicaciones de cluster de RyR simuladas para salvarse.
      4. Conjunto de N al número de racimos de RyR a simular en el modelo (típicamente en el rango de 200 a 300).
      5. Etol Set, una tolerancia de ajuste, la diferencia entre la distribución espacial experimental medida de RyR racimos y la distribución espacial del modelo simulado de racimos de RyR.
      6. Set numIter para limitar el número de intentos que el simulador de RyR debe adoptar para encontrar un patrón de cluster de RyR simulado que satisface el valor etol.
        Nota: Establecer valores para etol y numIter a los valores típicos en la configuración. Archivo de la R.
      7. Conjunto numPatterns al número de diversos patrones de cluster de RyR que se quiere simular (por lo general, es útil practicar simulando 99 patrones de confianza estadística).
      8. NumCores para habilitar el uso de varios hilos de CPU (cores) más rápido en paralelo con R para simular los patrones de punto de ajuste.
    5. Compruebe que los siguientes paquetes se instalan mediante el instalador del paquete gui en nieve R:, doSNOW, doparallel, foreach, iteradores y rgl.
    6. Ejecutar el simulador introduciendo el siguiente comando en la ventana de comandos de R: fuente (' camino a ryr-simulador-paralelo. R', chdir = TRUE)
      Nota: La salida del programa RyR-Simulator es una lista de archivos .txt (se generará un archivo numPatterns) que contienen listas de coordenadas de filas de N y simularon de 3 columnas, que representan la x, y y coordenadas z de los N clusters de RyR.
  3. Mapa puntos como densidades espaciales en un modelo computacional utilizando el CardiacCellMeshGenerator.
    1. Seleccionando el botón etiquetado "Seleccionar archivo de RyR puntos", elija un archivo de texto simulado de RyR cluster distribución de los que tenían salida por el simulador de RyR.
    2. Ejecutar a "RyR densidad Mapper" en la GUI de MATLAB. Este mapa de la ubicación espacial de los grupos de RyR simulados en el archivo .txt en paso 5.3.1 sobre la malla de elementos finitos que se generó en el paso 4.8 utilizando un método llamado un núcleo esférico intensidad estimador método26.
      Nota: La salida de este paso es un archivo con extensión .txt que contiene una lista de valores para la densidad numérica del canal de ion por unidad de volumen esférico en cada uno de los nodos de la malla computacional.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figura 2 a figura 7 proporcionar resultados representativos de varios pasos claves en este protocolo: (i) visualizar y reorientación de los bloques de tejido para microscopía electrónica transversal vistas; (ii) generar una pila de imágenes de microscopia electrónica 3D; (iii) segmentación de ultraestructura celular para organelos de interés; (iv) generación de una malla de elementos finitos utilizando iso2mesh; (v) simulando una...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo anterior esboza pasos clave para generar un modelo geométrico de la novela elementos finitos de ultraestructura de cardiomiocitos. El método permite modalidades de fusión computacional de microscopía diferentes (o, en principio, otros datos) desarrollar un modelo computacional más comprensivo de la dinámica de cardiomiocitos que incluye detalles de la arquitectura espacial de la célula. No hay actualmente ningún otro protocolo disponible para crear un modelo de un cardiomiocito.

P...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por la Real Sociedad de Nueva Zelanda Marsden rápido inicio beca 11-solución-184, la beca de investigación de programa de ciencia de fronteras humana RGP0027/2013 y el australiano investigación Consejo descubrimiento proyecto Grant DP170101358.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Materiales
Cloruro de sodioSigma-Aldrich746398
Cloruro de calcioSigma-AldrichC8106
Cloruro de magnesioSigma-AldrichM2393
Bicarbonato de sodioSigma-AldrichS5761
Cloruro depotasioSigma-AldrichP5405
DextrosaSigma-AldrichD9434
Hidróxido de sodioSigma-AldrichS8045
ProbenecidSigma-AldrichP8761
Monóxido de 2,3-butanedionaSigma-AldrichB0753
25% Glutaraldehído EM Grado (botella de 500 ml)Merck354400-500ML
ParaformaldehídoSigma-AldrichP6148
Ácido tánicoSigma-Aldrich403040-500G100g Grado EM
Cacodilato de sodioSigma-AldrichC0250
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Sigma-AldrichP4593
Tetróxido de osmioSigma-Aldrich75632-10ML4% en agua, botella de 5 ml (o botella de 10 ml también disponible)
Acetato de uraniloEM Sciences22400botella de 25 g
Ferrocianuro de potasioMerck Millipore104973
azul de toluenoSigma-AldrichT3260
BóraxSigma-AldrichS9640también denominado borato de sodio
EtanolSigma-Aldrich792780Diluido en diferentes porcentajes con agua pura
AcetonaEM SciencesRT10017
Kit de resinaEM Sciences14040ACM Durcupan funciona bien
Ácido clorhídricoSigma-AldrichH98921Solución normal
Equipo
UltramicrótomoLeicaEM UC7
Electrónica de transmisión microscopioThermoFisher ScientificTecnai F30http://www.leica-microsystems.com/
Soporte de retortaProscitechT752
TubingBioStrategy75831-346para aparatos de perfusión Langendorff, se recomienda un diámetro de 3 mm, pero no es esencial
Llaves de pasoSDRQP13813para tubos Langendorff; el producto es solo un ejemplo, el usuario puede seleccionar cualquier
abrazaderas de soporte de retortaProscitechT715
Jeringas de plásticoSDRQPC1108para soluciones en aparatos Langendorff
Sutura de seda para canulación, 7-0TeleFlex15B051000para atar el corazón en un aparato Langedorff
CánulaFabricada con aguja de acero de 3 mm de diámetro exterior
Estera de goma para placa de PetriProscitechH068para su uso como tabla de cortar durante la disección de corazón fijo
Cuchillas de afeitarProscitechL056para cortar el corazón fijo en bloques pequeños para el procesamiento EM
Frascos de vidrioBioStrategy89000-236para el almacenamiento de soluciones durante la fijación y el procesamiento de tejidos para vasos de precipitados EM
BioStrategy213-0477para el almacenamiento temporal y durante la perfusión
Viales de centelleoBioStrategy548-2170para muestras de tejido durante el procesamiento EM
Kit de disecciónProscitechT161para la disección de animales
Filtros de jeringaProscitechWS3-02225Spara la purificación de acetato de uranilo
Tazasde plata De cualquier tienda de productos de panadería
Cuchillode diamante DupontLa102680-780produce las mejores secciones.
Oro coloidalBBI SolutionsEM. GC1515 nm
rejilla de malla EM deProscitechGCU150se puede probar una variedad de tamaños: GCU150h, GCU200h por ejemplo
Pipetas de eliminación de plásticoProscitechLCH20mejor usar desechables de plástico, especialmente cuando se trabaja con resina
Software
SerialEMUniversidad de Boulderadquisición de tomografía
MATLAB,MathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
IMODUniversidad de Boulderalineación y segmentación de imágenes
, iso2meshdisponible en
http://iso2mesh.sourceforge.net Fiji o un software de procesamiento de imágenes similarImageJFiji is Just Image Jdisponible en https://fiji.sc para la manipulación de imágenes binarias pilas
de códigos/datos de RyR-SimulatorEl grupoestá disponible en https://github.com/CellSMB/RyR-simulator
CardiacCellMeshGeneratorEl grupoviene con RyR-Simulator en la carpeta "gui-version"
R-statistics softwareR-projectDescargar desde https://www.r-project.org
spatstatR-projectinstalación a través del programa
R rglInstalación del proyectoR a través del programa
R doparaleloInstalación del proyectotravés del programa R
foreachInstalación del proyectoR a través del programa
R doSNOWInstalación del proyecto
los iteradoresdel programa R Instalación del proyectotravés del programa R
para hornear de aluminio/papel versión de ángulo de 35 grados de BioStrategy oro coloidal , , CellSMB CellSMB R a R a través de R a

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