Artículo de método

Proyección de imagen funcional de fábricas de transcripción Viral mediante microscopia de fluorescencia 3D

DOI:

10.3791/56832

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18 de enero de 2018

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1Department of Dermatology, University of California Davis School of Medicine, University of California, Davis, 2Center for Biophotonics, Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of California, Davis

En este artículo

Resumen

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Fábricas transcripcionales virales son estructuras discretas que se enriquecen con celular polimerasa de ARN II para aumentar la transcripción de genes virales durante la reactivación. Aquí, se describe un método para localizar sitios de transcripción activamente de cromatina viral en el espacio 3D nuclear por una combinación de la hibridación de RNA en situ y tinción de inmunofluorescencia.

Resumen

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Es bien sabido que la regulación espacial y temporal de los genes es una parte integral de expresión génica adecuada de gobernar. En consecuencia, es valioso comprender dónde y cuándo transcripción tiene lugar en el espacio nuclear y visualizar la relación entre episomas infectados dentro de núcleo de la célula misma. Aquí, han sido la inmunofluorescencia (IFA) y RNA-peces combinedto identificar activamente transcribir episomas herpesvirus asociado a sarcoma de Kaposi (KSHV). Manchando de antígeno nuclear asociado a latencia KSHV (LANA), es posible localizar donde existen episomas virales dentro del núcleo. Además, mediante el diseño de sondas de RNA-pescado a la región del intrón de un gen viral, que se expresa sólo durante la infección productiva, transcritos de RNA nacientes pueden ser situados. Utilizando esta combinación de sondas moleculares, es posible visualizar el montaje de fábricas de transcripción viral grande y analizar la regulación espacial de expresión génica viral durante la reactivación de KSHV. Incluyendo tinción de anticuerpo anti-ARN polimerasa II, uno puede también visualizar la asociación entre la agregación de la ARN polimerasa II (RNAPII) y transcripción de KSHV en la reactivación.

Introducción

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Se ha vuelto cada vez más claro que la organización espaciotemporal del núcleo desempeña un papel importante en la modulación de la expresión génica finamente sintonizada en eucariotas. Más genes específicos de tejido son distribuidos en muchos cromosomas y necesitan ser regulado sincrónicamente con el fin de responder a estímulos específicos en una forma coordinada1. Las células construyen núcleos de cromatina activa (ACH) como una forma de reunir a los genes y sus componentes cis-reguladoras a un específico espacio nuclear1.

También se ha demostrado por diversos estudios que aunque el núcleo parece muy denso y viscoso, moléculas biológicamente activas pueden atravesar el núcleo bastante rápidamente a través de la difusión2. Como consecuencia de esta propiedad efímera mayoría proteínas ADN 'jump' de enlace sitio obligatorio sitio, sintiendo su camino alrededor del espacio nuclear, que permite que un núcleo altamente adaptable y versátil2.

A pesar de este comportamiento dinámico de biomoléculas dentro del núcleo, nucleares cuerpos sin membranas tales como (pero no limitado a) nucleolo, cuerpos de Cajal los cuerpos nucleares de la leucemia promielocítica (PML NB) todavía existen. Es a través de una variedad de mecanismos tales como repeticiones en tándem DNA (nucleolo), ARNr (nucleolo) y proteínas estructurales como coilina (cuerpos de Cajal) o LMP proteínas (PML NB) que estas construcciones junto3,4,5 . Estas estructuras y otras congregaciones como fábricas de transcripción sirven como andamios que no sólo incrementan la concentración local de componentes requeridos, sino que también regulan la composición de proteínas y ácidos nucleicos dentro de ellos, en definitiva, crear un sitio central para las funciones celulares eficiente6.

Visualizar cuando y donde forma estructuras nucleares ofrece una gran cantidad de información a los investigadores estudiar la epigenética. Desde una perspectiva de la virología, la reactivación del virus latente infectados, como KSHV, altera significativamente el paisaje del núcleo y distribución de enzimas nucleares cambiar transcripción principalmente de genes celulares a genes virales, en última instancia a producir la progenie viral completamente funcional7,8. ¿KSHV manipular la maquinaria de expresión de genes celulares para facilitar la expresión del gen viral? Dicha información también podría arrojar luz sobre mecanismos de regulación génica celular temporal.

Como todos otros herpesviruses, KSHV tiene dos ciclos de vida se llama latencia y replicación lítica. KSHV reside principalmente en la etapa de latencia, en que la mayor parte de su gen viral expresión es silenciada, menos latencia asociados genes9,10. Durante la latencia que KSHV produce latencia asociada antígeno nuclear (LANA), de la que constitutivamente se une los genomas virales y correas cromatina viral en el cromosoma humano11. Debido a la íntima relación de LANA con el genoma viral, es posible utilizar IFA y DAPI mancha y ubicar donde estaban los episomas virales en relación con la cromatina de host.

Para estudiar la reactivación de KSHV episome sola y la asociación con otros episomas virales en una célula infectada, se ha establecido una estrategia para localizar transcribiendo activamente cromatina viral en situ . Por consiguiente, LANA y RNAPII IFA con intrón RNA-peces fueron combinados, mediante la generación de sondas de RNA-peces que se unen a la región del intrón (sonda exacta secuencias pueden encontrarse en más reciente publicación8 del laboratorio Izumiya) de la proteína viral clave K KSHV-Rta-el que es esencial y suficiente para la reactivación de KSHV-era posible identificar en su transcripción se toma colocar8,11,12,13,14,15 . Este intrón técnica FISH RNA permite a los investigadores visualizar donde ARNm se transcribe inmediatamente antes de empalmar y exportado al citoplasma16,17.

KSHV puede ser reactivado por varios estímulos químicos como ésteres de forbol como el 12-O-Tetradeconoyl-forbol-13acetate (TPA) e inhibidores de histona deacetilasa como butirato, además KSHV pueden ser inducidos a reactivar por la sobreexpresión de el factor de la transcripción viral, K-Rta19. Los investigadores han aumentado con éxito la eficacia de la reactivación de KSHV sincronizando los ciclos de la célula antes de inducir la reactivación18. Así, para estos estudios en particular, las células fueron sincronizadas mediante un bloque doble timidina (Protocolo se describe a continuación) y se incubaron con TPA y doxiciclina (Dox) por un corto tiempo. Doxycyline se utilizó debido a que la línea celular utilizada en estos experimentos tiene un cassette K Rta doxiciclina-inducible, que fue reproducido de cDNA y no incluye la región del intrón de K-Rta. Aunque es posible reactivar KSHV usando sólo había inducido expresión K-Rta, se ha comprobado por otros investigadores que debido a una variedad de factores bioquímicos diferentes expresión K Rta solo demuestra para ser una reactivación débil estímulos20. Mediante la combinación de todos ellos y limitando las incubaciones de drogas en un corto período de tiempo, se logró una reactivación de KSHV robusta pero no demasiado artificial para la proyección de imagen.

Después de etiquetar LANA, RNAPII, K-Rta introns y ADN como se describen en este artículo, imágenes 3D de la fluorescencia se realizaron utilizando un microscopio de deconvolución de campo amplio. Después de procesar con software de imágenes, puede evaluarse adecuadamente la distribución espacial de episomas virales activos. Con esta técnica se pueden estudiar las cuestiones centrales sobre la naturaleza fundamental de la formación de núcleos de cromatina activa y otras estructuras nucleares. Tener idénticos episomas virales en una sola célula que procesa los mismos elementos regulatorios puede representar una herramienta de investigación único para profundizar en el conocimiento de mecanismos de regulación del gene espaciotemporal.

Una limitación de múltiples muestras celulares fijadas en diferentes puntos temporales para caracterizar un proceso inherentemente dinámico molecular de la proyección de imagen es que sutil o pequeños cambios en la distribución de la fluorescencia son detectados o considerado como insignificantes. Esto es cierto a menos que en el caso raro, cada célula observada muestra el mismo cambio sutil. Así, la relación espaciotemporal completo de transcripción viral activa y otras estructuras nucleares no puede ser críticamente evaluada usando proyección de imagen fija. Para hacer frente a estos retos técnicos, el mejor enfoque es células vivas imágenes que han marcado episomas virales y para seguir la localización de enzimas claves del celulares con el tiempo.

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Protocolo

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PRECAUCIÓN: Las líneas celulares utilizadas en este procedimiento contengan virus infecciosos, tenga cuidado y proceden sólo en instalaciones BSL de nivel 2 o superior.

1. preparación y mantenimiento de la célula

  1. TREx-K-RTA BCBL-1 células de la cultura (o KSHV otro infectado líneas de células PEL) en medio RPMI1640 suplementado con 15% de suero bovino fetal (FBS) y solución de glutamina 1% penicilina estreptomicina.
  2. Crecen las células a 37 ° C con 5% dióxido de carbono (CO2), asegurándose de que crecer continuamente y dividir celdas en una proporción de 1:4 cada 2-4 días.
  3. Seguimiento de cultivos celulares con un microscopio de luz cada día para confirmar la buena célula crecimiento y morfología, que se recomienda reiniciar el cultivo celular o para ajustar las condiciones de cultivo celular por consiguiente.

2. timidina sincronización e inducción lítica

  1. En un plato de Petri de 10 cm, placa TREx-K-Rta BCBL-1 las células recién preparan medios (1 x 106 células/2 mL de media)
  2. Añadir timidina 200 mM (concentración final: 2 mM) en el plato, mezclar e incubar durante 18 h.
  3. Centrifugar las células durante 5 minutos a 500 x g. lavan las células con estéril de 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS), centrifugar nuevamente y resuspender las células en los medios recién preparados. Repita para un total de 3 lavados. Resuspender en los medios recién preparados.
  4. Permitir que las células en fase S de la salida de 8 h.
  5. Añadir timidina (concentración final: 2 mM), mezclar e incubar durante 16 h.
  6. Centrifugar las células durante 5 minutos a 500 x g. lavan las células con estéril de 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS), centrifugar nuevamente y resuspender las células en los medios recién preparados. Repita para un total de 3 lavados. Resuspender en los medios recién preparados.
  7. Para inducir la reactivación viral, añadir 12-O-tetradecanoyl-phrobol-13-acetate (TPA, concentración final de 20 ng/mL) y doxiciclina (DOX, concentración final 100 ng/mL) a la cultura de célula, mezclar e incubar durante 4 h. Para líneas celulares sin un cassette inducible K-Rta, estimular la reactivación con TPA (concentración final de 20 ng/mL y sodio butirato (1 mM)).
  8. Centrifugar las células durante 5 minutos a 500 x g. lavan las células con estéril de 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS), centrifugar nuevamente y resuspender las células en medios de cultivo completa. Repita para un total de 3 lavados. Resuspender en medio de cultivo completo.
  9. Permitir a las células a crecer durante 24 h.

3. fijación y permeabilización

Nota: Antes de continuar, asegúrese de fijación solución (3,7% formaldehído en PBS tratada con DEPC), dietil pirocarbonato tratados con tampón fosfato salina (DEPC-PBS), glicina DEPC PBS (concentración final de glicina: 100 mM) y permeabilizating (el 50% acetona, metanol 50%) están preparados. Por lo general, cada diapositiva se requieren de al menos 0,5 millones de células, multiplicar si es necesario e incluyen las células extras para la parte posterior para arriba especialmente si las células no son saludables.

  1. Recoger las células en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  2. Centrifugar las células por 2 min a 200 x g. lavar las células 3 veces con 1 mL de PBS estéril con DEPC. Resuspender en 1,2 mL de PBS con DEPC.
  3. Coloque el número apropiado de cubreobjetos (determinada por la configuración experimental) en la parte inferior de una placa de 6 pozos.
  4. Pipetee 200 μL de células mezcla DEPC PBS sobre cada cubreobjetos, asegurar que al menos 0,5 millones de células en cada diapositiva. Permitir a las células a reposar 2 min y aspirar exceso de DEPC de PBS, dejando sólo una delgada capa de células. Es normal que las células para ser eliminado en este proceso.
    PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico, usar protección adecuada.
  5. Agregar cuidadosamente 1 mL de solución (3,7% formaldehído en PBS con DEPC) a cada cubreobjetos de fijación. Permitir a las células a corregir por 10 min.
  6. Cubreobjetos Lave 3 veces con PBS con DEPC.
  7. Agregar cuidadosamente 1 mL de glicina con DEPC PBS (concentración final de glicina: 100 mM) a cada cubreobjetos. Permitir a las células saciar durante 5 minutos.
  8. Añadir 1,5 mL de PBS con DEPC y cualquier lugar en un agitador durante 5 minutos o agite con firmeza pero suavemente en la mano durante 1 min aspirar el exceso PBS DEPC. Tenga cuidado de no romper las células. Repita este paso para un total de 3 lavados.
  9. Cuidadosamente añada 1 mL de permeabilizing solución (50% acetona, 50% metanol) para cada cubreobjetos. Permitir a las células para permeabilizar por 15 min.
    Nota: En este punto, el cubreobjetos pueden almacenarse en un congelador de-20 ° C durante no más de una semana. Evitar congelar o reducir al mínimo el tiempo empleado en el congelador como la calidad de imagen puede degradar rápidamente. Asegúrese de que cuando en el congelador que las células permanecen húmedos y cubiertos en metanol/acetona y para asegurar que ellos rehidratar correctamente con DEPC PBS después del retiro del congelador.
  10. Añadir 1,5 mL de PBS con DEPC y cualquier lugar en un agitador durante 5 minutos o agitar firmemente pero suavemente en la mano durante 1 minuto aspirar el exceso PBS con DEPC, tenga cuidado de no romper las células. Repita este paso para un total de 3 lavados.

4. IFA y RNA-pescado

Nota: Con respecto a la sonda de RNA pescado etiquetado y preparación: para K-Rta el intrón 959 pares de bases, 31 diversas puntas de prueba fueron generados que fueron 20 pares de bases cada uno, conteniendo un GC contenidos de 50%. Soluciones de trabajo y stock de las sondas fueron alícuotas en 100 μm y concentraciones de 2,5 μm, respectivamente.

  1. Portaobjetos de microscopio de etiqueta con información experimental necesaria o algún tipo de sello distinguible.
  2. Forre el fondo de un recipiente de plástico hermético con una toalla de papel húmeda.
  3. Preparar la solución de anticuerpo primario (1,5 μl de anticuerpo de LANA, 0,75 μl del anticuerpo de la ARN Pol II, 3 μl de panadería levadura tRNA, PBS DEPC hasta 30 μL) y multiplicar la receta por cada cubreobjetos presente. Lugar 30 μl de solución de anticuerpo primario en cada portaobjetos rotulado.
    1. Valorar primero el anticuerpo primario de interés y la cantidad óptima. Asegúrese de usar IgG purificada, suero (líquido ascítico) contienen gran cantidad de Rnasa.
  4. Coloque el cubreobjetos (células hacia la solución) sobre el portaobjetos rotulado y mover las diapositivas en el contenedor con la toalla de papel húmeda. Tenga cuidado de no introducir burbujas. Cubre el exterior del envase con envoltura de plástico. Mover el contenedor en una incubadora a 37 ° C durante 1 h.
  5. Preparar un pescado el tampón de lavado (buffer de citrato salino de sodio x 2 (SSC) (final), 10% formamida, 90% DEPC dH2O).
  6. Preparar 2 x tampón de hibridación (4 x SSC, sulfato de dextrán 20%).
  7. Preparar el anticuerpo secundario y pescado del intrón sonda tampón (20 μl de 2 x de tampón de hibridación (a final 1 x Hyb Buffer), 4 μL de levadura tRNA (final 10%), 4 μL de formamida (final 10%), sonda de intrón K-Rta (final 125 nM), 0.8 μg de anticuerpo secundario, con DEPC dH2 O hasta 40 μL). Multiplique la receta para cada diapositiva que sea necesitada.
  8. Después de la incubación, lavar las células 3 veces con PBS con DEPC en una placa bien 6 para 5 minutos cada uno.
  9. Lavar con tampón de lavado de pescado 3 veces por 5 minutos cada uno. Mantenga el cubreobjetos en tampón de lavado de pescado hasta el final de preparación de mezcla de segundo intrón y el anticuerpo sonda (paso 4.7).
  10. Portaobjetos limpio de vidrio utilizados para la incubación del anticuerpo primario para hibridación.
  11. Lugar 40 μl del anticuerpo secundario y pescado del intrón sonda que contiene solución cada portaobjetos de vidrio.
  12. Colocar el cubreobjetos con las células sobre el portaobjetos con el lado de la celda hacia abajo en la parte superior del búfer, tenga cuidado de no introducir burbujas.
  13. Coloque los portaobjetos en un recipiente de plástico con una toalla de papel húmeda en la parte inferior. Envuelva el envase de plástico en la primera envoltura de plástico y luego papel aluminio.
  14. Incubar el contenedor con los portaobjetos a 37 ° C durante 16-24 h.
  15. Después de la incubación, Deslice cuidadosamente el cubreobjetos del borde de la diapositiva de cristal y poner en placas de pozos 6 hacia arriba y lavar las células con buffer de lavado de pescado 3 veces en una placa bien 6 por 5 min.
  16. Lavar las células 2 veces con 2 x SSC.
  17. Añadir DAPI (1:1, 000) en los 2 x SSC y dejar para reposar 5 min a temperatura ambiente.
  18. Lavar las células 2 veces con 2 x SSC.
  19. Limpiar el portaobjetos de vidrio usados para la hibridación y añadir 10 μl de solución sobre las diapositivas de cristal de montaje.
  20. Coloque el cubreobjetos hacia abajo en la solución de montaje. Tenga cuidado de no introducir burbujas.
  21. Con un pañuelo de laboratorio, retire con cuidado la solución de montaje exceso, teniendo cuidado de no aplastar las células.
  22. Usar esmalte de uñas, aplique una capa amplia alrededor del borde del cubreobjetos y dejar para secar.
  23. Proceder a realizar microscopía de fluorescencia.

5. microscopía de fluorescencia 3D

Nota: Mientras que los protocolos variarán con el tipo de sistema de microscopio de la fluorescencia, los pasos siguientes ayudarán a garantizar la adquisición de datos de imagen óptima para el análisis cuantitativo.

  1. Prepare las muestras fijadas y montar en los medios de comunicación anti-fade para retrasar el fotoblanqueo de fluorescencia durante proyección de imagen.
  2. Utilice un objetivo de alta calidad (tales como un 60 X 1.42 N.A aceite inmersión lente), que puede capturar una célula entera (o núcleo) en el campo de visión.
  3. Definir los parámetros de exposición (por ejemplo, energía de excitación, tiempo de exposición) para cada canal de color de fluorescencia, utilizando muestras de control positivo y negativo. Adquisición de imágenes de fluorescencia.
    Nota: Las muestras de control positivo que contienen solamente una etiqueta fluorescente puede usarse también para determinar el nivel de "interferencia" entre los canales de color. Para imágenes muestras fijo celular, energía de excitación de fluorescencia puede ser reducido (con tiempos de exposición un poco más largos) para minimizar el fotoblanqueo.
  4. Una vez que se ha establecido el protocolo de imagen, mantener los mismos parámetros de exposición coherente para todas las muestras en un estudio, para que los datos de imagen pueden analizar con precisión y en comparación.
  5. Realizar procesamiento después de la adquisición de imágenes y reconstrucción 3D. Identificar las transcripciones K Rta por señal de RNA-peces (rojo), las moléculas de LANA por inmunofluorescencia (verde) y la cromatina nuclear (cuando corresponda) teñidos con DAPI (azul).
    Nota: Regiones del núcleo celular, en el que K-Rta y LANA son co agrupado, así se creen que se asocia con fábricas de transcripción viral y replicación compleja.

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Resultados

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Se realizó un protocolo ligeramente abreviado donde se utilizaron células BCBL-1 y sólo LANA y K Rta ARN fueron manchados (figura 1). Este experimento nos permite examinar dónde están activamente transcribir episomas virales y la heterogeneidad de la respuesta a los estímulos de la reactivación de KSHV en una población de células. En la celda indicada por la flecha en la figura 1, la distinta fluorescencia K Rta en regiones que c...

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Discusión

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Hay algunos aspectos del protocolo que pueden modificarse para adaptarse a circunstancias inusuales. También se puede alterar la elección de los búferes de fijación y permeabilización. Para los búferes de fijación, paraformaldehido es también eficaz y etanol puede ser utilizado para permeabilización.

Amortiguamiento el formaldehído con glicina que PBS se recomienda ya que previene formaldehído de desactivar los anticuerpos en ausencia de albúmina de suero bovino (BSA), pero si el cubreobjetos ...

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Divulgaciones

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Los autores de este documento no tienen vínculos financieros ni competencia conflictos de intereses.

Agradecimientos

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Esta investigación fue apoyada por donaciones de institutos nacionales de salud (R01-DE025985) y por un cáncer americano sociedad Research Scholar Award (RSG-13-383-MPC). Este trabajo fue apoyado por becas del Departamento de agricultura de Estados Unidos (2015-67015-23268 y 2014-67015-21787) y nueva subvención de iniciativa de investigación de la Universidad de California, Davis.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
RPMI medium 1650 GlutaMAXGibco de Life Technologies61870-036Necesita ser calentado a 37 ° C
Suero Fetal BovinoOmega Scientific Inc.FB-11
Pluma Estreptococo Glutamina (100x)Gibco de Life Technologies10378-016
Timidina Sigma AldrichT9250
Dulbecco' s Solución tamponada de fosfatoGibco de Life Technologies14190-144
TPASigma AldrichP1585
Butirato de sodio Sigma AldrichB5887
Solución de formaldehído  Sigma Aldrich252549Corrosivo, tóxico, peligroso para la salud
Pirocarbonato de dietiloSigma AldrichD-5758Toxicidad aguda 
GlicinaSigma Aldrich410225
AcetonaSigma Aldrich179124inflamable y tóxico
Fisher Chemical 67-56-1inflamable, tóxico y peligroso para la salud
contra KSHV/HHV-8 ORF73Advanced Biotechnologies13-210-100
clon de anticuerpo anti-ARN polimerasa II CTD4H8EMD Milipore05-623
Ácido ribonucleico, transferencia de panadero levadura s (S. cerevisiae) Sigma Aldrich9014-25-9
Tampón de citrato de sodio salino 20x (SSC)Thermo Fisher Scientific 
Formamida Sigma Aldrich295876
Omnipur Sulfato de Dextrano, solución al 50%EMD Milipore1916C093
DAPI (4',6-diamindino-2-fenilindol, diclorhidrato)Thermo Fisher Scientific D1306
slowFade Gold reactivo antidecoloraciónLife TechnologiesS36936
Micro cubreobjetos 22x22MatsunamiC022221
VoloCITYde imagen 3D
portaobjetos de microscopio Superfrost/PlusFisher Scientific12-550-15
Metanol Anticuerpo monoclonal de rata 15557044 software Microscopio DeltaVision

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Etiquetas

Microscop a de fluorescencia 3Dsondas de RNA FISHtinci n por inmunofluorescenciaherpesvirus del sarcoma de Kaposiant geno nuclear asociado a la latenciaRNA polimerasa IIdetecci n de RNA nacientelocalizaci n del episoma viral

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