Artículo de método

Protocolo guía para caracterización microbiana Fecal por secuencia de 16S rRNA-productos

DOI:

10.3791/56845

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19 de marzo de 2018

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1Sheba Medical Center, 2Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC, 3Ariel University, 4Cincinnati Children's Hospital Medical Center

En este artículo

Resumen

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Este manuscrito describe un detallado protocolo estandarizado de secuenciación de amplicones de rRNA 16S de alto rendimiento. El protocolo presenta un protocolo integrado, uniformado, factible y de bajo costo a partir de la recolección de muestras fecales a través de análisis de datos. Este protocolo permite el análisis de un gran número de muestras con estándares rigurosos y varios controles.

Resumen

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El microbioma intestinal humana juega un papel central en la protección de las células de la lesión, en el procesamiento de energía y nutrientes y en promover la inmunidad. Desviaciones de lo que se considera una composición de la microbiota saludable (disbiosis) pueden influenciar las funciones vitales que conduce a condiciones patológicas. Esfuerzos de investigación recientes y en curso se han dirigido hacia la caracterización de las asociaciones entre la composición microbiana y la salud humana y la enfermedad.

Los avances en tecnologías de secuenciación de alto rendimiento permiten la caracterización de la composición microbiana del intestino. Estos métodos incluyen amplicon de rRNA 16S que ordena y secuencia de la escopeta. Secuenciación de amplicones de rRNA 16S se utiliza para Perfil de composición taxonómica, mientras que la secuenciación shotgun proporciona información adicional acerca de las predicciones del gene y anotación funcional. Una ventaja en el uso de un método de secuenciación específica de la región variable del 16S rRNA gene es su costo sustancialmente inferior en comparación con la secuencia de la escopeta. Las diferencias de secuencia en el gene del rRNA 16S se utilizan como una huella microbiana para identificar y cuantificar diferentes taxones dentro de una muestra individual.

Grandes esfuerzos internacionales han alistado estándares para secuenciación de amplicones de rRNA 16S. Sin embargo, varios estudios reportan una fuente común de variación causada por el efecto de lote. Para minimizar este efecto, uniformados protocolos para toma de muestras, procesamiento y la secuencia deben implementarse. Este protocolo propone la integración de protocolos ampliamente usados a partir de muestras fecales para el análisis de datos. Este protocolo incluye un enfoque directo-PCR libre de columnas, que permite el manejo simultáneo y la extracción de ADN de un gran número de muestras fecales, junto con la amplificación por PCR de la región V4. Además, el protocolo describe la tubería análisis y proporciona un script usando la última versión de QIIME (QIIME 2 versión 2017.7.0 y DADA2). Este protocolo paso a paso está destinado a los interesados en iniciar el uso de productos de rRNA 16S que ordena de manera robusta, reproductiva, fácil de usar, detallada orientar a.

Introducción

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Concentración de esfuerzos se hicieron para entender mejor el microbioma diversidad y abundancia, como otro aspecto de la captura de diferencia y semejanzas entre los individuos en condiciones sanas y patológicas. Edad2,3, geografía4, estilo de vida5,6y5 de la enfermedad fueron demostrados para ser asociado con la composición del microbioma de la tripa, pero muchas condiciones y poblaciones aún no han sido completamente caracterizado. Recientemente se ha divulgado que el microbioma puede ser modificado para aplicaciones terapéuticas7,8,9. Por lo tanto, la penetración adicional en la relación entre diferentes condiciones fisiológicas y la composición microbiana es el primer paso hacia la optimización de posibles modificaciones futuras.

Los métodos tradicionales de cultivo microbiano están limitados por bajos rendimientos10,11y se conceptualizan como un estado binario donde es una bacteria presente en el intestino o no. Secuenciación de alto rendimiento basado en el ADN ha revolucionado la ecología microbiana, lo que permite la captura de todos los miembros de la comunidad microbiana. Sin embargo, la secuencia Lee longitud y calidad siguen siendo barreras significativas a la taxonomía exacta asignación12. Además, basado en experimentos de alto rendimiento pueden sufrir de efectos por lotes, donde las mediciones son afectadas por variables no biológicas o no científica13. En los últimos años, se han establecido varios programas para estudiar el microbioma humano, incluyendo el proyecto americano Gut, el proyecto microbioma humano de Estados Unidos (US) y el proyecto MetaHIT de Reino Unido (Reino Unido). Estas iniciativas han generado grandes cantidades de datos que no son fácilmente comparables debido a la falta de coherencia en sus planteamientos. Una variedad de proyectos internacionales tales como el consorcio internacional de microbioma humano, el proyecto del microbioma humano normas y el National Institute of Standards and Technology (NIST) intentó abordar algunos de estos temas14 y desarrolla estándares para la medición de microbioma que permita el logro de resultados reproductivos confiables. Se describe aquí es un protocolo integrado de15,varios métodos ampliamente utilizados de16 para 16S rRNA alto rendimiento secuencia (16S-seq) a partir de la recogida de muestras fecales a través del análisis de datos. El protocolo describe un enfoque PCR libre de columnas, diseñado originalmente para la extracción directa de la planta DNA16, para permitir el manejo simultáneo de grandes cantidades de heces las muestras en un tiempo relativamente corto con alta calidad amplificaron la DNA para la apuntada secuenciación de la región variable microbiana de V4 en una plataforma común de la secuencia. Este protocolo tiene como objetivo guiar a los científicos interesados en iniciar el uso de productos de rRNA 16S que ordena de manera robusta, reproductiva, fácil de usar, detallada, usando controles importantes. Tener un protocolo de visitas guiadas y detallada paso a paso puede minimizar el efecto de lote y así permitirá resultados de secuenciación más comparables entre laboratorios.

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Protocolo

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Aprobación ética para el estudio fue otorgada por el Comité de ética de investigación Local de Sheba y todos los métodos fueron realizados conforme a las normas y directrices pertinentes. El protocolo recibió una excepción del consentimiento del paciente de la Junta de revisión ética local, desde la materia fecal que se utilizaron fueron ya sometidos a la base de la microbiología como parte del workup clínico y sin paciente identificable que no sea de edad, Género y resultados microbianos. Escrito, el consentimiento informado fue obtenido de voluntarios sanos y la Junta de revisión institucional aprobó el estudio. Algunas de las muestras ya han sido incluidas en un análisis anterior1.

1. manejo de la muestra

  1. Recoger un frotis aproximadamente 5 de2 mm (aproximadamente del tamaño de un borrador de lápiz) de una muestra fecal fresca con un hisopo estéril en una prueba de tubo (véase Tabla de materiales). Guarde los hisopos que contiene muestras de heces a-80 ° C en 24 h. Los hisopos fecales pueden permanecer allí hasta que la transformación posterior.

2. extracción de ADN

  1. Descongelar las soluciones de extracción y dilución a temperatura ambiente (véase Tabla de materiales).
  2. Transferencia el hisopo fecal en una colección vacía 2 mL del tubo (véase Tabla de materiales). Ajustar el tamaño de la stick de hisopo cortando con unas tijeras limpias para permitir el cierre del tubo con mínima contaminación. Añadir 250 μL de solución de extracción para cada tubo de la colección que contiene el hisopo fecal y vortex para mezclar.
  3. Calentar las muestras durante 10 min en un baño de agua hirviendo (95 – 100° C). Añadir 250 μL de solución de dilución para cada muestra y agitar para mezclar.
  4. Almacenar los tubos de 2 mL que contiene el ADN extraído y el hisopo a 4 ° C.

3. PCR y preparación de la biblioteca

Para los pasos 3.1 y 3.2, ambiente de trabajo en una estación de trabajo PCR que proporciona limpio, plantilla y productos gratis.

  1. Los iniciadores (tabla 1) según su código de barras de la etiqueta. Diluir cada cartilla en agua bidestilada (DDW) a una concentración μM 50 y almacenar a-20 ° C.
  2. Utilice una placa de 96 pocillos para reacciones de PCR. Cada placa puede contener 32 muestras diferentes, que son etiquetadas por 32 iniciadores de índice diferentes. Descongelar la cartilla hacia adelante y los cebadores inversos 32 a temperatura ambiente y diluir a 5 μM.
  3. Preparar mezclas de reacción de PCR para 100 reacciones (volumen final en cada pozo será 20 μl) mediante la mezcla de 100 μL del primer avance de 5 μM, 1 mL 2 X PCR Master mix y 400 μL DDW. Poner 15 μL de esta mezcla PCR en cada pozo (un total de 96 pocillos). Añadir 1 μL de cada cebador indexadas inversa 5 μM a 3 diferentes pozos (32 diferentes cartillas en triplicado da un total de 96 pocillos).
  4. En una zona dedicada a pre-PCR, lo que significa un banco limpio de la plantilla y productos gratis, añadir 4 μL de cada muestra de ADN extraída a las mezclas de reacción (cada muestra de ADN extraída se amplifica por triplicado — 32 muestras por placa de 96 pocillos).
  5. Ejecutar la polimerización en cadena con los siguientes ajustes: desnaturalización inicial de 94 ° C por 3 min; seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94 ° C por 1 min, recocido a 55 ° C por 1 min y extensión a 72 ° C por 1 min; y una extensión final a 72 ° C durante 10 minutos.
  6. En un banco diferente, que se define como una zona dedicada a post-PCR, combinar cada reacción de PCR por triplicado en un tubo de volumen (60 μL por muestra).
  7. Para evaluar la calidad de los amplicones de PCR, ejecute 4 μL de cada reacción de PCR combinada en un gel de agarosa al 1% teñidos de bromuro de etidio. Bajo longitud de onda de UV de 260 nm, los amplicones positivo aparecerá en un tamaño de banda esperado de 375-425 bp. Sólo estos amplicones se incluirán en los pasos posteriores.
    Nota: Cada muestra se amplifica en triplicado, significa que cada muestra se amplifica en 3 diferentes reacciones de PCR. No escale.

4. Biblioteca cuantificación y limpieza

  1. Para conseguir una piscina de concentración equimolar de todas las muestras PCR, cuantificar cada amplicón por una doble trenzada DNA (dsDNA cuantificar reactivo) de la mancha fluorescente ácidos nucleicos (véase Tabla de materiales), adecuado para la cuantificación simultánea de un gran cantidad de muestras.
    Nota: Dado que el rango de tamaño de los amplicones es equívoco, la cantidad real en nanogramos se utiliza para cargar una concentración equimolar.
  2. Combinar 500 ng de cada muestra en un tubo único, estéril. Vortex para mezclar.
  3. Ejecutar 200 μL de la biblioteca agrupada en un gel de agarosa 1% teñido de bromuro de etidio. Extracto de las bandas de 375-425 bp del gel utilizando un kit de extracción de gel según las instrucciones del fabricante (véase Tabla de materiales) y eluir la biblioteca agrupada en 80 μL DDW.
    Nota: La biblioteca combinada debe ser el tamaño seleccionado para reducir productos de amplificación no específica de anfitrión DNA.
  4. Medir la concentración de final de la biblioteca utilizando un dsDNA altamente sensible detectar kit según las instrucciones del fabricante (véase Tabla de materiales). Medir el tamaño exacto de la biblioteca con el equipo de separación y análisis muy sensible para las bibliotecas de DNA según las instrucciones del fabricante (véase Tabla de materiales).

5. la secuencia

  1. Diluir la biblioteca combinada de 19:00 con la adición de biblioteca de control de 20% (véase Tabla de materiales), según el protocolo de la máquina de la secuencia.
  2. Para la secuencia, diseñada personalizado de uso Lee cartillas que son complementarios a los cebadores de amplificación V4 (véase tabla 1).
  3. Cartilla de la secuencia diseñada personalizada uso un tercero que lee el código de barras en un ciclo (véase tabla 1) y genera lecturas de extremo apareado de 175 bases de longitud en cada dirección, según las especificaciones del fabricante.
  4. Funcionar la máquina de secuenciación y obtener archivos FASTQ según protocolo del fabricante.

6. procesamiento de datos

  1. Unir y procesar los archivos FASTQ extremo apareado superpuestos en una tubería de conservación de datos implementado en 2 QIIME versión 2017.7.017. Demultiplexar las lecturas según muestra determinados códigos de barras.
  2. Utilice DADA218 para la detección de variante (SVs) de control de calidad y secuencia. Truncar lee en 13 bases del extremo 3' y 15 bases desde el extremo 5', descarte Lee con más de 2 errores esperados. Identificar y eliminar las quimeras usando el método de consenso — quimeras son detectadas en las muestras individualmente, y se eliminan secuencias encuentran quiméricas en una fracción suficiente de muestras.
  3. Realizar la clasificación taxonómica de la SVs mediante un clasificador Naive Bayes equipado, entrenado en agosto de 2013 99% identidad Greengenes base de datos6, para 175 largo Lee y la cartilla de reversa/sistema.
  4. Espiritualizado todas las muestras a profundidad de 2.146 secuencias.
  5. Use Unweighted UniFrac para la medición de la β-diversidad (entre muestra diversidad19,20) en las muestras enrarecidas, para evitar un efecto de tamaño de muestra.
  6. Utilizar la matriz resultante de la distancia para realizar un análisis de coordenadas principales (PCoA).
    Nota: Los archivos de script y mapeo de proceso de datos se suministran como material complementario (Material complementario 1 y 2).

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Resultados

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Figura 1muestra una ilustración esquemática del protocolo.

Forma prospectiva hemos recogido muestras de heces de pacientes hospitalizados con diarrea infecciosa sospechada. Las muestras fueron sometidas al laboratorio de microbiología clínica en el Sheba Medical Center entre febrero y mayo de 2015, como fue descrito previamente1. Muestras de heces fueron sometidas a cultivo m...

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Discusión

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16S rRNA-amplicones y metagenómica escopeta secuenciación han ganado popularidad en microbiología clínica aplicaciones21,22,23. Estas técnicas son ventajosas en su mayor capacidad para capturar taxa cultivables y no cultivables, proporcionando datos sobre la abundancia relativa de inóculo patógeno y su capacidad para identificar más precisamente un polimicrobial infecciosa 24de la huella digital. Los avances en el campo de la investigación...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado en parte por el programa I-CORE (convocatoria nº 41/11), el Israel Science Foundation (grant no. 908/15) y la Europea de Crohn y Colitis organización (ECCO).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
PrimersIntegrated DNA Technologies (IDT)
Solución de extracciónSigma-AldrichE7526
Solución de diluciónSigma-AldrichD5688
Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR KitKAPABIOSYSTEMSKK2601PCR Mezcla maestra
Quant-iT PicoGreen dsDNA Kit de reactivosInvitrogenP7589dsDNA cuantificar reactivo
MinElute kit de extracción de gelQiagen28606
AgarosaAmresco0710-250G
Agua ultrapura libre de dnasa y rnasaIndustrias Biológicas01-866-1A
Qubit dsDNA HS kit de ensayoSondas molecularesQ32854dsDNA kit de detección de ADNd
Alta sensibilidad D1000Agilent TechnologiesCinta de cribado 5067-5582Separación y análisis
Ensayo de cinta de cribadoReactivos 5067-5583Agilent Technologiespara bibliotecas de ADN
PhiX Control v3Illumina15017666biblioteca de control
MiSeq Reactive Kit v2 (500 ciclos)IlluminaMS-102-2003
Bromuro de etidioAmrescoE406-10mL-TAM
Colección de 2 mL tubos SARSTEDT72.695.400Tubos de recolección Safe Seal
Hisopo de plástico en tubo de ensayode PP INTERIOR ESTÉRIL23117
NameCompanyNúmero de catálogo>Comentarios
>Equipo
Máquina de PCRaplicada Biosystems2720 Termociclador
SecuenciadoraIlluminaMiseq
Estación de trabajo de PCRBiosanLimpiador
tijeras
vortexerScientific IndustriesVortex-Genie 2
de UV

Referencias

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  1. Braun, T., et al. Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis. Scientific Reports. 7, 1088(2017).
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