Aquí, presentamos un método simple para cuantificar madre y progenitoras células hematopoyéticas (HSPCs) en el pez cebra embrionario. HSPCs de pez cebra disociado se platean en metilcelulosa con factores de apoyo, diferenciando en sangre madura. Esto permite la detección de sangre defectos y permite para realizarse fácilmente de detección de drogas.
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Artículo de método
Desarrollo de un ensayo In Vitro para cuantificar Progenitor y vástago hematopoyética células (HSPCs) en el desarrollo de embriones de pez cebra
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Resumen
Resumen
La hematopoyesis es un proceso celular esencial en el que las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPCs) se diferencian en la multitud de linajes celulares diferentes que conforman la sangre madura. Aislamiento e identificación de estos HSPCs es difícil porque son definidos ex post facto; puede ser definidos sólo después de su diferenciación en linajes de células específicas. En las últimas décadas, el pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un organismo modelo para el estudio de la hematopoyesis. Embriones de pez cebra desarrollan ex úteroy por la fertilización después de 48 h (hpf) han generado definitivo HSPCs. ensayos para evaluar la diferenciación HSPC y han desarrollado capacidades de proliferación, utilizando el trasplante y posterior reconstitución del sistema hematopoyético además visualizar líneas transgénicas especializadas con microscopía confocal. Sin embargo, estos ensayos son de costo prohibitivo, técnicamente difícil y desperdiciador de tiempo para muchos laboratorios. Desarrollo de un modelo en vitro para evaluar HSPCs sería rentable, más rápido y presentan menos dificultades comparadas anteriormente describen métodos, permitiendo a los laboratorios evaluar rápidamente pantallas de mutagénesis y drogas que afectan la biología de la HSPC. Este ensayo novela en vitro para evaluar la HSPCs se realiza en embriones de pez cebra todo chapado disociado y agregando factores exógenos que promueven la proliferación y diferenciación de la HSPC. Embriones son disociados en las células y plateados con apoyo HSPC factores estimulantes de Colonia que hacer generar unidades formadoras de colonias (UFC) que surgen de una célula del progenitor único. Estos ensayos permitirán examinación más cuidadosa de las vías moleculares responsables de la proliferación, diferenciación y regulación, que permitirá a los investigadores a entender los fundamentos de la hematopoyesis vertebrado y su dysregulation HSPC durante la enfermedad.
Introducción
La hematopoyesis es el proceso de hacer que la multitud de células maduras de la sangre necesaria para la supervivencia de un organismo. Es un proceso clave de desarrollo que consiste en la diferenciación de las células madre hematopoyéticas (HSCs) en una variedad de tipos celulares desarrollo restringido que comprenden sangre madura. Las HSCs uno deben renovar para que el sistema nunca se agota y deben persistir de desarrollo embrionario hasta la muerte. En los vertebrados, la constante diferenciación y proliferación de las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPCs) se necesitan para reponer adecuadamente la mayoría de las células sanguíneas que son poste-m....
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Protocolo
El Consejo Consultivo institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de California State University, Chico, aprobó todos los métodos descritos a continuación.
1. bleach 48 hpf embriones de pez cebra
- Con 15 cm (w) x 15 cm (l) x envases de plástico de 7 cm (h) crear estaciones de lavado de 3: 1) con 1 mL de cloro 5% en medio del embrión de 1000 mL (E3; ver tabla 1), 2) con la E3 estéril y 3) con la E3 estéril. Asegúrese de que cada envase de 500 mL de solución para sumergir los embriones en.
Nota: Para cada condición de prueba, se necesitarán por lo menos 10 embriones. Este procedimiento de lavado puede aco....
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Resultados
Para evaluar los números de la HSPC en pez cebra embrionario, 48 embriones hpf fueron digeridos plateados en metilcelulosa con factores exógenos de crecimiento hematopoyético apoyo y se incuba durante 7 días (figura 1A). Después de 7 días, unidades formadoras de colonias (UFC) fueron enumerados (figura 1B) y reflejada (figura 1C). Mediante el control.......
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Discusión
El sistema de modelo de pez cebra se ha convertido en un modelo eficiente, eficaz y barato para el estudio de la hematopoyesis vertebrada primitiva y definitiva. Generación de análisis rápido, barato y presentar algunas dificultades técnicas que puede utilizarse para pruebas de moléculas pequeñas, analizar embriones mutantes y dilucidar las vías moleculares importantes para la biología de la HSPC. In vitro la galjanoplastia de HSPCs de pez cebra adulto es un método eficaz para el estudio de mutagénesis, citoquin.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
La financiación fue proporcionada por los institutos nacionales de salud (NIH: DK087814-K01-01A1 a D.L.S.), el programa de Universidad del estado de California para la educación y la investigación en biotecnología (CSUPERB: Control Molecular del nicho hematopoyético vertebrados a D.L.S.) y de la oficina de estudios de posgrado en el Chico de la Universidad Estatal de California (a A.C.B.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10% de albúmina sérica bovina en MDM | StemCell Technologies de Iscove | 9300 | |
| DPBS (10x) con Calcio2+ y Magnesio2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| DMEM 500 mL | Corning CellGrow | 10-017-CV | |
| Ham's F12 500 mL | Corning CellGrow | 10-080-CV | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HEPES 100 mL (1 M) | Gibco life technologies | 15-630-080 | |
| Penicilina/estreptomicina (5000 U/mL y 5000 mg/mL) con L-Glutamina (200 mM) | Corning Mediatech | 30-009-CI | |
| Sulfato de Gentamicina 10 mL (50 mg/mL) | Corning Mediatech | 30-005-CR | |
| Tubo MCF de 1,5 mL | FisherBrand | 05-408-129 | |
| Aguja de inyección de 3 mL 23gx1 con bloqueo Luer | BD Safety Glide | 305905 | |
| 5 mL Tubo de fondo redondo de poliestireno con tapa de filtro de celdas | Corning Falcon | 352235 | |
| Methocel MC | Sigma-Aldrich | 64630 | |
| 14 mL Tubo de fondo redondo de poliestireno | Corning Falcon | 352057 | |
| 10 mm poliestireno easygrip Placa de Petri | Corning Falcon | 351008 | |
| Librease TM | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | disociación proteasa |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | proteasa de decorionación |
| 15 cm Placa de Petri | Corning Falcon | 351058 | |
| AB | Centro Internacional de Recursos de Pez Cebra (ZIRC) | Cepa de | pez cebra ZL1 utilizada |
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 |
Referencias
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages....
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