Un Western Blot protocolo para una pequeña cantidad de células madre hematopoyéticas

Resumen

Un estándar de Western Blot protocolo fue optimizado para el análisis de tan sólo 500 madre hematopoyética o células progenitoras. Optimización implica la cuidadosa manipulación de la muestra de células, limitando las transferencias entre los tubos y directamente lisis de las células en Tampón Laemmli.

Resumen

Las células madre hematopoyéticas (HSCs) son las células raras, con la médula ósea de ratón con sólo 25.000 ~ fenotípica largo plazo HSCs repoblamiento. Un Western Blot protocolo fue optimizado y adecuado para el análisis de una pequeña cantidad de HSCs (células 500-15.000). HSCs fenotípicas fueron purificadas, contó con precisión y lisis directamente en Tampón Laemmli. Lisados que contiene igual número de células se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE), y lo blot fue preparado y procesadas siguiendo el estándar de Western Blot protocolos. Mediante este protocolo, 2.000-5.000 HSCs pueden analizarse de forma rutinaria, y en algunos casos pueden obtenerse datos de tan sólo 500 células, en comparación con las células de 20.000 a 40.000 registradas en la mayoría de las publicaciones. Este protocolo debe aplicarse generalmente a otras células hematopoyéticas y permite el análisis de rutina de un pequeño número de células utilizando procedimientos estándar del laboratorio.

Introducción

Las células madre hematopoyéticas (HSCs) son células renueva a sí misma que pueden dar lugar a todos los linajes de sangre. Son células relativamente raras en la médula ósea, haciendo difícil los análisis bioquímicos. Enfoques adecuados para el análisis de células, como la citometría de flujo, han sido extremadamente útiles para cuantificar cantidades relativas de los marcadores de superficie celular y proteínas intracelulares. Sin embargo, el análisis de proteínas intracelulares requiere la utilización de procedimientos de permeabilización celular para permitir el acceso del anticuerpo, y no todos celular epitopos superficiales sobreviven estos procedimientos^1,2. Además, anticuerpos que discriminan entre productos de diferentes proteínas isoformas o hendidura a menudo no están disponibles para citometría de flujo, y por lo tanto, los investigadores todavía dependen de Western blot para ciertos tipos de análisis.

Mancha blanca /negra occidental análisis de lysates de la célula es un procedimiento rutinario en la mayoría de los laboratorios. Las células se pueden purificar en condiciones nativas que conservan los epitopos de moléculas de superficie celular, y lysates de la célula puede preparado y analizado posteriormente. Sin embargo, el análisis de proteínas en célula de primaria rara poblaciones por Western blot puede requerir euthanizing grandes cantidades de animales para obtener suficientes células. Haciendo pequeños ajustes en varios pasos, un protocolo Blot Western convencional fue capaz de detectar proteínas en un número relativamente pequeño de HSCs (500-15.000, dependiendo de la proteína de interés). Los ajustes incluyen exactamente contando las células, manipular cuidadosamente el sedimento celular, reducir las transferencias de células entre tubos para minimizar la pérdida de la célula, y lisis de un número determinado de células con una carga concentrada tampón que contiene proteasoma y inhibidores de la fosfatasa. Muchos informes publicados incluyen manchas blancas /negras occidentales obtenidas con 20.000 o más HSCs^3,4,5,6,7; Este sencillo procedimiento reducirá el número de células y animales de experimentación necesarios para producir datos equivalentes por entre 4 y 40 veces. El protocolo está diseñado para normalizar los resultados en una base por células, en lugar de un control interno. Esto permite la detección de la reducción general en los niveles de proteína que pueden pasarse por alto si los datos se normalizan a un control interno. La importancia de la normalización de una base por celular fue descrita para el análisis de de datos de expresión génica⁸, y el mismo principio se aplica a la cuantificación de proteínas por Western blot. Este protocolo optimizado debe ser útil para cualquier persona que necesite analizar una pequeña cantidad de células.

Protocolo

Todos los procedimientos deberán realizarse con arreglo institucional uso de animales y su cuidado. El procedimiento fue desarrollado para el análisis de murino madre y progenitoras células hematopoyéticas (HSCs y HPs), pero puede ser adaptado para el análisis de otras poblaciones de la célula.

1. flujo Cytometry aislamiento de HSCs murinas y HPs

1. Cosecha de células de médula ósea murina como se describe en la literatura⁶.
   Nota: En los datos presentados en la figura 1 y figura 2, la médula ósea fue cosechada de ratones C57BL/6J.
2. Realizar el agotamiento de linaje de células de médula ósea usando un ratón linaje agotamiento kit, siguiendo las instrucciones del fabricante.
3. Incubar las células con anticuerpos contra los marcadores superficiales de la célula de interés descrito⁷. En los experimentos que se muestra en la figura 1 y figura 2, se utilizan anticuerpos para Sca-1, Kit, Flt3 y marcadores de linaje (Lin) Mac1, Gr1, CD3e, B220 y Ter119.
4. Ordenar 2.000-20.000 Sca1 de Lin^{– +}Kit⁺ Flt3 células^– (HSCs) o Lin^–Sca1^–células del Kit⁺ (HPs) en tubos Eppendorf de 1.5 mL que contiene 0, 1 mL de fosfato tampón salino (PBS) con 2% fetal bovino suero (FBS).
   Nota: Los datos que se muestra en la figura 1 y figura 2, las células fueron clasificadas usando un citómetro de flujo con una boquilla de 70 μm. El volumen de la colección máxima es de 1,4 mL.

2. preparación de la muestra

Nota: Este paso es vital. Procesar la muestra con mucho cuidado. Al retirar el sobrenadante, ser muy cuidado de no perturbar el sedimento celulares.

1. Tubos de centrífuga 1,5 mL que contiene las células ordenadas en un rotor que hace pivotar del cubo a 4 ° C, 500 x g, durante 5 minutos quitar todos sino aproximadamente 100 μl del sobrenadante de la celda de pellets muy suavemente con una pipeta y una punta de pipetear 20 μl. No molestes a la pelotilla.
   1. Si la muestra contiene menos de 5.000 células, y el volumen total de la muestra seleccionada es inferior a 0,2 mL, transferir las células primero a tubos PCR de 0.2 mL baja obligatoria antes de la centrifugación.
   2. Si la muestra contiene menos de 5.000 células y volumen es más de 0,2 mL, desactivación de las células con una centrifugadora a 4 ° C, 500 x g, 5 min y eliminar casi 200 μL del sobrenadante. Resuspenda las células sedimentadas en los restantes 200 μL de sobrenadante, luego transferir las células a los tubos PCR de 0.2 mL y girar hacia abajo otra vez. Quitar todos sino 20-30 μL pellets después de la segunda vuelta y resuspender las células.
2. Resuspender las células en la izquierda sobrenadante en el tubo. Si es necesario, añadir PBS adicional en 2% FBS/PBS (también se puede usar 2% albúmina de suero bovino (BSA) / PBS, o solo PBS) para obtener una concentración de 5 x10⁴ a 5 x 10⁵ células/mL.
   Nota: El recuento de uso recopilados por citometría para estimar el volumen utilizado para suspender las células.
3. Utilice 2-5 μl de las células suspendidas de nuevo para determinar una concentración exacta de la célula usando un contador de células automatizado (siguiendo las instrucciones del fabricante) o un hemocitómetro⁹.
4. Transferir un volumen de células suspendidas de nuevo que contiene el número deseado de células a nuevos tubos de 1,5 mL. Para el experimento en la figura 1, se transfirieron 500, 1.000 o 2.000 HSCs o HPs. El número de las células depende de la fuerza de la señal obtenida mediante Western blot y se determina empíricamente. Realizar a la transferencia utilizando una 20 μl o punta de pipeta de Eppendorf de 100 μl.
5. Centrifugar las células en un rotor oscilante de cubo a 4 ° C, 500 x g, durante 5 minutos.
6. Para generar 100 x soluciones, disolver inhibidores de proteasoma y fosfatasa en DMSO según las instrucciones del fabricante.
7. Preparar 2 x Laemmli tampón diluyendo el 4 x Laemmli Solución tampón de muestras proporcionadas por el fabricante con una cantidad equivalente de agua destilada. Agregar una cantidad apropiada de la población 100 x de inhibidores de la proteasoma y fosfatasa para obtener una concentración final de 2 inhibidores de la x en tampón x Laemmli 2.
   Nota: El tampón de muestra de 2 x Laemmli se puede hacer con antelación, pero los inhibidores de la proteasoma y fosfatasa se deben agregar inmediatamente antes de agregar los 2 x Laemmli el tampón de muestra (más inhibidores) para el precipitado de células para lyse las células, como se describe en el siguiente paso.
8. Quitar una parte del sobrenadante de la pelotilla de la célula y el sobrenadante restante en el tubo con el precipitado de células con cuidado, añadir un volumen igual de 2 x Laemmli tampón más inhibidores de la proteasoma y fosfatasa para alcanzar una concentración final de 500 células/μl en 1 x Laemmli Solución tampón de muestra.
   Nota: por ejemplo, si transfiere 2.000 células en un volumen total de 20 μl a un tubo de paso 2.5, después de centrifugar células (paso 2.6) debe eliminar 18 μL del sobrenadante de la pelotilla y 2 μl de sobrenadante que queda añadir un volumen igual (2 μL) de 2 x Laemmli sample buffer alcanzar una concentración final de 500 células/μl en 1 x Laemmli Solución tampón de muestra.
9. Resuspender el precipitado para generar el lisado tan pronto como sea posible. En este punto, las muestras pueden ser inmediatamente electrophoresed mediante geles SDS-PAGE, o se puede complemento congelado en líquido N₂ y almacenado a-80 ° C para su uso futuro.

3. electroforesis

1. Calor de los lisados en un bloque térmico a 95 ° C o en agua hirviendo durante 5 minutos.
2. Electrophorese μL 1-40 de los lisados (contiene desde 500 hasta 20.000 equivalentes de la célula) a través de geles de SDS-PAGE a 100V utilizando protocolos estándar¹⁰.
   Nota: El volumen de lisado cargada en el gel es determinado por el número de células necesario para generar la señal deseable y dependerá de la abundancia de la proteína de interés y la calidad del anticuerpo. Los datos en la figura 1 se obtuvieron con 2.000, 1.000 y 500 celular equivalente al lisado. La anchura del pozo debe en el rango de 3 mm a 1,5 mm. 1,5 mm dientes pueden cortar de un peine disponible en el mercado con más dientes con unas tijeras.

4. transferencia y bloquear

Nota: Realizar un Western blot siguiendo protocolos estándar¹¹. Brevemente se describen aquí los pasos:

1. Use del polivinilideno (PVDF) de difluoruro membrana con metanol para 10 s, después lavar la membrana brevemente con agua destilada.
2. Transferencia de la proteína del gel de SDS-PAGE a la membrana siguiendo las instrucciones en el manual suministrado por el fabricante de los aparatos de transferencia.
3. Después de transferencia, bloquear la membrana con 2 mL de 5% albúmina sérica bovina (BSA) en SAFT (PBS con un 0.1% Tween) durante la noche a 4 ° C siguiendo protocolos estándar¹¹.

5. anticuerpo etiquetado

1. Incubar la membrana con anticuerpos en un agitador durante la noche a 4 ° C utilizando diluciones de anticuerpo recomendadas por el proveedor.
   Nota: Anticuerpos, los cuales hemos validado HSCs, HPs y las diluciones de anticuerpo correspondiente, se muestran en la tabla de materiales. Realizar el anticuerpo etiquetado utilizando procedimientos estándar⁸.

6. detección de

1. Lavar la membrana 3 veces, 5 minutos para cada colada en SAFT a temperatura ambiente.
2. Incubar la membrana con 2 mL de tampón de quimioluminescencia realzada durante 1 min a temperatura ambiente. Detectar las señales usando un sistema de imágenes siguiendo las instrucciones, o película de autorradiografía y procesador de la película.

Resultados

Resultados representativos de 500-2.000 purificada HSCs y HPs se muestran en la figura 1 y figura 2. La señal de β-actina en la figura 1 se puede detectar desde tan sólo 500 HSCs y HPs purificaron de la médula ósea de un ratón. Tenga en cuenta que cargar los lisados en pozos de 1.5 mm produce una señal mucho más fuerte de 500 HPs que carga en pocillos de 3,0 mm. Figura 2...

Discusión

Western Blot es una técnica común para la detección de proteínas específicas y la activación de vías de señalización en los tejidos o células. Mediante la introducción de pequeños ajustes a un procedimiento de uso general, hemos sido capaces de detectar rutinariamente 15 diversas proteínas (Tabla de materiales) en 15.000 HSCs y en algunos casos en tan solo 500 HSCs. The Most pasos críticos en este protocolo son: 1) exactamente contando las células 2) reduciendo al mínimo el número de transferencias entre...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
dodecil sulfato de sodio (SDS)	Fisher Scientific	BP166-500	SDS-PAGE
TEMED	Fisher Scientific	BP150-20	SDS-PAGE
30% Acrylamidel Bis solution	Bio-Rad	1610158	SDS-PAGE
1.5M Tris-HCl pH8.8	TEKNOVA	T1588	SDS-PAGE
1.0M Tris-HCl pH6.8	TEKNOVA	T1068	SDS-PAGE
Persulfato de amonio	Fisher Scientific	BP179-25	SDS-PAGE
mini-protean 3 peines	Bio-Rad	1653360	SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra Cell	Bio-Rad	1658005EDU	SDS-PAGE
Sistema de transferencia	Bio-Rad	1704155EDU
Transferencia PowerPac HC Fuente de alimentación	Bio-Rad	1645052EDU	electroforesis
sistema de imagen	Bio-Rad	1708195	detección de señales
4x Tampón de muestras Laemmli	Bio-Rad	1610747EDU	preparación de muestras
10x Tampón de electroforesis Tris/Glicina/SDS	Bio-Rad	1610732EDU	electroforesis
2-Mercaptoetanol	Bio-Rad	1610710EDU	Preparación de muestras
RTA Mini PVDF Kit de transferencia, para 40 Transferencia	de 1704272 Bio-Rad
Inhibidor de la proteasa Cóctel	Sigma	11697498001	preparación de muestras
Inhibidor de la fosfatasa Cócteles	Biotechnology	GB-450-1 Preparación de	muestras
EIF4G	Señalización celular	2469	WB anticuerpo, validado en 1000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): Fig2
Señalización celular p-Rps6		4858	WB anticuerpo, validado en 1000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): Fig2
actina (HRP conjugado)	abcam	ab49900	WB anticuerpo, validado en 500 células concentración de anticuerpos: 1:5000 referencia (figura): Fig1, Fig2
LC-3	Abcam	ab48394	Anticuerpo WB, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (Fig5)
S6	Señalización celular	2317	anticuerpo WB, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (Fig4)
4EBP1	Cell Signaling	9644	anticuerpo WB, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (Fig4)
p-4EBP1	Cell Signaling	2855	WB anticuerpo, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (Fig4)
TSC2	Cell Signaling	4308	WB anticuerpo, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (Fig4)
HSP90	Cell Signaling	4877	anticuerpo WB, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (Fig5)
PTEN	Cell Signaling	9188	WB anticuerpo, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (FigS1)
Señalización celular mTOR		2983	Anticuerpo WB, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (FigS1)
p-mTOR	Cell Signaling	5536	anticuerpo WB, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (FigS1)
PP2AB	Cell Signaling	4953	WB anticuerpo, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (FigS1)
p-AMPKa	Cell Signaling	2535	WB anticuerpo, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:1000 referencia (figura): ref5 (FigS1)
actina	Santa Cruz	sc-47778	WB anticuerpo, validado en 15000 células concentración de anticuerpos: 1:3000 referencia (figura): ref5 (Fig4)
kit de depleción de linaje (ratón)	Miltenyi Biotec	130-090-858	purificación de células madre y progenitoras hematopoyéticas
Columnas LS	Miltenyi Biotec	130-041-305	purificación de células madre y progenitoras hematopoyéticas
SCF	PeproTech	250-03 estimulación de	la fosforilación
APC-Cy7 c-kit anticuerpo	ThermoFisher	A15423	clasificación celular
anti-B220	ThermoFisher	48-0452-82	clasificación de celdas
anti-CD3e	ThermoFisher	48-0031-82	clasificación de celdas
anti-Mac1	ThermoFisher	48-0112-82	clasificación de celdas
anti-Gr1	ThermoFisher	48-5931-82	clasificación de celdas
anti-Ter119	ThermoFisher	48-5921-82	celdas
Placas espaciadoras con 1,0 mm integradas Espaciadores	Bio-Rad	1653311	SDS-PAGE
BSA	Research Products International	A30075	bloqueador de membrana
	Atlanta Biologicals	A12450	suplemento medio
contador de células	Invitrogen
AMQAF1000 hemocitómetro	ThermoFisher	S17040	conteo de células
	Denville Scientific	E3012	detección de señal
procesador de película médica	Konica	SRC-101A	Detección de señal
Supersignal West Femto Sustrato de máxima sensibilidad Therom	Scientific	34096
Detección de señal Allegra X-15R (rotor SX4750A)	Beckman Coulter	X-15R	muestra preparación
BLUEstain escalera de proteínas	Biotechnology	P007-500	electroforesis
clasificador de células	BD	FACSAria II	preparación de muestras
Incublock	Denville Scientific	I0510	electroforesis