Un Western Blot protocolo para una pequeña cantidad de células madre hematopoyéticas

Resumen

Un estándar de Western Blot protocolo fue optimizado para el análisis de tan sólo 500 madre hematopoyética o células progenitoras. Optimización implica la cuidadosa manipulación de la muestra de células, limitando las transferencias entre los tubos y directamente lisis de las células en Tampón Laemmli.

Resumen

Las células madre hematopoyéticas (HSCs) son las células raras, con la médula ósea de ratón con sólo 25.000 ~ fenotípica largo plazo HSCs repoblamiento. Un Western Blot protocolo fue optimizado y adecuado para el análisis de una pequeña cantidad de HSCs (células 500-15.000). HSCs fenotípicas fueron purificadas, contó con precisión y lisis directamente en Tampón Laemmli. Lisados que contiene igual número de células se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE), y lo blot fue preparado y procesadas siguiendo el estándar de Western Blot protocolos. Mediante este protocolo, 2.000-5.000 HSCs pueden analizarse de forma rutinaria, y en algunos casos pueden obtenerse datos de tan sólo 500 células, en comparación con las células de 20.000 a 40.000 registradas en la mayoría de las publicaciones. Este protocolo debe aplicarse generalmente a otras células hematopoyéticas y permite el análisis de rutina de un pequeño número de células utilizando procedimientos estándar del laboratorio.

Introducción

Las células madre hematopoyéticas (HSCs) son células renueva a sí misma que pueden dar lugar a todos los linajes de sangre. Son células relativamente raras en la médula ósea, haciendo difícil los análisis bioquímicos. Enfoques adecuados para el análisis de células, como la citometría de flujo, han sido extremadamente útiles para cuantificar cantidades relativas de los marcadores de superficie celular y proteínas intracelulares. Sin embargo, el análisis de proteínas intracelulares requiere la utilización de procedimientos de permeabilización celular para permitir el acceso del anticuerpo, y no todos celular epitopos superficiales sobreviven estos procedimientos

Protocolo

Todos los procedimientos deberán realizarse con arreglo institucional uso de animales y su cuidado. El procedimiento fue desarrollado para el análisis de murino madre y progenitoras células hematopoyéticas (HSCs y HPs), pero puede ser adaptado para el análisis de otras poblaciones de la célula.

1. flujo Cytometry aislamiento de HSCs murinas y HPs

1. Cosecha de células de médula ósea murina como se describe en la literatura⁶.
   Nota: En los datos presentados en la figura 1 y figura 2, la médula ósea fue cosechada de ratones C57BL/6J.
2. Realiza....

Resultados

Resultados representativos de 500-2.000 purificada HSCs y HPs se muestran en la figura 1 y figura 2. La señal de β-actina en la figura 1 se puede detectar desde tan sólo 500 HSCs y HPs purificaron de la médula ósea de un ratón. Tenga en cuenta que cargar los lisados en pozos de 1.5 mm produce una señal mucho más fuerte de 500 HPs que carga en pocillos de 3,0 mm. Figura 2.......

Discusión

Western Blot es una técnica común para la detección de proteínas específicas y la activación de vías de señalización en los tejidos o células. Mediante la introducción de pequeños ajustes a un procedimiento de uso general, hemos sido capaces de detectar rutinariamente 15 diversas proteínas (Tabla de materiales) en 15.000 HSCs y en algunos casos en tan solo 500 HSCs. The Most pasos críticos en este protocolo son: 1) exactamente contando las células 2) reduciendo al mínimo el número de transferencias entre.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
dodecil sulfato de sodio (SDS)	Fisher Scientific	BP166-500	SDS-PAGE
TEMED	Fisher Scientific	BP150-20	SDS-PAGE
30% Acrylamidel Bis solution	Bio-Rad	1610158	SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8	TEKNOVA	T1588	SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8	TEKNOVA	T1068	SDS-PAGE
Persulfato de amonio	Fisher Scientific	BP179-25	SDS-PAGE
mini-protean 3 peines	Bio-Rad	1653360	SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	1658005EDU	SDS-PAGE
Sistema de transferencia	Bio-Rad	1704155EDU
Transferencia PowerPac HC Fuente de alimentación	Bio-Rad	1645052EDU	electroforesis
sistema de imagen	Bio-Rad	1708195	detección de señales
4x Tampón de muestras Laemmli	Bio-Rad	1610747EDU	preparación de muestras
10x Tampón de electroforesis Tris/Glicina/SDS	Bio-Rad	1610732EDU	electroforesis
2-Mercaptoetanol	Bio-Rad	1610710EDU	Preparación de muestras
RTA Mini PVDF Kit de transferencia, para 40 Transferencia	de 1704272 Bio-Rad
Inhibidor de la proteasa Cóctel	Sigma	11697498001	preparación de muestras
Inhibidor de la fosfatasa Cócteles	Biotechnology	GB-450-1 Preparación de	muestras
EIF4G	Señalización celular	2469	WB anticuerpo, validado en 1000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): Fig2
Señalización celular p-Rps6		4858	WB anticuerpo, validado en 1000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): Fig2
actina (HRP conjugado)	abcam	ab49900	WB anticuerpo, validado en 500 células concentración de anticuerpos: 1:5000 referencia (figura): Fig1, Fig2
LC-3	Abcam	ab48394	Anticuerpo WB, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (Fig5)
S6	Señalización celular	2317	anticuerpo WB, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (Fig4)
4EBP1	Cell Signaling	9644	anticuerpo WB, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (Fig4)
p-4EBP1	Cell Signaling	2855	WB anticuerpo, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (Fig4)
TSC2	Cell Signaling	4308	WB anticuerpo, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (Fig4)
HSP90	Cell Signaling	4877	anticuerpo WB, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (Fig5)
PTEN	Cell Signaling	9188	WB anticuerpo, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (FigS1)
Señalización celular mTOR		2983	Anticuerpo WB, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (FigS1)
p-mTOR	Cell Signaling	5536	anticuerpo WB, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (FigS1)
PP2AB	Cell Signaling	4953	WB anticuerpo, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (FigS1)
p-AMPKa	Cell Signaling	2535	WB anticuerpo, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (FigS1)
actina	Santa Cruz	sc-47778	WB anticuerpo, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:3000 referencia (figura): ref5 (Fig4)
kit de depleción de linaje (ratón)	Miltenyi Biotec	130-090-858	purificación de células madre y progenitoras hematopoyéticas
Columnas LS	Miltenyi Biotec	130-041-305	purificación de células madre y progenitoras hematopoyéticas
SCF	PeproTech	250-03 estimulación de	la fosforilación
APC-Cy7 c-kit anticuerpo	ThermoFisher	A15423	clasificación celular
anti-B220	ThermoFisher	48-0452-82	clasificación de celdas
anti-CD3e	ThermoFisher	48-0031-82	clasificación de celdas
anti-Mac1	ThermoFisher	48-0112-82	clasificación de celdas
anti-Gr1	ThermoFisher	48-5931-82	clasificación de celdas
anti-Ter119	ThermoFisher	48-5921-82	celdas
Placas espaciadoras con 1,0 mm integradas Espaciadores	Bio-Rad	1653311	SDS-PAGE
BSA	Research Products International	A30075	bloqueador de membrana
	Atlanta Biologicals	A12450	suplemento medio
contador de células	Invitrogen
AMQAF1000 hemocitómetro	ThermoFisher	S17040	conteo de células
	Denville Scientific	E3012	detección de señal
procesador de película médica	Konica	SRC-101A	Detección de señal
Supersignal West Femto Sustrato de máxima sensibilidad Therom	Scientific	34096
Detección de señal Allegra X-15R (rotor SX4750A)	Beckman Coulter	X-15R	muestra preparación
BLUEstain escalera de proteínas	Biotechnology	P007-500	electroforesis
clasificador de células	BD	FACSAria II	preparación de muestras
Incublock	Denville Scientific	I0510	electroforesis

Gold clasificación de suero de recuento celular flim de Gold