Este protocolo describe la fabricación de las superficies de cristal de calidad óptica adsorbido con compuestos que contengan hidrocarburos de cadena larga que pueden ser utilizados para controlar la fusión de macrófagos de ejemplares vivos y permite la microscopía de superresolución de muestras fijas .
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Artículo de método
Fabricación de superficies de cristal de calidad óptica para estudiar la fusión de macrófagos
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Resumen
Resumen
Visualizar la formación de células gigantes multinucleadas (MGCs) de ejemplares vivos ha sido un desafío debido a que las técnicas de imagen más vivo requieren de propagación de la luz a través del vidrio, pero en vidrio fusión de macrófagos es un acontecimiento raro. Este protocolo presenta la fabricación de varias superficies de cristal de calidad óptica donde la adsorción de compuestos que contienen hidrocarburos de cadena larga transforma vidrio una superficie fusogénicas. En primer lugar, se describe la preparación de limpieza de superficies de vidrio como material para la modificación superficial de partida. En segundo lugar, un método se proporciona para la adsorción de compuestos que contienen hidrocarburos de cadena larga para convertir no fusogénicas vidrio en un substrato fusogénicas. En tercer lugar, este protocolo describe fabricación de micropatrones superficie que promueven un alto grado de control spatiotemporal sobre formación de MGC. Por último, se describe fabricación de platos de fondo de vidrio. Se muestran ejemplos de uso de este sistema de célula en vitro como un modelo para estudiar la fusión de macrófagos y la formación de MGC.
Introducción
La formación del MGCs acompaña a una serie de estados patológicos en el cuerpo humano caracterizado por inflamación crónica1. A pesar del acuerdo que mononucleated macrófagos se fusionan para formar MGCs2, sorprendentemente pocos estudios han demostrado fusión en contexto con vivas muestras de3,4. Esto es porque las superficies de vidrio limpio que se requieren para la mayoría de técnicas de imagen no favorecer la fusión de macrófagos cuando inducida por citoquinas inflamatorias5. De hecho, si limpio de vidrio se utiliza como sustrato para la fusión de macrófagos, luego baja a los objetivos de aumento intermedio (es decir, 10-20 X) y más de 15 h de continuo la proyección de imagen se requieren a menudo para observar un evento único fusion.
En la otra mano, fusogénicas las superficies de plástico (por ejemplo, permanox) o del plástico del grado bacteriológico promover fusión2. Sin embargo, la proyección de imagen a través del plástico es problemática porque el sustrato es grueso y dispersa la luz. Esto complica la proyección de imagen ya que requiere mucho trabajo objetivos de distancia (LWD). Sin embargo, objetivos LWD suelen tienen poca luz reuniendo capacidad en comparación con sus contrapartes cubreobjetos-corregida. Además, técnicas que aprovechan los cambios en la polaridad de luz que pasa a través de la muestra tales como contraste diferencial de interferencia son imposibles ya que el plástico es birrefringente. Las barreras asociadas al uso del plástico se destacaron aún más por el hecho de que es imposible predecir donde se producirá la formación de macrófagos fusión/MGC en la superficie. En conjunto, estas limitaciones restringen la visualización de la fusión de macrófagos a la óptica de contraste de fase, extendido duraciones imagen total (> 15 horas continuas) y baja resolución.
Recientemente se identificó una superficie altamente fusogénicas vidrio mientras realiza la microscopía de resolución super sola molécula con macrófagos fijos/MGCs4. Esta observación fue sorprendente porque limpiar vidrio superficies favorecer la fusión en la muy baja tasa de ~ 5% después de 24 h en presencia de Interleucina-4 (IL-4) según lo determinado por la fusión índice4. Se encontró que la capacidad de favorecer la fusión fue debido a la contaminación oleamide. Adsorción de oleamide u otros compuestos que igualmente contenían hidrocarburos de cadena larga hecha del vidrio fusogénicas. La mayoría fusogénicas compuesto (parafina) era micropatterned, e imparte un alto grado de control spatiotemporal sobre fusión de macrófagos y un aumento de 2 dobleces en el número de eventos de fusión observados dentro de la misma cantidad de tiempo en comparación con permanox. Estas superficies de calidad óptica proveyeron el primer vistazo a las características morfológicas y cinéticas que rigen la formación de MGCs en ejemplares vivos.
En este protocolo se describe la fabricación de una variedad de superficies de vidrio que pueden usarse para controlar la formación de MGCs de ejemplares vivos. Además, demostramos que estas superficies son susceptibles a las técnicas de resolución súper campo lejano. Fabricación superficial depende de la meta del experimento, y cada superficie se describe con ejemplos relacionados en el texto del procedimiento.
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Protocolo
Procedimientos que utilizan los animales fueron aprobados por los comités de uso en Mayo Clinic, Janelia investigación Campus y Universidad Estatal de Arizona y de cuidado Animal.
1. preparación de ácido limpiar cubierta de vidrio
Nota: adquiridos de muchos fabricantes de vidrio de cubierta puede no ser tan limpia como se esperaba. Examinar rutinariamente limpiar lotes de cristal antes de cualquier procedimiento cuando se trata de la microscopia.
- Compra de vidrio de cubierta de alta rigurosidad. Tenga especial cuidado al elegir el grueso correcto (0,15 ó 0.17 mm).
Nota: La elección del espesor del vidrio depende del objetivo de microscopio y cotiza directamente en el cilindro del objetivo. - Incubar el vidrio de cubierta de 12 M de ácido clorhídrico en una campana de humos químicos bien ventilado durante 1 h con baño de ultrasonidos (42 kHz, 70 W). Repetir esta operación dos veces más con fresco 12 M HCl.
- Llene un recipiente aparte con agua ultrapura y añadir el cubierta de vidrio. Someter a ultrasonidos el vidrio de cubierta de 5-10 min en una campana química bien ventilada. Repita este paso diez veces.
- Incubar el vidrio de cubierta en acetona pura en una campana química bien ventilada durante 30 minutos con la sonicación. Repetir esta operación dos veces más.
- Llene un recipiente aparte con agua ultrapura estéril y añadir el cubierta de vidrio. Someter a ultrasonidos el vidrio de cubierta de 5-10 min en una campana química bien ventilada. Repita este paso diez veces.
- Incubar el vidrio de cubierta en alcohol etílico de 100% en una campana química por 30 min con la sonicación. Repita este paso dos veces más.
Nota: La pureza del alcohol etílico es importante. Contaminantes en forma de sólidos disueltos se secarán sobre el vidrio y pueden favorecer la fusión de macrófagos. - Para el almacenamiento a largo plazo, coloque el cristal ácido limpiar en un recipiente llenado de alcohol etílico puro. Por otra parte, seca el cubierta de vidrio con gas nitrógeno y almacenar en un desecador de vacío.
2. preparación de superficies de calidad óptica fusogénicas
- Disolver DMSO-libre elevado punto de fusión punto de parafina en tolueno ultrapura.
Nota: Las concentraciones de población se hacen en 10 mg/mL y diluido 1:9 en ultrapura tolueno para hacer un 1 mg/mL solución de trabajo.
PRECAUCIÓN: Tolueno debe manipularse con cuidado como un teratógeno. Deseche de acuerdo con el plan de higiene química institucional de tolueno. - Aplicar la parafina trabajo solución a un vidrio de cubierta limpia ácido seco en un volumen que cubre uniformemente la superficie de vidrio. Decantar la solución excedente y seca el vidrio de cubierta con gas de nitrógeno o aire. Para la preparación a granel, utilice una jarra de Coplin para adaptarse al cubierta de vidrio.
- Pulir el vidrio de cubierta por 3 movimientos en el eje x y luego por 3 movimientos en el eje y con una toallita libre de pelusas (véase Tabla de materiales).
- Inmediatamente antes de que se lleva a cabo el experimento, lavar el vidrio de la cubierta con agua ultrapura estéril y posteriormente esterilizar por 15-30 min con luz ultravioleta en una campana de seguridad biológica. Alternativamente, esterilizar el vidrio de cubierta por la irradiación de etileno óxido o gamma.
3. Micropatterning hidrocarburos conteniendo compuestos limitar la fusión a predeterminados regiones
- Seque el cristal ácido limpiar e inmovilizar el vidrio sobre una superficie plana.
- Cuidadosamente con unas pinzas, sumerja una cuadrícula de buscador de microscopia electrónica de transmisión oro en una solución de trabajo de los hidrocarburos, establecidos. Elegir un compuesto de hidrocarburos que cumpla con el objetivo final del experimento (ver tabla 1). Exceso de solución fuera del fieltro golpeando suavemente la cuadrícula en papel de filtro e inmediatamente Coloque la parrilla en el centro del cubierta de vidrio. Permita que el tolueno secar durante 2 minutos antes de proceder al siguiente paso.
- Asegúrese de que la cuadrícula se enlaza al vidrio invirtiendo suavemente el vidrio. Si la rejilla desprende Repita el paso 3.2 usando un nuevo vidrio de cobertura.
Nota: Si no hay un limpiador de plasma, omite el paso 3.4. - Plasma Limpie el vidrio de cubierta por el tratamiento con plasma de vacío.
Nota: La red buscador actúa como una máscara para proteger la superficie subyacente adsorbida con hidrocarburos de cadena larga del plasma. Las regiones que son desprotegidas por la red son prestadas no fusogénicas por exposición al plasma. La cantidad de tiempo que el cristal es expuesto al plasma debe determinarse empíricamente. - Con unas pinzas de punta fina, retire con cuidado la rejilla de la superficie de cristal para exponer la micropattern.
4. fabricación de platos de fondo de vidrio
- Perfore un agujero circular de 6-10 mm en la parte inferior de un plástico de 35 mm placa de Petri con una broca de paso.
Nota: Es fundamental utilizar una broca de paso para crear los bordes lisos. Si los bordes son demasiado ásperos, el cristal no se adherirá plano hasta el fondo del plato. Superficies planas imperfecto dificultan la microscopia. - Mezclar cuidadosamente y desgasifica el elastómero de silicona según las instrucciones del fabricante(es decir, polidimetilsiloxano; PDMS).
- Aplique una fina capa de elastómero a próximas al borde de (es decir, circunscribir) el agujero.
Nota: El elastómero debe aparecer como una banda continua aunque delgada que rodea el agujero. - Aplique suavemente el vidrio de cubierta fusogénica (descrito en la sección 2), o el vidrio de cubierta de limpieza ácido seco (descrito en la sección 1) al plato con el fin de cubrir el agujero rodeado de elastómero. Asegúrese de que el vidrio de la cubierta aparece al ras con la parte inferior del plato y se extiende más allá del diámetro del agujero para que una porción substancial del vidrio está en contacto con el plástico. Curar el elastómero por la hornada a 50 ° C para 2-3 h.
- Si prefiere vidrio fusogénica, UV esterilizar las células de plato y de la cultura según protocolos estándar. Sin embargo, si prefiere un micropattern, proceda al paso 3.2 preparación micropattern (el plasma del gas utilizado durante micropatterning esteriliza el plato y fuertemente parejas PDMS para vidrio).
5. recoger los macrófagos sacados de tioglicolato
- Inyectar ratones C57BL/6 de 8 semanas de edad con 0,5 mL de una solución estéril de tioglicolato de Brewer 4% como se describió anteriormente3,4,6.
- Setenta y dos horas más tarde, eutanasia animal según el cuidado de los animales aprobado utilizar pautas y recoger los macrófagos mediante lavado peritoneal con solución salina tamponada con fosfato helada con 5 mM ethylenediaminetetraacetate.
- Centrifugue los macrófagos a 300 x g durante 3 min y resuspender en 1 mL de DMEM:F12 con 15 mM HEPES, 10% FBS y 1% antibióticos (medio de cultivo).
Nota: Posteriormente se cuentan las células con un hemocitómetro de Neubauer. Los macrófagos son diluidos a la concentración adecuada y aplicados a las superficies. Debe considerarse cuidadosamente el número de células para aplicar a una superficie dada por el investigador con el propósito de la pregunta experimental. Consultar estándares conocidos en la literatura primaria. - Después de 30 minutos lavar las superficies con HBSS con 0.1% de BSA para eliminar las células no adherente y reemplazar con medio de cultivo fresco. Vuelva las culturas a la incubadora (5% CO2 en aire a 37 ° C).
- 2 h más tarde, aspirar el medio y reemplazar con medio de cultivo suplementado con 10 ng/mL de IL-4. Imagen de las células como se describe en otra parte4.
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Resultados
Parámetros fisicoquímicos de los materiales tienen efectos dramáticos en la medida de macrófagos fusión7,8,9,10. Además, contaminantes de la superficie se saben para promover la fusión de macrófagos11. Por lo tanto, es importante comenzar con limpia vidrio de cubierta como un control negativo para la fusión de macrófagos. Cuando limpiarse...
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Discusión
La necesidad de identificar y desarrollar posteriormente las superficies de cristal de calidad óptica que favorecer la fusión de macrófagos derivan del hecho de que hasta hace poco no publicarse directamente visualizada fusión de macrófagos en el contexto de la vida de muestras3, 4. Esto es debido a que fusogénicas superficies plásticas que se utilizan requieren objetivos LWD y son en gran parte limitadas a la óptica de contraste de fase. Estas barreras fueron s...
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.
Agradecimientos
Queremos agradecer a miembros del laboratorio Ugarova y los investigadores en el centro de Biología Vascular y metabólica útil discusión de este trabajo. James Faust desea expresar su agradecimiento a los instructores en el curso de Biología Molecular europeo laboratorio Super resolución microscopia en 2015. Queremos agradecer los Satya Khuon en Janelia para ayuda con la preparación de muestras para LLSM. Durante la revisión y rodajes porciones de este trabajo James Faust fue apoyado por una beca de T32 (5T32DK007569-28). El componente de hoja de luz de celosía de este trabajo fue apoyado por el HHMI y la Betty y Gordon Moore Foundation. T.U. es financiado por los NIH grant HL63199.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Limpiador de plasma | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Rejilla del buscador | Ciencias de la microscopía electrónica | G400F1-Au | cualquier rejilla TEM dorada funcionará |
| Cubierta de vidrio (22x22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use solo vidrio de cubierta de alta rigurosidad |
| Cera de parafina | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Vaselina | Sigma Aldrich | 16415 | debe estar libre de &alfa;-tocoferol si se sustituye |
| Oleamida | Sigma Aldrich | O2136 | preparar |
| fresco Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Tolueno | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetona | VWR International | BDH1101 | |
| Etanol | Ciencias de la microscopía electrónica | 15050 | uso bajo disuelto sólidos etanol |
| Ácido clorhídrico | Fischer Scientific | A144C-212 | uso para lavar con ácido la cubierta de vidrio |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mezclar en una proporción de 1:10 y curar a 50 & grados; C para 4 h |
| placa de Petri de 35 mm | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Pinza Dumont n.º 5 | Microscopía electrónica sciences | 72705 | ideal para eliminar la rejilla TEM en la sección 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contiene 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solución | Sigma Aldrich | A9576 | uso al 0,1% en HBSS para lavar macrófagos no adherentes |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | alícuota a 10 μ g/mL y almacenar a -20 ° C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | uso para muestras fijas o técnicas que no requieren agentes de contraste |
| Ratones eGFP-LifeAct | n/a | n/a | uso para imágenes de fluorescencia en vivo |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | Uso para pulir superficies adsorbidas por hidrocarburos |
Referencias
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