Cuantificación absoluta de Plasma niveles de microARN en monos cangrejeros, mediante transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR

Takuma Iguchi; Noriyo Niino; Satoshi Tamai; Ken Sakurai; Kazuhiko Mori

doi:10.3791/56850

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Artículo de método

Cuantificación absoluta de Plasma niveles de microARN en monos cangrejeros, mediante transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR

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DOI:

10.3791/56850

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12 de febrero de 2018

Takuma Iguchi¹ , Noriyo Niino¹ , Satoshi Tamai¹ , Ken Sakurai¹ , Kazuhiko Mori¹

¹Medicinal Safety Research Laboratories, Daiichi Sankyo Co., Ltd.

En este artículo

Resumen

Este informe describe un protocolo para la medición de los niveles absolutos de miRNA plasma, mediante la transcripción reversa en tiempo real cuantitativa PCR con o sin la amplificación. Este protocolo permite la mejor comprensión de la cantidad de plasma miRNAs y permite la evaluación cualitativa de los correspondientes datos de diferentes estudios o laboratorios.

Resumen

RT-qPCR es uno de los métodos más comunes para evaluar objetivo individual miRNAs. Generalmente se miden los niveles de MiRNAs en relación con una muestra de referencia. Este enfoque es apropiado para examinar los cambios fisiológicos en los niveles de expresión de genes objetivo. Sin embargo, cuantificación absoluta usando mejor el análisis estadístico es preferible para una evaluación integral de los niveles de expresión génica. Cuantificación absoluta está todavía no de uso común. Este informe describe un protocolo para la medición de los niveles absolutos de plasma miRNA, usando RT-qPCR con o sin la amplificación.

Se preparó un volumen fijo (200 μL) de EDTA-plasma de la sangre de la vena femoral de monos cangrejeros consciente (n = 50). ARN total fue extraído usando sistema comercialmente disponible. MiRNAs de plasma fueron cuantificados por análisis de RT-qPCR basada en sondeos que contiene la sonda y miRNA-específico-reversa PCR primer. Curvas estándar para cuantificación absoluta se generaron usando oligonucleótidos sintéticos disponibles en el mercado del RNA. Un sintético cel-miR-238 fue utilizado como un control externo para la evaluación de normalización y calidad. Los miRNAs que mostró cuantificación ciclo (Cq) valores por encima de 35 se pre amplificados antes el paso de la qPCR.

Entre los 8 miRNAs examinados, miR-122, miR-133a y miR-192 eran detectables sin la amplificación, mientras que 499a miR, miR-1 y miR-206 requieren la amplificación debido a sus niveles de baja expresión. MiR-208a y 208b miR no eran perceptibles aún después de la amplificación. Eficacia de la muestra fue evaluada por los valores de Cq de la cel-miR-238 con picos. En este método de ensayo, variación técnica era estimada para ser menos 3-fold y el límite inferior de cuantificación (LLOQ) 10² copia/μl, para la mayoría de los miRNAs examinados.

Este protocolo proporciona una mejor estimación de la cantidad de plasma miRNAs y permite la evaluación de la calidad de los correspondientes datos de diferentes estudios. Teniendo en cuenta que el bajo número de miRNAs en los fluidos corporales, la amplificación es útil para mejorar la detección de mal expresado miRNAs.

Introducción

Un creciente número de estudios ha sido explorar microRNAs (miRNAs) como biomarcadores para el diagnóstico y pronóstico de los cánceres, o supervisión y detección de otras enfermedades en estudios clínicos y no clínicos¹^,²^,³. Cuantitativa en tiempo real transcripción reversa PCR (RT-qPCR) es uno de los métodos más comunes utilizados para evaluar miRNAs del destino individual, porque esta técnica es más sensible de microarray⁴ y la secuencia de RNA a partir de plataformas⁵. En general, expresión de miRNA se mide en relación con ....