Artículo de método

Desarrollo de un ensayo In Vitro para cuantificar Progenitor y vástago hematopoyética células (HSPCs) en el desarrollo de embriones de pez cebra

DOI:

10.3791/56836

⸱

30 de noviembre de 2017

 , 
1Department of Biological Sciences, California State University, Chico

En este artículo

Resumen

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Aquí, presentamos un método simple para cuantificar madre y progenitoras células hematopoyéticas (HSPCs) en el pez cebra embrionario. HSPCs de pez cebra disociado se platean en metilcelulosa con factores de apoyo, diferenciando en sangre madura. Esto permite la detección de sangre defectos y permite para realizarse fácilmente de detección de drogas.

Resumen

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La hematopoyesis es un proceso celular esencial en el que las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPCs) se diferencian en la multitud de linajes celulares diferentes que conforman la sangre madura. Aislamiento e identificación de estos HSPCs es difícil porque son definidos ex post facto; puede ser definidos sólo después de su diferenciación en linajes de células específicas. En las últimas décadas, el pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un organismo modelo para el estudio de la hematopoyesis. Embriones de pez cebra desarrollan ex úteroy por la fertilización después de 48 h (hpf) han generado definitivo HSPCs. ensayos para evaluar la diferenciación HSPC y han desarrollado capacidades de proliferación, utilizando el trasplante y posterior reconstitución del sistema hematopoyético además visualizar líneas transgénicas especializadas con microscopía confocal. Sin embargo, estos ensayos son de costo prohibitivo, técnicamente difícil y desperdiciador de tiempo para muchos laboratorios. Desarrollo de un modelo en vitro para evaluar HSPCs sería rentable, más rápido y presentan menos dificultades comparadas anteriormente describen métodos, permitiendo a los laboratorios evaluar rápidamente pantallas de mutagénesis y drogas que afectan la biología de la HSPC. Este ensayo novela en vitro para evaluar la HSPCs se realiza en embriones de pez cebra todo chapado disociado y agregando factores exógenos que promueven la proliferación y diferenciación de la HSPC. Embriones son disociados en las células y plateados con apoyo HSPC factores estimulantes de Colonia que hacer generar unidades formadoras de colonias (UFC) que surgen de una célula del progenitor único. Estos ensayos permitirán examinación más cuidadosa de las vías moleculares responsables de la proliferación, diferenciación y regulación, que permitirá a los investigadores a entender los fundamentos de la hematopoyesis vertebrado y su dysregulation HSPC durante la enfermedad.

Introducción

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La hematopoyesis es el proceso de hacer que la multitud de células maduras de la sangre necesaria para la supervivencia de un organismo. Es un proceso clave de desarrollo que consiste en la diferenciación de las células madre hematopoyéticas (HSCs) en una variedad de tipos celulares desarrollo restringido que comprenden sangre madura. Las HSCs uno deben renovar para que el sistema nunca se agota y deben persistir de desarrollo embrionario hasta la muerte. En los vertebrados, la constante diferenciación y proliferación de las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPCs) se necesitan para reponer adecuadamente la mayoría de las células sanguíneas que son poste-mitotic y se reciclan todos los días. HSCs generan células sanguíneas maduras distinguiendo primero en subconjuntos de células progenitoras restringido; común progenitores linfoides (CLPs)1, que finalmente producen las células T, B y NK y de progenitores mieloides (CMP) común2 que generan los granulocitos, eritrocitos, macrófagos y megacariocitos. Estos progenitores comprometidos a generar linajes celulares específicos y además se diferencian en más células progenitoras desarrollo restringido como progenitores mieloide eritroide (MEPs) que generan los eritrocitos y las plaquetas o granulocitos progenitores del macrófago (GMPs) que generan los basófilos, eosinófilos, neutrófilos y los macrófagos2. Identificar y aislar a estos progenitores permiten la identificación de importantes vías moleculares implicadas en la diferenciación Hematopoyética y muchas enfermedades hematopoyéticas, como la leucemia se presentan cuando estas células progenitoras no correctamente distinguir.

En las últimas décadas, el sistema de modelo de pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en una herramienta clave de investigación para estudios hematopoyéticos embrionarios y adultos. Pez cebra son susceptible de análisis genético y las especies modelo vertebrados filogenéticamente más bajas que tienen un similar vasculatura y sistema hematopoyético a los seres humanos. Desarrollan de embriones de pez cebra ex útero, y dentro de 48 horas post fecundación (hpf) generan HSPCs3,4,5,6,7,8. Pez cebra son también altamente fecundo, con hembras sobre 100 huevos en un solo embrague, lo que permite tamaños de muestra grandes y replicación experimental. Los embriones de pez cebra son ópticamente transparentes, que permite la visualización microscópica del sistema hematopoyético. Varias líneas transgénicas fluorescentes del pez cebra marca HSCs como runx1: EGFP pescado9, cd41: EGFP peces10, y kdrl:mCherry; CMYB: animales de doble positivo de3 de GFP, permitir la visualización en tiempo real, vivo de HSC aparición y expansión en vivo3,4,7,8, 9. Generación rápida tiempo y desarrollo ex útero del pez cebra ha conducido a su uso en mutagénesis estudios11,12,13,14,15 y proyección16,17,18,19,20 compuestos que promesa terapéutica para trastornos de la sangre humana. En general, conservación del sistema hematopoyético, la presencia y desarrollo de líneas transgénicas y tiempo de regeneración rápida ha hecho el pez cebra un modelo barato, rápido, flexible e ideal para estudios hematopoyéticos.

Se han desarrollado numerosos métodos de aislamiento y pruebas de HSCs en mamíferos sistemas hematopoyéticos. Los investigadores pueden utilizar una combinación de receptores de superficie celular para marcar HSCs21,22,23,24, así como aprovechar la capacidad de HSCs de emanación tinte25,26. Después están rotuladas, celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación permite su separación física. Demostrando que una célula es una HSC requiere irradiar un animal del anfitrión para destruir HSPCs endógenas, transplante de HSCs putativas y observando que a largo plazo, multilineal reconstitución de todo maduras tipos de células sanguíneas. Estas pruebas funcionan bien en ratones, ya que hay numerosos anticuerpos de superficie celular contra las células hematopoyéticas y cepas consanguíneas de ratón que facilitan el inmunes que empareja para el trasplante. Sin embargo, pocos anticuerpos de superficie de la célula hematopoyética de pez cebra han sido generado27, lo que dificulta la identificación y aislamiento de HSCs. La forma más común de marcar y aislar HSCs de pez cebra es con animales transgénicos, por el que una secuencia de promotor de la célula-específica está impulsando la expresión de una proteína fluorescente. Estudios han visualizado y enumerar las HSCs en la pared ventral de la aorta dorsal con microscopía utilizando esta técnica3,4,8,9. Otros laboratorios han generado variedades clonales de pez cebra28,29 y han realizado trasplantes exitosos en animales emparejados MHC30. Sin embargo, estas técnicas son costo prohibitivo para muchos laboratorios, son técnicamente difíciles y son lentos. Para abordar estas cuestiones, los laboratorios han generado diversos estudios en vitro para probar para la presencia, las tasas de proliferación y la capacidad de diferenciación de HSPCs31,32,33, 34,35,36. Estos ensayos muestran proliferación y diferenciación de HSPCs en vitro31,32,33,34,35,36, el rescate de defectos hematopoyéticas36y un método eficaz para descubrir y probar citoquinas33,34,35. También se han utilizado para identificar los genes responsables de la HSPC biología31,32. En este estudio, tomamos estos análisis un paso más, permitiendo la cuantificación de HSPCs en un embrión de pez cebra en desarrollo. Estos ensayos también pueden ser utilizados para cuantificar el número de HSPCs en animales mutantes y animales trataron con fármacos hematopoyéticos no disruptivo. En esencia, estos ensayos son rápidos, presentes pocas dificultades técnicas y baratas formas de cuantificar números HSPC, examinar su proliferación e investigar bloques en diferenciación.

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Protocolo

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El Consejo Consultivo institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de California State University, Chico, aprobó todos los métodos descritos a continuación.

1. bleach 48 hpf embriones de pez cebra

  1. Con 15 cm (w) x 15 cm (l) x envases de plástico de 7 cm (h) crear estaciones de lavado de 3: 1) con 1 mL de cloro 5% en medio del embrión de 1000 mL (E3; ver tabla 1), 2) con la E3 estéril y 3) con la E3 estéril. Asegúrese de que cada envase de 500 mL de solución para sumergir los embriones en.
    Nota: Para cada condición de prueba, se necesitarán por lo menos 10 embriones. Este procedimiento de lavado puede acomodar hasta 200 embriones.
  2. Con una pipeta, coloque los embriones en un colador de té y sumergir los huevos en la estación de lavado #1 para 5 minutos Retire el colador de té (con embriones dentro) y coloque en la estación de lavado #2 por 5 min; Repita para estación de lavado #3 para una final 5 minutos.
  3. Después del último lavado, enjuague los embriones de colador de té girándolo boca abajo sobre una limpia plato de Petri de 10 cm y suavemente enjuague los embriones fuera el colador de té con E3 estéril y una pipeta de transferencia.

2. Dechorionate de embriones

  1. Con una pipeta de transferencia, retire y deseche tanto E3 posible de la caja Petri y añadir 500 μL de dechorionation proteasa (10 mg/mL) a los embriones. Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos golpee suavemente el lado de la caja Petri para eliminar chorions.
  2. Con una pipeta serológica, añadir 20 mL de E3 estéril para diluir la proteasa. Permiten embriones colocar y quitar el E3 con una pipeta de transferencia. Repita este paso de lavado 3 veces para quitar todos los rastros de la proteasa dechorionation.

3. preparación de muestras de embriones

  1. Usando una pipeta P1000, coloque 10 embriones en un tubo de microcentrífuga estéril solo 1,5 mL.
  2. Retire el E3 con una pipeta y deseche.
    PRECAUCIÓN: Pipetear con cuidado, como embriones pueden ser fácilmente desplazados y desechados durante los pasos de lavado.

4. preparación de embriones para disociación

  1. Transferir las muestras en campana de flujo laminar y embriones mediante la adición de 1 mL estériles E3. Permite embriones al fondo del tubo y retirar el sobrenadante con una pipeta P1000. Repita para un total de 3 lavados.
  2. Después del último lavado, eliminar E3 y deseche. Añadir 1 mL de 10 mM Ditiotreitol (DTT) en E3 para quitar la capa de moco (y cualquier esporas, levaduras o bacterias que pueden quedar atrapadas en él) que rodea el embrión pez cebra. Coloque el tubo de microcentrífuga horizontalmente e incubar a temperatura ambiente en campana de flujo laminar durante 25 minutos.

5. embrión disociación

  1. Lavar la muestra 3 veces con 1 mL de DPBS estéril (con Ca2 + y Mg2 +). Después del último lavado 500 μL de DPBS (con Ca2 + y Mg2 +) y añadir 5 μL de proteasa de disociación 5 mg/mL (26 U/mL).
    PRECAUCIÓN: Esta enzima necesita Ca2 + y Mg2 +, así que asegúrese de que la DPBS contiene estos iones.
  2. Incubar las muestras a 37 ° C en un agitador orbital horizontal a 180 rpm para las muestras de lugar de 60 min en la campana de flujo laminar y triturate embriones con una P1000 hasta que las muestras son totalmente disociadas.
    PRECAUCIÓN: Compruebe periódicamente para determinar cuándo se disocian los embriones. La solución del embrión debe tener cierta cantidad de tejido presente; no debe ser completamente homogéneo. Es posible digerir excesiva, que destruirá las HSPCs (ver figura 1 complementaria).

6. preparación de embriones disociados

  1. Los embriones en el depósito superior de un poliestireno de 5 mL pipeta 10 disociado redondo tubo inferior con una tapa de tamiz de 35 μm celular.
  2. Con una pipeta, enjuague el tubo de Petri con PBS estéril (con sin Ca2 + o Mg2 +) y solución de transferencia a 5 mL que contienen tubo poliestireno filtra las células en el paso 6.1. Repita hasta 4 mL de líquido está presente en el tubo de poliestireno de 5 mL.
    Nota: PBS, DPBS u otras soluciones tampón isotónicas pueden utilizarse en esta etapa, siempre y cuando no contengan Ca2 + o Mg2 +
  3. Centrifugar los tubos a 4 º C y 300 x g durante 5 minutos para que sedimenten la muestra homogeneizada de la célula. Con una pipeta, retire y deseche el sobrenadante del tubo de fondo redondo. Tenga cuidado de no romper las células peleteadas en la parte inferior del tubo. Resuspender las células en 100 μL de PBS.

7. preparación de metilcelulosa

  1. Generar 1 x solución metilcelulosa completa (tabla 1) y añadir 2,5 mL a tubos estériles 14 mL de fondo redondo con agujas 16 G y jeringas de 3 mL. Un tubo para cada condición de uso probado.
  2. Añadir citocinas, moléculas pequeñas u otros agentes para investigar a cada muestra.
    1. Para la diferenciación mieloide, añadir 1% carpa suero y 0,3 mg/mL pez cebra recombinante granulocitos estimulantes de colonias factor (Gcsf)34 a medio de metilcelulosa. Ver Svoboda et al. 37 para una descripción completa sobre cómo generar citoquinas suero y recombinante de la carpa.
    2. Para la diferenciación eritroide, añadir 1% carpa suero y 0.1 mg/mL pez cebra recombinante eritropoyetina (Epo)38 a medio de metilcelulosa.
    3. Para examinar del multilineage progenitores, agrega Epo y Gcsf.
      PRECAUCIÓN: Citoquinas y aditivos deben no total más del 10% del volumen total, como el medio no será lo suficientemente viscoso para distinguir colonias individuales.

8. adición de embriones disociados hasta la pastilla

  1. Usando una pipeta, añada 100 μL de los 10 embriones disociados a la superficie de la metilcelulosa preparado con suero carpa y citocinas recombinante. Tapón tapa y agitar suavemente para homogeneizar completamente la muestra. Cada tubo debe contener ahora el tejido disociado de 10 embriones.
  2. Utilizando jeringas de 3 mL y agujas de 16 G, alícuota 1 mL de la muestra en placas de Petri separadas 35 mm 2. Asegúrese de que la muestra está completamente dispersa a lo largo de la caja Petri. Repetir para cada muestra.
  3. Colocar platos de Petri de 35 mm con células en metilcelulosa en una placa de Petri de 15 cm. Añadir a cada plato de 15 cm, una placa de Petri de 35 mm con 5 mL de agua estéril para humedecer las muestras. Incubar a 32 ° C y 5% CO2 para 7-10 días.

9. visualización de la HSPC derivados colonias formando unidades (UFC)

  1. Después de 7 días de incubación, coloque las muestras en un microscopio invertido en 40-100 X para la visualización y enumeración. En este punto, colonias individuales pueden aisladas con una pipeta y sometidas a análisis de la coloración o gene.

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Resultados

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Para evaluar los números de la HSPC en pez cebra embrionario, 48 embriones hpf fueron digeridos plateados en metilcelulosa con factores exógenos de crecimiento hematopoyético apoyo y se incuba durante 7 días (figura 1A). Después de 7 días, unidades formadoras de colonias (UFC) fueron enumerados (figura 1B) y reflejada (figura 1C). Mediante el control...

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Discusión

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El sistema de modelo de pez cebra se ha convertido en un modelo eficiente, eficaz y barato para el estudio de la hematopoyesis vertebrada primitiva y definitiva. Generación de análisis rápido, barato y presentar algunas dificultades técnicas que puede utilizarse para pruebas de moléculas pequeñas, analizar embriones mutantes y dilucidar las vías moleculares importantes para la biología de la HSPC. In vitro la galjanoplastia de HSPCs de pez cebra adulto es un método eficaz para el estudio de mutagénesis, citoquin...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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La financiación fue proporcionada por los institutos nacionales de salud (NIH: DK087814-K01-01A1 a D.L.S.), el programa de Universidad del estado de California para la educación y la investigación en biotecnología (CSUPERB: Control Molecular del nicho hematopoyético vertebrados a D.L.S.) y de la oficina de estudios de posgrado en el Chico de la Universidad Estatal de California (a A.C.B.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10% de albúmina sérica bovina en MDMStemCell Technologies de Iscove 9300
DPBS (10x) con Calcio2+ y Magnesio2+Life Technologies14080-055
HyClone PBS (1x)GE Healthcare Life Sciencessh30256.01
  DMEM 500 mLCorning CellGrow10-017-CV
  Ham's F12 500 mLCorning CellGrow10-080-CV
FBS 500 mLGemini Bio-Products100-108
HEPES 100 mL (1 M)Gibco life technologies15-630-080
Penicilina/estreptomicina (5000 U/mL
y 5000 mg/mL) con L-Glutamina (200 mM)		Corning Mediatech30-009-CI
Sulfato de Gentamicina 10 mL (50 mg/mL)Corning Mediatech30-005-CR
Tubo MCF de 1,5 mLFisherBrand05-408-129
Aguja de inyección de 3 mL 23gx1 con bloqueo LuerBD Safety Glide305905
5 mL Tubo de fondo redondo de poliestireno con tapa de filtro de celdasCorning Falcon352235
Methocel MCSigma-Aldrich64630
14 mL Tubo de fondo redondo de poliestirenoCorning Falcon352057
10 mm poliestireno easygrip Placa de PetriCorning Falcon351008
Librease TMRoche Sigma-Aldrich5401119001disociación proteasa
PronaseRoche Sigma-Aldrich11459643001proteasa de decorionación
15 cm Placa de PetriCorning Falcon351058
ABCentro Internacional de Recursos de Pez Cebra (ZIRC)Cepa depez cebra ZL1 utilizada
Dithiolthreitol (DTT)Sigma-Aldrich646563

Referencias

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