Fábricas transcripcionales virales son estructuras discretas que se enriquecen con celular polimerasa de ARN II para aumentar la transcripción de genes virales durante la reactivación. Aquí, se describe un método para localizar sitios de transcripción activamente de cromatina viral en el espacio 3D nuclear por una combinación de la hibridación de RNA en situ y tinción de inmunofluorescencia.
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Artículo de método
Proyección de imagen funcional de fábricas de transcripción Viral mediante microscopia de fluorescencia 3D
En este artículo
Resumen
Resumen
Es bien sabido que la regulación espacial y temporal de los genes es una parte integral de expresión génica adecuada de gobernar. En consecuencia, es valioso comprender dónde y cuándo transcripción tiene lugar en el espacio nuclear y visualizar la relación entre episomas infectados dentro de núcleo de la célula misma. Aquí, han sido la inmunofluorescencia (IFA) y RNA-peces combinedto identificar activamente transcribir episomas herpesvirus asociado a sarcoma de Kaposi (KSHV). Manchando de antígeno nuclear asociado a latencia KSHV (LANA), es posible localizar donde existen episomas virales dentro del núcleo. Además, mediante el diseño de sondas de RNA-pescado a la región del intrón de un gen viral, que se expresa sólo durante la infección productiva, transcritos de RNA nacientes pueden ser situados. Utilizando esta combinación de sondas moleculares, es posible visualizar el montaje de fábricas de transcripción viral grande y analizar la regulación espacial de expresión génica viral durante la reactivación de KSHV. Incluyendo tinción de anticuerpo anti-ARN polimerasa II, uno puede también visualizar la asociación entre la agregación de la ARN polimerasa II (RNAPII) y transcripción de KSHV en la reactivación.
Introducción
Se ha vuelto cada vez más claro que la organización espaciotemporal del núcleo desempeña un papel importante en la modulación de la expresión génica finamente sintonizada en eucariotas. Más genes específicos de tejido son distribuidos en muchos cromosomas y necesitan ser regulado sincrónicamente con el fin de responder a estímulos específicos en una forma coordinada1. Las células construyen núcleos de cromatina activa (ACH) como una forma de reunir a los genes y sus componentes cis-reguladoras a un específico espacio nuclear1.
También se ha demostrado por diversos estudios que aunque el núcleo....
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Protocolo
PRECAUCIÓN: Las líneas celulares utilizadas en este procedimiento contengan virus infecciosos, tenga cuidado y proceden sólo en instalaciones BSL de nivel 2 o superior.
1. preparación y mantenimiento de la célula
- TREx-K-RTA BCBL-1 células de la cultura (o KSHV otro infectado líneas de células PEL) en medio RPMI1640 suplementado con 15% de suero bovino fetal (FBS) y solución de glutamina 1% penicilina estreptomicina.
- Crecen las células a 37 ° C con 5% dióxido de carbono (CO2), asegurándose de que crecer continuamente y dividir celdas en una proporción de 1:4 cada 2-4 días.
- Seguimiento de cultivos celu....
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Resultados
Se realizó un protocolo ligeramente abreviado donde se utilizaron células BCBL-1 y sólo LANA y K Rta ARN fueron manchados (figura 1). Este experimento nos permite examinar dónde están activamente transcribir episomas virales y la heterogeneidad de la respuesta a los estímulos de la reactivación de KSHV en una población de células. En la celda indicada por la flecha en la figura 1, la distinta fluorescencia K Rta en regiones que c.......
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Discusión
Hay algunos aspectos del protocolo que pueden modificarse para adaptarse a circunstancias inusuales. También se puede alterar la elección de los búferes de fijación y permeabilización. Para los búferes de fijación, paraformaldehido es también eficaz y etanol puede ser utilizado para permeabilización.
Amortiguamiento el formaldehído con glicina que PBS se recomienda ya que previene formaldehído de desactivar los anticuerpos en ausencia de albúmina de suero bovino (BSA), pero si el cubreobjetos .......
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Divulgaciones
Los autores de este documento no tienen vínculos financieros ni competencia conflictos de intereses.
Agradecimientos
Esta investigación fue apoyada por donaciones de institutos nacionales de salud (R01-DE025985) y por un cáncer americano sociedad Research Scholar Award (RSG-13-383-MPC). Este trabajo fue apoyado por becas del Departamento de agricultura de Estados Unidos (2015-67015-23268 y 2014-67015-21787) y nueva subvención de iniciativa de investigación de la Universidad de California, Davis.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| RPMI medium 1650 GlutaMAX | Gibco de Life Technologies | 61870-036 | Necesita ser calentado a 37 ° C |
| Suero Fetal Bovino | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Pluma Estreptococo Glutamina (100x) | Gibco de Life Technologies | 10378-016 | |
| Timidina | Sigma Aldrich | T9250 | |
| Dulbecco' s Solución tamponada de fosfato | Gibco de Life Technologies | 14190-144 | |
| TPA | Sigma Aldrich | P1585 | |
| Butirato de sodio | Sigma Aldrich | B5887 | |
| Solución de formaldehído | Sigma Aldrich | 252549 | Corrosivo, tóxico, peligroso para la salud |
| Pirocarbonato de dietilo | Sigma Aldrich | D-5758 | Toxicidad aguda |
| Glicina | Sigma Aldrich | 410225 | |
| Acetona | Sigma Aldrich | 179124 | inflamable y tóxico |
| Fisher Chemical | 67-56-1 | inflamable, tóxico y peligroso para la salud | |
| contra KSHV/HHV-8 ORF73 | Advanced Biotechnologies | 13-210-100 | |
| clon de anticuerpo anti-ARN polimerasa II CTD4H8 | EMD Milipore | 05-623 | |
| Ácido ribonucleico, transferencia de panadero levadura s (S. cerevisiae) | Sigma Aldrich | 9014-25-9 | |
| Tampón de citrato de sodio salino 20x (SSC) | Thermo Fisher Scientific | ||
| Formamida | Sigma Aldrich | 295876 | |
| Omnipur Sulfato de Dextrano, solución al 50% | EMD Milipore | 1916C093 | |
| DAPI (4',6-diamindino-2-fenilindol, diclorhidrato) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| slowFade Gold reactivo antidecoloración | Life Technologies | S36936 | |
| Micro cubreobjetos 22x22 | Matsunami | C022221 | |
| VoloCITY | de imagen 3D | ||
| portaobjetos de microscopio Superfrost/Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Referencias
- de Laat, W., Grosveld, F. Grosveld Spatial organization of gene expression: the active chromatin hub. Chromosome Res. 11 (5), 447-459 (2003).
- Misteli, T. Protein dynamics: implications for nuclear architecture and gene expression. Science. 291
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Reimpresiones y permisos
